Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературных данных 12
1.1. Актуальность проблемы определения катионов металлов 12
1.2. Формы существования ионов алюминия, железа, кобальта, меди и цинка в водных растворах 14
1.3. Физико-химические методы определения ионов металлов 18
1.4. Фотометрическое определение ионов металлов в водных растворах 25
1.5. Хроматографические методы определения катионов металлов 29
1.6. Определение ионов металлов методом капиллярного электрофореза (КЭ) 32
1.6.1. Основы метода КЭ 32
1.6.2. Капиллярный зонный электрофорез 34
1.6.3. Мицеллярная электрокинетическая хроматография 34
1.6.4. Электрокинетический и гидродинамический способы ввода 35
1.6.5. Основные варианты УФ-детектирования ионов металлов в методе КЭ 36
1.6.5.1. Определение ионов металлов с косвенным детектированием 36
1.6.5.2. Электрофоретическое определение катионов металлов с использованием органических реагентов (прямое детектирование) 38
1.7. Комплексообразование ионов металлов с традиционными фотометрическими реагентами 39
1.7.1. Комплексы ионов металлов с ксиленоловым оранжевым 39
1.7.2. Комплексы ионов металлов с 4-(2-пиридилазо)резорцином (ПАР) 42
1.8. Предколоночное и внутриколоночное комплексообразование катионов металлов с органическими лигандами 43
1.8.1. Влияние процесса комплексообразования на электрофоретическую подвижность аналитов 44
1.8.1.1. Введение слабых комплексообразующих агентов (одно-, двух-, трехосновные и гидроксикарбоновых кислот) в состав рабочего буфера 45
1.8.1.2. Использование мультидентатных хелатирующих реагентов 46
1.8.2. Разделение органических соединений с использованием солей металлов в составе рабочего буфера 48
1.8.3. Основные факторы, определяющие комплексообразование в системе метам - органический лиганд 49
1.9. Электроинжекционный метод анализа (ЭИА) смеси катионов металлов 49
1.10. Разделение катионов металлов методом электрофоретически опосредованного микроанализа (ЭОМА) 51
1.11. Детектирование в КЗЭ при определении комплексов металлов 52
1.12. Физико-химические модели разделения ионов металлов в присутствии комплексообразующих агентов в ионной хроматографии 53
1.13. Использование ионов металлов в лигандообменной хроматографии 54
1.14. Координационные соединения меди и перспективы их использования в медицине 60
ГЛАВА 2. Общая характеристика объектов и методов исследования 66
2.1. Аппаратура 66
2.2. Реагенты 67
2.3. Подготовка кварцевого капилляра 70
2.4. Приготовление рабочих растворов 70
2.5. Методы определения ионов металлов 72
2.5.1. Фотометрическое определение катионов металлов 72
2.5.1.1. Определение металлов методом капиллярного электрофореза с косвенным детектированием 72
2.5.1.2. Использование фотометрических реагентов: 4-(2-пиридилазо)резорцина и ксиленолового оранжевого (прямое детектирование) 74
2.5.2. Электроинжекционное определение (ЭИА) биогенных металлов 87
2.6. On-line концентрирование в режиме капиллярного электрофореза 88
2.7. Разрешение, эффективность и селективность разделения в методе КЭ 90
ГЛАВА 3. Электрофоретическое определение ионов металлов с использованием фотометрических реагентов 92
3.1.Электрофоретическое определение биогенных металлов с 4-(2-пиридилазо)резорцином (ПАР) 92
3.1.1. Определение металлов методом капиллярного электрофореза с прямым детектированием комплексов металл-пиридилазорезорцин (Ме-ПАР) 92
3.1.2. Определение металлов в форме комплексов Ме-ПАР методом электрофоретически опосредованного микроанализа 95
3.2. Электрофоретическое определение катионов металлов с ксиленоловым оранжевым 96
3.2.1. Определение металлов методом капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) с прямым детектированием комплексов Ме-КО 98
3.3. Определение ионов биогенных металлов методом электроинжекционного анализа (ЭИА) 100
3.3.1. Электроинжекционный анализ (ЭИА) с использованием ЭДТА в качестве фотометрического реагента 101
3.3.2. Электроинжекционный анализ (ЭИА) с использованием ксиленолового оранжевого (КО) в качестве фотометрического реагента 103
3.3.3. Электроинжекционное определение ионов Со2+ с использованием нитрозо-Р-соли 105
3.3.4. Электроинжекционное определение ионов А1 в водных растворах в присутствии Fe3+ ПО
ГЛАВА 4. Исследование возможности взаимодействия биогенных металлов (Cu2+, Со2+, Al3*, Ее3*) с биологически активными органическими лигандами методами капиллярного электрофореза 118
4.1. Процессы on-line и off-line комплексообразованя в системе биологически активный органический лиганд - металл 118
4.2. Электрофоретическое изучение системы циклам (1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан)+Си2+ 141
4.3. Влияние добавок ионов металлов в состав рабочего электролита на разделение функционально замещенных гидрокси- и амино-ароматических кислот методом капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) 144
4.4. Электрофоретическое изучение процессов комплексообразования в системе природные полифенолы - Fe3+ 158
ГЛАВА 5. Практическое приложение 167
5.1. Определение катионов металлов в витаминах методом капиллярного зонного электрофореза 167
5.2. Определение массовой концентрации ионов алюминия в питьевых и природных водах методом капиллярного электрофореза 169
5.3. Электроинжекционное определение алюминия (III) в природных водах 170
5.4. Электрофоретическое определение ванилинминдальнои и гомованилиновой кислот в режимах мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) и капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) с введением ионов Си в состав рабочего буфера 173
Выводы 183
Список литературы 185
Список используемых сокращений 206
- Предколоночное и внутриколоночное комплексообразование катионов металлов с органическими лигандами
- Физико-химические модели разделения ионов металлов в присутствии комплексообразующих агентов в ионной хроматографии
- Использование фотометрических реагентов: 4-(2-пиридилазо)резорцина и ксиленолового оранжевого (прямое детектирование)
- Определение металлов методом капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) с прямым детектированием комплексов Ме-КО
Введение к работе
Актуальность проблемы
Определение катионов биогенных металлов и биологически активных соединений в природных и биологических объектах является одной из актуальных задач аналитической химии. Металлы играют важную роль в процессах живого организма, входят в состав активных центров ферментов. В организме жизненно важные металлы находятся преимущественно в виде координационных соединений. Их избыток или недостаток, вмешательство токсичных веществ и вирусов (потенциальных комплексообразователей) в конкуренцию за металл приводят к различным заболеваниям, для диагностики и лечения которых необходимо проводить как определение ионов металлов в различных физиологических растворах и биологических жидкостях, так и органических лигандов.
Все большее распространение вследствие высокой эффективности и экспрессное получает метод капиллярного электрофореза (КЭ). Однако при этом есть и определенные проблемы: электрофоретические подвижности многих гидратированных металлических ионов близки, а чувствительность УФ-детектирования в методе КЭ недостаточна для определения их и биологически активных органических соединений в реальных объектах.
Изменить электрофоретические характеристики определяемых ионов и снизить пределы обнаружения возможно при использовании процессов комплексообразования с органическими лигандами, поглощающими в УФ-свете либо образующими поглощающие комплексы.
Получение подобной информации могло бы представить как практическую ценность, так и теоретическую новизну в связи с вьюснениями новых возможностей метода капиллярного электрофореза.
Стоит отметить еще одно важное обстоятельство: имеются публикации относительно образования в организме человека координационных
соединений ионов металлов с лекарственными препаратами. Возможность электрофоретического контроля за подобными процессами может оказаться весьма полезной в практике клинической медицины как для определения биогенных металлов, так и соответствующих биологически активных веществ эндо- и экзогенного происхождения.
Цель диссертационного исследования: Изучение возможностей электрофоретического определения катионов биогенных металлов и биологически активных веществ в форме их комплексных соединений.
В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
Выбрать аналитические формы биогенных металлов (ОТ, AT, Zn% Со% Fe , Ni ) с органическими реагентами и уточнить их фотометрические характеристики для оптимизации условий электрофоретического определения.
Выяснить возможности определения этих металлов с использованием традиционных фотометрических реагентов в различных режимах КЭ :
косвенное и прямое детектирование в УФ-области;
введение в кварцевый капилляр предварительно подготовленных комплексов;
- образование комплексов металлов с фотометрическими
реагентами внутри кварцевого капилляра (электроинжекционный и
электрофоретически опосредованный методы анализа).
Оптимизировать условия off-line и on-line комплексообразования в системе органический лиганд - металл.
Оценить возможности различных вариантов электрофоретического определения биологически активных лигандов (биогенных аминов, аминокислот, полифенолов, ароматических функционально замещенных
карбоновых кислот) в форме комплексных соединений с биогенными металлами. 5. Предложить схемы электрофоретического анализа реальных объектов (природные воды, витамины, моча) при определении катионов металлов и/или органических лигандов в форме их комплексов.
Научная новизна
Выявлены аналитические формы и уточнены фотометрические характеристики при определения биогенных металлов с использованием фотометрических реагентов в различных режимах капиллярного электрофореза: косвенное и прямое детектирование в УФ-области; электроинжекционный и электрофоретически опосредованный варианты анализа.
Обнаружена высокая комплексообразующая способность природных
антиоксидантов полифенольного типа с ионами Fe . Показано, что доминирующим фактором в образовании таких комплексов является наличие пирокатехиновых фрагментов (1,2-фенольных гидроксилов) в составе молекул полифенолов.
На примерах непоглощающих в УФ-свете аминокислот (глутаминовой, аланина, валина) и азомакроцикла (циклама) установлено, что чувствительность их определения возрастает в 10 - 30 раз при использовании ионов Си в составе буферного электролита.
Теоретическая значимость работы
Обоснованы преимущества и ограничения различных схем электроинжекционного метода и электрофоретически опосредованного микроанализа при определении катионов металлов в зависимости от природы реагента, относительных значений электрофоретических подвижностей реагента и комплекса, электроосмотического потока.
На примерах модельных биологически активных соединений -норадреналина (NA}, 3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА) и глутаминовой кислоты (Glu) - оптимизированы условия определения их в форме комплексов с ионами Си2+ в различных режимах капиллярного зонного электрофореза.
Показано, что добавление ионов Меп+ в состав рабочего буфера приводит к улучшению разрешения функциональных замещенных ароматических кислот: за счет процессов комплексообразования по аминному и карбоксилатному типу в случае ионов Си2+; и с участием фенольных гидроксилов - для ионов А13+ и Fe3+ .
Практическая значимость работы
Разработаны способы электрофоретического определения А1 в форме комплекса с ксиленоловым оранжевым в природных и питьевых водах и ионов Со2+, Cu2+, Zn2+ в форме комплексов с 4-(2-пиридилазо)резорцином в витаминах «Компливит».
Предложены схемы электрофоретического анализа
ванилинминдальной и гомованилиновой кислот - маркеров нейробластомы -в моче в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии (фосфатный буфер, рН 7,0; 150 мМ ДДСН) и методом капиллярного зонного электрофореза (боратный буфер, рН 8,5; 1 мМ Си ).
Положения, выносимые на защиту:
Аналитические формы металлов (Cu2+, Al3+, Zn2+, Со2+, Fe3+, Ni2+) с традиционными органическими реагентами и их фотометрические и электрофоретические характеристики.
Обоснование преимуществ и ограничений схем электроинжекционного и электрофоретически опосредованного методов анализа при определении ионов биогенных металлов с использованием
фотометрических реагентов: ксиленолового оранжевого (КО), нитрозо-Р-соли (НРС), 4-(2-пиридилазо)резорцина (ПАР).
Концентрации, состав, рН буферного электролита, соотношение
реагентов в системе металл - органический лиганд при off-line и on-line
комплексообразовании в режиме капиллярного зонного
электрофореза.
Способы on-line концентрирования (стекинг с большим вводом пробы и стекинг с усилением поля) для увеличения чувствительности электрофоретического определения катионов металлов и/или их комплексов методами традиционного капиллярного зонного электрофореза, электроинжекционного и электрофоретически опосредованного методов анализа.
Условия электрофоретического определения биологически активных органических соединений (биогенные амины, аминокислоты, полифенолы, ароматические функционально замещенные карбоновые кислоты) в форме комплексов с биогенными металлами.
Практические приложения выявленных закономерностей в схемах анализа для определения:
- ионов алюминия в природных и питьевых водах методами
электроинжекционного анализа и капиллярного зонного
электрофореза;
- ионов кобальта, меди и цинка в витаминном комплексе «Компливит»
с использованием 4-(2-пиридилазо)резорцина (ПАР) методом
капиллярного зонного электрофореза;
- маркеров злокачественной опухоли - ванилинминдальной и
гомованилиновой кислот методами КЗЭ и МЭКХ с введением в состав
рабочего буфера катионов Си с оптимизированным вариантом
пробоподготовки.
Предколоночное и внутриколоночное комплексообразование катионов металлов с органическими лигандами
В отличие от ионов А13+ и Fe3+ ионы Со2+, Cu2+, Zn2+ и Ni2+ подвержены гидролизу в меньшей степени [7, 13, 15]. Катионы меди(П) существуют в кислой среде в виде гидратированных ионов. В слабокислой среде (рН 5,5-6,5) часть растворенной меди находится в форме гидроксокомплексов [СиОН]+. Возможно образование и других гидроксоформ: [Си(ОН)2], [Си(ОН)зГ, [Си2(ОН)2]2+.
Гидролиз ионов цинка в водном растворе начинается только при рН 5,0. В результате образуется несколько моноядерных гидроксокомлексов [ZnOH]+, [Zn(OH)2], [Zn(OH)3] , [Zn(OH)4f. Полиядерные - [Zn2OH]3+ и [Zn2(OF)6] - составляют лишь незначительную долю.
Наиболее распространены соединения кобальта со степенью окисления +2. Соединения Со обладают сильными окислительными свойствами и неустойчивы в водных растворах. Вплоть до рН 9,0 кобальт существует в форме гидратированных ионов [Со(Н20)б] . И только при более высоких значениях рН появляются его гидролизованные формы. Образование полиядерных гидроксокомплексов кобальта возможно лишь при концентрации ионов Со2+ 1x10"4 моль/л.
Таким образом, при разработке методик определения массовой концентрации ионов кобальта, меди и цинка, в природных и питьевых водах процессами гидролитической полимеризации вышеперечисленных ионов можно пренебречь.
Существует множество различных методов определения ионов металлов. Основными являются: атомно-абсорбционная спектроскопия (ААС) [16], атомно-эмиссионная спектроскопия с индуктивно связанной плазмой (ИСП-АЭС) [17], масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС) [18], высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [19 - 21], ионная (ИХ) [22], ионообменная (ИОХ) [23], ион-парная (ИПХ) [24] хроматография, вольтамперометрия [25], проточно-инжекционный анализ (ПИА) [26,27] (табл.2).
Метод атомно-абсорбционного спектрального анализа отличается высокой абсолютной и относительной чувствительностью и позволяет с большой точностью определять в растворах до 70 элементов в малых концентрациях (10"4 - 10"9 % масс), поэтому он широко применяется в биологии, медицине, геологии, а также в металлургии для контроля технологических процессов.
Атомно-абсорбционный спектральный анализ основан на селективном поглощении УФ- или видимого излучения атомами газа. Для перевода пробы в газообразное атомарное состояние применяются два вида устройств атомизации: пламенные и электротермические. В качестве источника излучения обычно применяют лампу с полым катодом из определяемого металла. Интервал длин волн спектральной линии, испускаемой источником света, и линии поглощения того же самого элемента в пламени очень узок, поэтому поглощение других элементов практически не сказывается на результатах анализа. Атомно-абсорбционные элементные анализаторы относятся к современным селективным и высокоточным приборам.
Вариантом атомной спектроскопии является атомно-эмиссионная спектроскопия, для которой характерен обратный способ регистрации, т.е. по оптическому спектру испускания возбужденных атомов.
Наиболее перспективным считается вариант с индуктивно связанной плазмой (ИСП), не уступающий по чувствительности атомно-абсорбционным атомизаторам, но имеющий в 10 - 100 раз более широкий диапазон определяемых концентраций. При этом атомно-эмиссионные анализаторы позволяют одновременно определять в пробе несколько элементов, но, к сожалению, уступают атомно-абсорбционным спектрометрам по воспроизводимости и селективности.
Масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (ICP/MS, ИСП/МС) развилась в один из наиболее перспективных методов благодаря высокой чувствительности и возможности выполнения многоэлементного анализа [28,29].
При комбинировании с методом изотопного разбавления ИСП/МС высокого разрешения можно получить столь высокую точность при характеристике эталонных стандартных образцов, которые недоступны другим аналитическим методам и их комбинациям [30- 32].
Наиболее общим и универсальным методом определения ионов металлов является ионообменная хроматография [33], в основе которой лежит процесс обмена между ионами анализируемого раствора и подвижными ионами того же знака ионообменника. Развитие высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления стимулировало развитие ионной хроматографии, включающей кондуктометрическое определение хроматографически разделенных ионов.
Все большее распространение при определении катионов металлов получают методы проточно-инжекционного анализа (ПИА) [34 - 36] и метод капиллярного электрофореза (КЭ) с фотометрическим детектированием [37,38].
В 90-х г. был предложен метод электроинжекционного анализа (ЭИА), совместивший в себе основные достоинства ПИА и КЭ [39]. В ЭИА фотометрируемые комплексы металлов с органическими реагентами образуются непосредственно в капилляре и разделяются за счет различий в их электрофоретических подвижностях. В случае КЭ и ЭИА становится возможным многокомпонентное определение, а использование фотометрических реагентов приводит к снижению пределов обнаружения аналитов.
Физико-химические модели разделения ионов металлов в присутствии комплексообразующих агентов в ионной хроматографии
До сих пор наиболее широко используемыми методами многокомпонентного анализа с использованием фотометрических реагентов остаются - хроматографические [100,101]. Возможны три варианта: - хроматографическое определение после концентрирования ионов металлов на предколонке, заполненной сорбентом, модифицированным фотометрическим реагентом; - введение реагента в состав элюента для повышения селективности разделения и снижения предела обнаружения; - постколоночное добавление реагента в поток элюата для проведения чувствительного фотометрического определения. В первом случае схема определения аналогична схеме сорбционного концентрирования в ПИА. Широкого применения она не нашла. Добавление органического реагента в состав подвижной фазы также используется реже, чем постколоночная дериватизация. Одним из первых примеров разделения катионов переходных металлов явилось определение их с хлорсульфоназо методом ионной хроматографии с фотометрическим детектированием (к = 530 нм). При использовании в качестве комплексообразующего агента бис-(изовалерилацетон)этилендиамина предложена методика определения катионов кобальта, меди, железа и платины в фармацевтических препаратах методом ВЭЖХ с УФ-детектированием. Пределы обнаружения катионов составляли 2,5-5,0 нг [102]. Постколоночный реагент должен удовлетворять следующим основным требованиям [103,104]: - реакция между реагентом и ионом металла должна протекать достаточно быстро; - в ходе реакции должен образовываться сильно поглощающий продукт с молярным коэффициентов погашения (є) 10000; - реагент не должен поглощать при длине волны детектирования комплекса; - реагент и соответствующий комплекс должны быть хорошо растворимы в воде (или элюенте). Таким образом, к постколоночному реагенту предъявляются более жесткие требования, чем к реагенту, применяемому в ПИА. Поэтому круг таких фотометрических реагентов в ВЭЖХ значительно уже, чем в ПИА. Как правило, используются пиридилазорезорцин (ПАР) [104], ксиленоловый оранжевый (КО) [105], арсеназо III, хлорсульфоназо [106,107]. Несмотря на то, что КО образует окрашенные комплексные соединения со многими металлами, он не нашел широкого применения в качестве постколоночного реагента в ионной хроматографии (ИХ), поскольку в зависимости от условий проведения анализа образует с ионами металлов комплексы разной устойчивости и с различным соотношением реагент:МепЛ , молярные коэффициенты поглощения которых существенно различаются.
На сегодняшний день ПАР является наиболее распространенным постколоночным реагентом, способным образовывать комплексные соединения с катионами многих переходных металлов: Mn, Fe(II), Fe(III), Со, Ni, Си, Zn, Cd, Pb, U, лантаноидами и т.д., максимумы спектров поглощения которых находятся в диапазоне длин волн 500-540 нм, а пределы обнаружения составляют 1-20 нг.
Основные характеристики методик определения катионов металлов методом ионной хроматографии с ПАР представлены в табл. 3.
При сложном составе пробы необходимо вводить в раствор аминополикарбоксилатные лиганды для повышения селективности разделения [104, 113, 114]. Показано, что добавление в элюент 0,1 мМ нитрилотриуксусной кислоты (НТА) уменьшает степень взаимодействия ПАР с ионами переходных металлов, но в то же время полностью подавляет его взаимодействие с лантаноидами. Увеличение концентрации НТА до 8,0 мМ приводит к подавлению сигнала фотометрического детектора ко всем ионам металлов за исключением Си2+ и Со2+. В этих условиях возможно их экспрессное и высокочувствительное определение на уровне 1-3 нг [104].
Новые возможности разделения и определения сложных смесей катионов открылись с появлением метода капиллярного электрофореза, развитие которого началось в конце 70-х - начале 80-х гг. XX в. Он основан на разделении сложных смесей компонентов, находящихся в электролите, заполняющем кварцевый капилляр, при приложении к нему разности потенциалов [115].
Кислотные свойства поверхностных силанольных групп характеризуются константой диссоциации Ki= 4 10", поэтому при рН 2,5 на поверхности находятся диссоциированные силанольные группы, которые придают ей отрицательный заряд.
При диаметре внутреннего канала 25 - 75 мкм практически вся жидкость, заполняющая капилляр, представляет собой диффузную часть двойного электрического слоя. При наложении электрического поля возникает движение носителей электрических зарядов во взаимно противоположных направлениях. Так как в диффузной части двойного электрического слоя присутствует некоторая избыточная концентрация катионов, их движение увлекает за собой всю остальную массу жидкости в капилляре. Возникает электроосмотический поток (ЭОП), направленный к катоду и осуществляющий пассивный перенос раствора внутри капилляра. Скорость ЭОП зависит от концентрации электролитов в рабочем буфере и рН раствора: в слабокислых растворах ЭОП отсутствует или незначителен, а в нейтральных и щелочных - постепенно возрастает.
Обычно полярность входного конца положительная (анод), и ЭОП переносит зону пробы к катоду. Как правило, детектор устанавливается вблизи катода. Вводимая со стороны анода проба будет транспортироваться ЭОПом к катоду. Катионные компоненты пробы обгоняют ЭОП, нейтральные - появляются на выходе вместе с ЭОП. Медленно мигрирующие анионы ( (1х- М-эоп ) будут элюироваться последними. Анионы, чья скорость миграции по абсолютной величине превышает скорость ЭОП, будут выходить из капилляра в прианодное пространство.
Использование фотометрических реагентов: 4-(2-пиридилазо)резорцина и ксиленолового оранжевого (прямое детектирование)
Согласно другим данным [134], в растворе в зависимости от соотношения концентраций металла и реагента, а также от концентрации ионов водорода ионы алюминия образуют три типа комплексов (2:1; 1:2 и 1:1) с различными спектрофотометрическими характеристиками.
Для полного связывания ионов А1 используют избыток реагента. В растворах с рН 3,5 обычно сосуществуют два комплекса, соотношение между которыми будет зависеть как от рН среды, так и от концентрации реагента. Одновременное образование двух комплексов значительно осложняет фотометрическое определение алюминия с КО, так как их спектры поглощения перекрываются. В этом случае определение ионов А1 проводят при рН 3,4 с измерением оптической плотности в изобестической точке при 536 нм. Установлено, что окраска комплекса не разрушается вплоть до использования 4 М раствора НС1.
К недостаткам применения КО следует отнести медленную кинетику образования его комплекса с Al . При комнатной температуре процесс комплексообразования заканчивается через 4 ч, при нагревании - в течение 3 мин [135]. ПАР поглощает свет в видимой области спектра. Изменение его ионного состояния сопровождается сдвигом полосы максимального поглощения в длинноволновую область при переходе от молекулярных форм к катионным, а также батохромным сдвигом при переходе от молекулярных форм к однократно диссоциированным и далее - к двукратно диссоциированным. При этом положение максимумов светопоглощения смещается на 30-100 нм.
В водном растворе недиссоциированная форма (H2R) 4-(2-пиридилазо)резорцина имеет максимум поглощения при 392 нм (рН 2,1-4,2), молярный коэффициент поглощения равен 1.52 104. В спектре протонированной формы (H3R+) (рН 2) максимум поглощения наблюдается при 420 нм (є = 1.48 104). Однократно (HR") [рН 4,2-7,0] и двукратно (R2") [рН 10,2-13,2] ионизованные формы имеют максимальное поглощение при 414 нм (є = 2.31 104) и 502 нм (є = 1.78 104 ), соответственно. В [136] приведены константы ионизации ПАР в водном растворе: рКмн = 3.1, рКр.он = 5.6, рКо_он = П-9. Диаграмма распределения форм пиридилазорезорцина в зависимости от рН раствора приведена на рис. 3.
Фотометрическое определение металлов с ПАР проводят в водной среде. При рН 3-8 ПАР образует окрашенные комплексы состава 1:2 с ионами Zn2+, Со2+, Cu2+, Ni2+ и некоторыми другими металлами с высокими значениями є от 0,2 до 1 105 [98]. Использование капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) для анализа ионов металлов в последние годы интенсивно развивается благодаря относительной простоте и высокой эффективности этого метода [137-139]. Одна из проблем электрофоретического анализа неорганических ионов заключается в том, что некоторые группы катионов имеют почти одинаковые подвижности благодаря их близкому радиусу и одинаковому заряду и не могут быть разделены в режиме КЗЭ, если не использовать дополнительный механизм разделения [140, 141]. Например, подвижности ионов никеля, цинка, меди, железа (II) и свинца, практически идентичны; свинец отличается от остальных более низкой степенью гидролиза. Добавление водорастворимого комплексообразующего реагента к буферному электролиту используется для изменения подвижностей ионов металлов. Ионы, способные образовывать комплексы, мигрируют медленнее [142-145]. Разделение может осуществляться двумя способами [146]. Первый - внутриколоночное комплексообразование: растворимый лиганд добавляется к электролиту. В этом варианте обычно используют косвенное УФ-детектирование, а в качестве слабых лигандов - карбоновые кислоты (гликолевая, винная, янтарная, а-гидроксиизомасляная и др.) [137-139]. Внутриколоночное комплексообразование - более простая процедура по сравнению с предколоночным. Разделение катионов металлов (Си , Zn , Ni2+, Cd2+, Mn2+, Pb2+, Fe3+, Al3+ и Ca2+) осуществляли с использованием электролита, содержащего 10 мМ 2,6-пиридиндикарбоксилата (2,6-ПДК), 0.75 мМ тетрадецилтриметиламмоний бромида (ТТАВ) при рН 4,0 с добавками катионных ПАВ для управления селективностью разделения. Пределы определения катионов металлов составили 3-Ю мкМ, а линейный диапазон - 20-300 мкМ [146]. Второй подход - предколоночное комплексообразование. Избыток сильного лиганда перед электрофоретическим разделением добавлялся к раствору образца [137, 147]. Этот принцип позволяет проводить прямое УФ детектирование ионов металлов при использовании подходящих УФ поглощающих лигандов (например, 4-(2-пиридилазо)резорцинол, 8 гидроксихинолин-5-сульфоновая кислота, а также различные полиаминокарбоновые кислоты, такие как этилендиаминтетрауксусная (ЭДТА), циклогексан-1,2-диаминтетрауксусная (ЦЦТА) и диэтилентриаминпентауксусная (ДТПА)). Неорганические лиганды (цианид-и хлорид-ионы) применяются реже, поскольку они требуют более строгого контроля за условиями комплексообразования [137-139].
Определение металлов методом капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) с прямым детектированием комплексов Ме-КО
Важнейшими из факторов, определяющих процессы комплексообразования в системе органический лиганд - металл, являются концентрация лиганда и рН рабочего буфера. Оптимальная концентрация лиганда в разделительном буфере может быть определена, если известны константы устойчивости комплексов различных металлов с лигандом [163, 164].
Поскольку лиганды - обычно ионогенные соединения, их концентрация в существенной степени зависит от рН буферного электролита [163]. Когда рН увеличивается, концентрация лиганда возрастает и, следовательно, степень ассоциации с ионом металла также растет. Однако при высоких значениях рН имеет место и дополнительная диссоциация силанольных групп кварцевого капилляра, что приводит к увеличению ЭОПа, который, в свою очередь, увеличивает миграцию аналитов. Величина рН оказывает влияние и на установление равновесия в процессах комплексообразования.
Метод, позволяющий осуществить фотометрическую реакцию непосредственно в кварцевом капилляре, получил название электроинжекционного анализа (ЭИА) [39]. Он был предложен как усовершенствованный вариант проточно-инжекционного анализа (ПИА) и совмещает в себе основные достоинства двух широко используемых сегодня методов анализа в потоке - капиллярного электрофореза и проточно-инжекционного анализа.
В ЭИА химическая реакция между определяемым компонентом и реагентом реализуется непосредственно в капилляре. Капилляр заполняется буферным раствором, и в нем создается продольное электрическое поле. В отличие от метода капиллярного электрофореза в ЭИА детектор расположен посередине кварцевого капилляра, что позволяет осуществлять ввод пробы с одного конца, а фотометрического реагента - с другого. Таким образом, проба и реагент вводятся одновременно электрокинетически с противоположных концов капилляра. Зона пробы и зона реагента движутся в капилляре навстречу друг другу. Смешение этих зон осуществляется за счет различия в их электрофоретических подвижностях. Образовавшийся продукт химической реакции детектируется фотометрически непосредственно в капилляре. Условия эксперимента подбирают таким образом, чтобы проба и реагент провзаимодействовали в области точки А (рис. 6). Ранее [39, 165] показана принципиальная возможность применения метода ЭИА для однокомпонентного определения в водных растворах ионов хрома, меди, свинца и кобальта.
Для успешной реализации ЭИА при многокомпонентном анализе необходимо знание электрофоретических подвижностей реагентов, катионов металлов и их комплексов. Поскольку представленная работа связана с развитием методов капиллярного электрофореза и ЭИА в плане применения их к анализу реальных объектов, определение подвижностеи реагентов и комплексов металл-реагент было также одной из задач настоящей работы.
При осуществлении ЭОМА важное значение имеет порядок ввода реагентов в капилляр. Согласно ЭОМА (Electrophoretically Mediated Microanalysis [166-168]) проба и реагент вводятся с одного конца капилляра (рис. 8): сначала - более "медленный" реактант (имеющий меньшую скорость движения в продольном электрическом поле), а затем - более "быстрый". В случае с ПАР, он сам и является "медленным" реактантом, а "быстрым" - катионы металлов. При этом зона катионов "догоняет" зону реагента и проходит сквозь нее (рис. 7). Осуществляется химическая реакция, и образовавшиеся комплексы направляются к детектору. Разделение компонентов пробы происходит, главным образом, за счет различий в их электрофоретических подвижностях. Использование этого варианта целесообразно, если знаки электрофоретических подвижностей реактантов (Щле, Ць) и электроосмотического потока (Цэоп) совпадают. Если же электрофоретическая подвижность одного из реактантов имеет другой знак, то для реализации ЭОМА необходимо, чтобы величина электрофоретической подвижности этого реактанта была по абсолютной величине меньше цэоп что и наблюдается в случае ПАР.
Чаще всего используют оптические детекторы: абсорбционные и флуоресцентные, но большинство ионов металлов в этом диапазоне не поглощают. Поэтому широко используемой техникой для обнаружения ионов металлов является косвенное детектирование, при котором ионы аналита заменяют УФ-поглощающим органическим катионом. Несмотря на явные преимущества, низкая чувствительность является ограничением применения этой техники [137-139].
При использовании электрокинетического ввода было получено двухкратное увеличение чувствительности по сравнению с гидродинамическим вводом для одних и тех же аналитов, что соответствует пределам обнаружения 1 мкг/л [169].
Применение вольтаметрических детекторов [170] для КЭ ограничивается малым диапазоном элементов, которые обеспечивают соответствующие электрохимические сигналы. Кроме того, только несколько элементов могут быть определены одновременно. Для этой цели перспективен масс-спектрометрический детектор. Описаны приборы, где КЗЭ состыкован с миниатюризированным масс-спектрометром с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС) [171]. Однако в этом случае ограничен выбор электрофоретических буферных систем и необходимы специальные интерфейсы и распылители.
