Содержание к диссертации
Введение
1. Методы мтемтического анажза данных по комплексо-образованию жгандов с центрами связывания 7
1.1. Идентификация кинетических моделей 8
а. Графические подходы 12
б. Методы математической статистики 24
в. Методы имитационного моделирования 30
г. Другие подходы 30
1.2. Определение физико-химических параметров комплексо- образования лигандов с центрами связывания по экспериментальным данным 33
а. Графические подходы 34
б. Способы прямого решения системы уравнений, связывающих параметры комплексов с экспериментальными данными 37
в. Статистические методы определения параметров 39
2. Качественный анализ систем с несколькими типами рецепторов 52
2.1. Концепция множественности рецепторов 53
2.2. Использование зависимостей типа доза-ответ для дифференциации рецепторов 54
2.3. Изучение связывания лигандов с биологическими препаратами как способ количественного анализа множественности рецепторов 56
3. Гетерогенность ошатных рецепторов .: 60
3.1. Характеристики различных классов опиатных рецепторов 60
3.2. Модели опиатных рецепторов 67
4. Экспериментальная часть 73
4.1. Исходные вещества 73
4.2. Составы буферных растворов 74
4.3. Составы сцинтилляционных смесей 74
4.4. Посуда и вода 75
4.5. Получение препарата мембран головного мозга крыс 75
4.6. Получение лиофилизованных препаратов мембран головного мозга крыс 76
4.7. Измерение уровня равновесного связывания меченых соединений с препаратами мембран 76
4.8. Изучение кинетики связывания лигандов с рецепторами 77
4.9. Определение концентрации мембраносвязанного белка 79
4.10.Математическая обработка экспериментальных данных 79
5. Применение метода. имитационного моделирования для анализа рецепторных взаимодействий 80
6. Разностный метод анализа жганд-рецепторных взаимодействий 91
7. Доказательство существования супервысокоафжнных центров связывания опиатных лигандов кинетическими методами 101
8. Вжяние температуры на свойства опиатных рецепторов 133
9. Получение и свойства препарата лиошизованных мембран головного мозга 140
Выводы 153
Литература 154
Пишжение 179
- Определение физико-химических параметров комплексо- образования лигандов с центрами связывания по экспериментальным данным
- Использование зависимостей типа доза-ответ для дифференциации рецепторов
- Получение лиофилизованных препаратов мембран головного мозга крыс
- Применение метода. имитационного моделирования для анализа рецепторных взаимодействий
Определение физико-химических параметров комплексо- образования лигандов с центрами связывания по экспериментальным данным
Существуют различные подходы к решению проблемы определения параметров комплексов лигандов с центрами связывания по данньм физико-химического эксперимента. По типу математических приемов их можно разбить на три группы [9]: I) приближенные методы линейной графической экстраполяции или упрощенного аналитического расчета; 2) методы, базирующиеся на точном решении системы уравнений, описывающей процесс; 3) поиск параметров на основе статистического принципа максимального правдоподобия. Любой метод, позволяющий определять кинетические и равновесные константы в некотором интервале температур, может быть использован для определения термодинамических параметров комплексообразования - д( ,&Н ,д5 ,&G , &Н,д 5 . Для решения системы уравнений, описывающих либо кинетику, либо равновесие процесса комплексообразования и восстановления параметров часто используют те или иные преобразования [I, 5,6,9,15,19,20,24,48,50,51,95-973, приближения [1,9] или вводят определенные ограничения на условия проведения эксперимента С1,9].
Это позволяет привести расчетные уравнения к виду, удобному для графического определения искомых параметров. При определении параметров уравнений (4) и (5) широко используют уже упоминавшиеся координаты Скэтчарда, Лайнуивера-Берка, Иди-Хофсти, Вульфа, Хилла, Кяотца и ряд других [1,5,6,9,15,19,20, 24,25,48,50,51]. Так в случае существования в системе одного центра связывания и одного лиганда уравнение (4) можно запи- Тогда, проведя некоторые преобразования, можно получить: для координат Скэтчарда: U тр- f LBl (20) для координат Лайнуивера-Берка: FKn + гт гп (21) для координат Дди-Хофсти: [&J = QJ0 - П(СЄ 1/Ш) (22) для координат Вульфа: = + QJ (23) Таким образом, для уравнения (19) определение параметров (константы диссоциации К и общей концентрации центров 6Л0) сводится к определению тангенса угла наклона и отрезков, отсекаемых на координатных осях (линейные коэффициенты прямой), прямой в любых из предложенных координат. Если система содержит -несколько независимых центров связывания и описывается уравнением (4), то параметры комплексообразования (для случая двух центров) или величины неких соотношений между параметрами (для случая более двух центров) можно определить, зная тангенсы углов наклона и отрезки, отсекаемые на координатных осях линейными продолжениями кривых в используемых координатах. Соотношения между линейными коэффициентами таких продолжений и значениями параметров уравнения (4) выведены и приведены в работе Кпотца [36] для трех типов координат (f/f/J,f/f8J), {U1 ,1П/Ш, (Гв],Ш/г/3). Связь параметров модели с двумя независимыми центрами связывания с линейными коэффициентами асимптот и методы проведения асимптот к кривым в координатах Скэтчарда рассмотрены в работах [1,55]. Для определения параметров связывания при наличии кооперативных взаимодействий в системе (уравнение (о)) часто используют координаты йшла (Iflf/J , а і-свІ/С&І Еі»6]. Методы графического анализа и используемые при этом приближения при исследовании кинетики комплексообразования подробно и четко изложены в работах [1,5,6] и поэтому в данном изложен подробно не рассматриваются.
Использование зависимостей типа доза-ответ для дифференциации рецепторов
При фармакологических исследованиях зависимостей типа доза-ответ измеряется некий физиологический эффект как функция дозы исследуемого соединения СЮ,II,115]. Если справедливы предположения [10,11,119,120]: эффект пропорционален занятости рецептора и максимальный эффект наблюддется при полной занятости рецепторов, то задача становится аналогичной задаче анализа взаимодействий лигандов с центрами связывания (см.гл.1 литературного обзора). Однако большинство фармакологических данных не согласуется с упомянутыми простыми предположениями СЮ,II]. Как правило, функция, связывающая эффект (ответ) и занятость рецептора не известна. В этих случаях необходима специальная постановка эксперимента.
Один из распространенных методов определения констант диссоциации алтагонистов по зависимостям доза-ответ предложен Шилдом [10,11]. Единственным предположением метода является то, что равные эффекты обусловлены одинаковой занятостью рецептора. Согласно Шилду можно записать: где [II- концентрация антагониста, ЕАІ- концентрация агонис-та, дающая такой же эффект, что и концентрация [А 1 в присутствии антагониста Г , рАх определяется как отрицательный десятичный логарифм молярной концентрации антагониста, приводящей к соотношению [А1/[А1-Х. При х=2.
Таким образом, зная величинурА2, легко вычислить значение константы диссоциации антагониста. На практике для определения Kj поступают следующим образом: измеряют отношение т /ш для нескольких концентраций строят график в координатах IpAx fyfeflt проводится прямая линия, отсекающая на оси абсцисс величину рА2. Более подробно анализ кривых по Шилду рассмотрен в работах [10,11]. При исследовании кривых доза-ответ следует иметь в виду, что физиологический ответ, его специфичность может зависеть от целого ряда причин таких, как [16]: доступность соединения к органу - мишени (различные барьеры, метаболитическая трансформация), выводом лиган-да из исследуемо::! системы (захват, ферментативная деградация, обычная химическая деструкция). Неучет указанных причин может приводить к серьезным ошибкам при интерпретации эксперимента. При изучении рецепторов идеальным является объединение исследований in ifct/o и in situ с изучением связывания лигандов in ifitzo,
При изучении связывания лигандов измеряемой величиной служит концентрация комплекса,лиганд-рецептор.-Изучение связывания лигандов, как уже отмечалось, можно проводить in ifiVo и in ifitzo . Анализ связывания in fitfo так же как и анализ кривых доза-ответ сопряжен со сложностями определения степени деградации лиганда, трудностями доступа лиганда к мишени [117, 118]. Кроме того, достаточно трудно при экспериментах in VCVo проверить столь необходимые для последующего анализа предположения о действительном установлении равновесия в системе и о применимости закона действия масс [118]. В этой связи при физико-химическом изучении связывания незаменимым является исследование комплексообразования лигандов с рецепторами in. tiitto . Значительны! прогресс в изучении гетерогенности рецепторов, гормонов и нейротрансмитеров связан с применением меченых лигандов [16,83]. Можно выделить два основных подхода к анализу множественности типов рецепторов, связанных с применением лигандов, содержащих радиоактивные атомы.
Первый подход предполагает использование меченых лигандов, селективно взаимодействующих с рецепторами. Однако на практике обычно не удается получить лиганд со строгой специфичностью к одному рецептору. Поэтому связывание меченого лиганда протекает более чем с одни;/ типом рецепторов. Для анализа изотерм связывания на нескольких, независимых центрах используют подходы, описанные в I главе литературного обзора. Реально из изотермы связывания одного лиганда можно выделить и охарактеризовать два, в редких случаях три, типа независимых мест связывания [1,14,16,92]. Точность1 и надежность определения характеристик подклассов рецепторов зависит от относительных величин констант диссоциации и концентрации мест связывания каждого подкласса. В работе [49] определена область относительных значений констант и концентраций мест связывания, для системы с двумя независимыми центрами (рецепторами), в которой надежно при 10% экспериментальной ошибке можно определить параметры каждого центра, s j Из результатов работы [49] следует, что при равной концентрации мест связывания двухцентровой модели необходимо 5-10-кратное различие констант диссоциации для корректного определения параметров связывания. Для отношения констант меньше двух, как правило, не удается надежно разделить и охарактеризовать два центра связывания. Значения констант диссоциации и концентраций мест связывания можно получить не только используя изотермы, но и анализируя кинетические кривые связывания меченого лиганда [1,4,5,121].
Получение лиофилизованных препаратов мембран головного мозга крыс
Равновесное связывание меченых соединений с препаратами мембран мозга изучали в среде инкубации I (или П) при заданной температуре. Реакционная смесь содержала: 600 мкл суспензии препарата мембран, 50 мкл раствора меченого лиганда требуемой концентрации, 50 мкл раствора немеченого лиганда или соответствующей среды инкубации. Время инкубации лиганда с препаратом мембран выбирали в зависимости от заданного значения температуры. При исследовании связывания пептида DAdLB в реакционную смесь добавляли антибиотик бацитрацин в концентрации З 10" М, который, как ранее было показано [189], эффективно ингибирует специфические протеазы, разрушающие энкефалины, не влияя при этом на процесс связывания. Разделение связанного и свободного лиганда проводили методом вакуумного фильтрования через стеклянные фильтры " Whatman 6F/В " (Англия) согласно методике [192] с некоторыми изменениями. Реакционную смесь разбавляли 3 мл холодной среды промывки и полученную суспензию переносили на фильтр. Фильтр трижды промывали 3 мл холодной средой промывки. Количество связанного с мембранами лиганда определяли по уровню радиоактивности фильтров. Для этого фильтры помещали в сцинтилляционные флаконы, заполненные 10 мл одной из указанных в разделе 4.3 сцинтилляционных смесей, выдерживали при температуре 4С 10-12 часов, после чего проводили счет радиоактивности на сцинтилляционном счетчике "17Шк-Ш" фирмы "Тг&сог " (США.) по программе, обеспечивающей 5% точность счета для каждой пробы. Эффективность счета составляла 34% для толуол-тритоновой смеси и 22% для толуол-феноксольной смеси. Неспецифическое связывание определяли как связывание в присутствии I мкМ немеченого лиганда.
При изучении кинетики ассоциации лигандов с рецепторами в пластиковую пробирку помещали 50 мкл раствора меченого лиганда требуемой концентрации и, либо 50 мкл соответствующей среды инкубации (при исследовании кинетики ассоциации общего связывания), либо 50 мкл 14 мкМ раствора немеченого лиганда (при исследовании кинетики ассоциации неспецифического связывания). Затем добавляли 600 мкл суспензии препарата мембран, преинкубированной 5 минут при 37С (за 5 минут преинкубации в аликвоте суспензии мембран устанавливается требуемая температура и не происходит заметной деградации рецепторов). Этот момент времени принимали за начало реакции. Реакционную смесь выдерживали определенное время при перемешивании и температуре 37С. Реакцию останавливали добавлением в пробирку 2,5 мл холодной среды промывки (4С). Количество связанного с мембранами лиганда определяли методом, описанным в разделе 4.7 (специальные эксперименты показали, что за время фильтрования не происходит заметной диссоциации лиганда с рецепторов). Для измерения связывания в нулевой момент времени в пробирку с аликвотами меченого и немеченого лиганда сначала добавляли 2,5 мл холодной среды промывки, а затем - 600 мкл суспензии мембран и сразу фильтровали.
При изучении кинетики ассоциации меченого лиганда в присутствии различных немеченых лигандов эксперимент проводили в следующей последовательности: 600 мкл суспензии мембран преинкубировали с 50 мкл немеченого лиганда требуемой концентрации при 37С и постоянном перемешивании в течение 15-20 минут, затем 600 мкл преинкубированной смеси переносили в пробирку с 50 мкл меченого лиганда и этот момент времени принимали за начало реакции.
Кинетику процесса диссоциации комплексов меченого лиганда с рецепторами изучали в присутствии I мкМ немеченого лиганда. Для этого 600 мкл суспензии мембран инкубировали при 37С при постоянном перемешивании с 50 мкл раствора меченого лиганда требуемой концентрации и 50 мкл среды инкубации I. Через 20 минут 600 мкл преинкубируемой смеси переносили в пробирку с 50 мкл 14 мкМ раствора немеченого лиганда и этот момент времени принимали за начало реакции. Все дальнейшие операции проводили так, как это описано вше.
Применение метода. имитационного моделирования для анализа рецепторных взаимодействий
Математическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием электронно-вычислительных машин Р2)Р 11/45 и ШР П/8е. Автор выражает искреннюю благодарность сотруднику кафедры химической энзимологии Химического факультета МГУ А.И.Громову и сотрудникам отдела биокинетики Межфакультетской НИЛ им.А.Н.Белозерского МГУ А.С.Белоусову и И.Л.Борисову за помощь в составлении програші и общении с ЭВМ. При количественном изучении взаимодействия лигандов с центрами связывания ключевой проблемой является дискриминация моделей процесса комплексообразования. Описанные в литературе методы характеризуются целым рядом недостатков, подробно рассмотренных в главе I литературного обзора. Наиболее перспективным подходом к анализу и дискриминации нелинейных моделей и, в частности, моделей комплексообразования, а также к оценке их статистических свойств может служить, на наш взгляд, метод имитационного моделирования [21,22]. В данной работе нами предлагается метод аппроксимации распределений оценок параметров и выбора критериев для дискриминации моделей, существенно расширяющий возможности одного из частных методов имитационного моделирования [21,22]. для краткости в данном изложении предлагаемый метод будем называть МИМ. Рассмотрим взаимодействие одновалентного лиганда с несколькими {it) независимыми типами центров связывания Зависимость концентрации связанного лиганда І31 от концентрации свободного лиганда f/J можно представить в виде (4): При количественном анализе экспериментальных данных существенным моментом является установление характера распределения ошибки измерений (постоянство относительной или абсолютной ошибки). Применение метода элализа остатков (см.рис.19) показывает, что взаимодействие меченных тритием лигандов с опиатными рецепторами мембран головного мозга характеризуется постоянством относительной ошибки измерений. Для оценки характера разброса и взаимосвязи параметров уравнения (4) использовали МИМ. Суть его сводится к следующему, а) Рассматриваются кривые вида (4), для оценивания параметров модели используется МНК в предположении, что ошибки относительны, распределены по усеченному нормальному закону и независимы от измерения к измерению, б) Полученные оценки параметров модели используются в имитационном эксперименте как истинные.
Сам эксперимент на ЭВМ представляет собой случайное моделирование с учетом реальной экспериментальной ошибки определения как CS1, так и С А 3 , относительно теоретической кривой, полученной в а). Моделируется тот же объем псевдоэкспериментальных точек, что и в реальном эксперименте, с сохранением характера распределения в опыте экспериментальных точек. Число таких ЭВМ-экспериментов определяется произведением (р+{)1 , где р-число параметров модели, С - число экспериментальных точек на кривой, в) По алгоритму раздела а) в каждом ЭВМ-эксперименте вычисляются оценки параметров выбранной модели и сумма квадратов отклонений от теоретической кривой. Полученная совокупность значений параметров используется для анализа их разброса, построения эмпирических функций распределения и, вместе со значениями сумм квадратов отклонений, для дискриминации моделей. Тактл образом, выбранная модель подвергается как бы испытанию имитацией для выявления ее соответствия неким существенным свойствам системы.
Одним из важных свойств зависимостей типа (4) является сильная корреляция МНК-оценок значений параметров QL и /fc- . О такой сильной зависимости оценок параметров Qt и KL уже говорилось в литературном обзоре (глава I). Это следует и из непосредственно имитационного эксперимента. Облака разброса оценок параметров (или совместные доверительные области) для адекватных моделей, описываемых уравнением (4), приведены на рис.20. Хорошо видна сильная линейная корреляция оценок параметров Q и К . Количественной характеристикой этой взаимосвязи может служить коэффициент линейной корреляции оценок, который для адекватных моделей имеет величины порядка 0,9-0,97. Кроме того, подобный же вывод о взаимосвязи оценок констант диссоциации и концентрации мест связывания молено сделать, анализируя информационную матрицу уравнения (I). Так для простейшего случая с одним центром связывания информационная матрица будет иметь вид: диагональные и недиагональные элементы матрицы имеют одинаковый порядок величин. Аналогично можно записать матрицы А для двух, трех и большего числа мест связывания и показать, что недиагональные элементы близки по значениям к диагональным элементам матрицы. Подобный характер соотношения элементов информационной матрицы указывает на сильную корреляцию получаемых параметров [30]. Именно это свойство рассматриваемой системы, описываемой уравнением (4) - сильная линейная корреляция МНК-оценок параметров Хи &i , было положено нами в основу дискриминации моделей комплексообразования. Можно полагать, что в случае неадекватности модели набору экспериментальных точек будет наблюдаться изменение силы линейной корреляции параметров Jft- иГбДи формы облаков разброса параметров. На рис.21 представлены облака разброса параметров К иГШ0, полученные при расчете по модели с двумя независимыми центрами связывания с использованием точек теоретической кривой, описывающей взаимодействие лиганда с одним центром связывания. Из рис.21 видно, что форма облаков разброса параметров для неадекватной модели отлична от формы облаков, представленных на рис.20 (адекватная модель). Фактически мы видим отсутствие линейной корреляции параметров К и[Q}Q. Большое число проведенных ЭВМ-экспериментов при различны?: наборах параметров связывания, .малая чувствительность результатов вычислений к характеру распределения ошибки измерений позволяет наїм предложить МИМ для дискриминации моделей комплексообразования лигандов с центрами связывания.
