Введение к работе
Актуальность темы. Неорганические пирофосфатазы (КФ 3.6.1.1) катализируют гидролиз пирофосфата до фосфата. Эта реакция играет важную роль в метаболизме, смещая равновесие многих обратимых биосинтетических процессов, в которых пирофосфат образуется в качестве побочного продукта, в направлении синтеза. Ферментативный гидролиз пирофосфата может также служить удобной моделью превращений фосфоангадридных связей іюд действием большого числа других ферментов фосфорного обмена.
К настоящему времени выделены пирофосфатазы более чем из 30 организмов; для 10 га них известна аминокислотная последовательность, а для трех - пространственная структура. Консервативность остатхов активного центра и укладки полипептидной цепи позволяют предположить, что пирофосфатазы действуют по общему каталитическому механизму. Одной из важных особенностей действия иирофосфатаз являє гея участие в катализе четырех ионов двухвалентных металлов, из которых два связываются с ферментом (в разных по сродству центрах), а остальные привносятся с субстратом. Вероятна роль этих ионов металла практически на всех стадиях каталитической реакции: активация фермента и облегчение связывания субстрата, активация самого субстрата, участие в уходе продуктов и активация молекулы воды для нуклеофильной атаки на атом фосфора. Наибольшую активность пирофосфатазы проявляют в присутствии ионов Mg^+. Ионы марганца связываются в активном центре прочнее, чем ионы магния, но эффективность Мп2+ в качестве активатора меньше.
Несмотря на интенсивные исследования пирофосфатаз различными кинетическими и равновесными методами, многие принципиальные черты их действия остаются пока не понятыми. Невыясненными также остаются также аспекты конформаниопных изменений и возможных пугей реіуляции активности этих конститутивных ферментов.
Для дальнейшего прогресса в понимании механизма функционирования пирофосфатаз представляется необходимым комплексный подход, включающий использование как биохимических, так и структурных методов иселедовашія ферментов.
Цель работы заключалась н выявлении определенных корреляций между структурой и функцией пирофосфатазы E.coli. Для этого предстояло решить следующие задачи:
-
изучить свойства ряда мутантних вариантов пирофосфатазы E.coli с заменами групп активного центра;
-
проанализировать структуры пирофосфатазы E.coli и охарактеризовать систему внутримолекулярных пековалентных взаимодействий;
-
сравнить структуры апофермента, комплексов пирофосфатазы со специфическими лигандамм и структуры мутантных пирофосфатаз.
Научная новизна и практическая ценность работы. В первой части работы изучены мутантные варианты пирофосфатазы E.coli с заменами групп активного центра E20Q, E3!Q, D65N, D67N, D70N, D97N, D102N и K104Q. Показано, что эти мутации приводят к резкому снижению активности без существенного изменения сродства к ионам Mg"+ в активном центре и без значительных изменений в связывании субстрата. Показано также, что введение мутаций изменяет рКи каталитически важных груші фермента, причем их величины в одних случаях становятся меньше, а в других - больше.
Изучение свойств мутантного варианта пирофосфатазы D42N, единственной известной мутантной пирофосфатазы, активность которой превосходит активность нативного фермента почти втрое, позволило высказать предположение, что остаток D42 расположен вблизи центра связывания ионов Mg~+ наименьшего сродства и важен для ориентации остатков, принимающих участие в связывании этого иона Mg"^ и пирофосфата.
Разработан оригинальный спсктрофотомстрический метод определения констант
диссоциации комплексов пирофосфатазы с Mg в центре низкого сродства. Показано, что причиной появления дифференциальных спектров поглощения является ионизация одного из остатков тирозина в составе пирофосфатазы при связывании иона Mg21" в этом центре. На основании спектрофотометрического титрования пирофосфатазы высказано предположение об участии остатка D70 в связывании иона Mg * в центре низкого сродства; это предположение нашло подтверждение в данных рентгеноструктурного анализа. Предложенным методом были охарактеризованы центры связывания ионов магния пирофосфатазы E.coli и ее мутантных вариантов.
Впервые был проведен сравнительный анализ структур апофермента пирофосфатазы E.coli и ее комплексов с ионом Мп2+, с ионами Mg + и с сульфат-ионом. Охарактеризована система нековалентных взаимодействий в молекуле апофермента, ее изменение и смещение участков полипептидной цепи при связывании специфических лигандов; что в ряде случаев приводит к возникновению асимметрии субъединиц фермента. Выявлены существенные изменения структуры пирофосфатазы при введении мутаций D42N, D65N, D70N и D97N в активный центр. Перестройки молекулы фермента и взаимное влияние субъединиц могут лежать в основе регуляции активности пирофосфатаз.
Апробация работы. По теме диссертации опубликованы 3 работы, 1 находится в печати, еще 2 в процессе подготовки.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав и выводов. Глава первая - обзор литературы, посвященный результатам исследования активного центра пирофосфатаз. Глава вторая - обсуждение результатов. Глава третья -экспериментальная часть.
