Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Гидрогеназы - биологические катализаторы образования молекулярного водород 13
1.1. Гидрогеназы 13
1.1.1. Водород - уникальный субстрат гидрогеназ - идеальное газообразное топливо 13
1.1.2. Особенность строения активного центра гидрогеназ 14
1.2. Автокаталитический характер реакции восстановления метилвиологена водородом в присутствии гидрогеназ 18
1.2.1. Кинетика реакции с профермент-ферментным взаимодействием. Бимолекулярный механизм активации .
1.2.2. Автокаталитическое ускорение продуктом ферментативной реакции
1.3. Влияние эффекторов на гидрогеназную активность 33
1.3.1. Кинетический метод оценки констант нестойкости комплекса фермента с ионами железа 34
1.3.2. Гидрогеназной активности комплексо-нами железа 36
1.3.3. Активация гидрогеназ ионами никеля 42
1.4. Иммобилизация и свойства иммобилизованной
гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicina 46
1.4.1. Иммобилизация гидрогеназы на неорганическое стекло 46
1.4.2. Иммобилизация гидрогеназы на полиакрилонитрил 47
1.4.3. Иммобилизация гидрогеназы на сополимер терефтале-вого диальдегида и п-фенилендиамина 49
ГЛАВА 2. Термофильная водородоовразующая культура 52
2.1. Образование водорода микроорганизмами 52
2.2. Исследование метаболизма термофильной водородообразуїощей культуры 57
2.3. Исследование влияния эффекторов на метаболизм водородообразуїощей культуры 65
2.3.1. Зависимость кинетических параметров метаболизма водородообразуїощей культуры от концентрации субстрата 65
2.3.2. Влияние концентрации ионов водорода на метаболизм водородообразуїощей культуры 69
2.3.3. Влияние продуктов метаболизма водородообразуїощей культуры на кинетические параметры её роста 71
2.4. Непрерывное культивирование водородообразуїощей 79
культуры
ГЛАВА 3. Кинетические закономерности образования метана метаногенной ассоциацией М. kuzneceovii 64
3.1. Биогенез метана 84
3.1.1. Метаногенные бактерии 84
3.1.2. Проблемы практического использования и промышленного получения биометана 89
3.2. Кинетические закономерности образования метана клетками метаногенной ассоциации М. kuzneceovii 93
3.2.1. Нестационарная кинетика восстановления углекислого газа в метан клетками метаногенной ассоциации 94
3.2.2. Влияние органических кислот на образование метана клетками метаногенной ассоциации 98
3.2.3. Образование этилена метаногенной ассоциацией Methanobacillus kuzneceovii 106
3.3. Непрерывное культивирование термофильной метаногенной ассоциации Methanobacillus kuzneceovii НО
3.4. Кинетические закономерности и механизм конверсии глюкозы в метан метаногенной ассоциацией 118
3.4.1. Конверсия глюкозы в метан в атмосфере аргона 118
3.4.2. Конверсия этилового спирта в метан 129
3.4.3. Конверсия уксусной кислоты в метан 130
3.4.4. Конверсия углекислоты в метан 135
3.5. Математическое моделирование процесса конверсии
глюкозы в метан метаногенной ассоциацией 138
Ферментативная и радиационная обработка субстрата /биомассы/ для получения газообразного топлива 149
4.1. Влияние целлюлазной обработки на конверсию биомассы в метан
4.2. Влияние ионизирующего облучения субстрата на конверсию биомассы в метан 154
4.2.1. Биоконверсия биомассы азоллы в метан 154
4.2.2. Биоконверсия биомассы хлореллы в метан 158
4.2.3. Биоконверсия других субстратов в метан 162
4.3. Влияние ионизирующего облучения на конверсию биомассы в водород 164
4.4. Образование метана природной метаногенной ассоциацией 172
4.4.1. Биоконверсия целлюлозосодержащего сырья в метан природной метаногенной ассоциацией 172
4.4.2. Биоконверсия сахарозы в метан природной метаногенной ассоциацией 174
ГЛАВА 5. Бйоконверсия солнечной энергш в газообразное топливо /водород, метан/ на основе дох сопряженных по метаболитам культур микроорганизмов 179
5.1. Основные теоретические аспекты биофотолиза воды 180
5.1.1. Биофотолиз воды в модельных системах с переносчиками электронов 181
5.1.2. Биофотолиз воды в системах микроорганизмов 185
5.2. Биофотолиз воды на основе системы двух микро организмов, сопряженных по метаболитам
5.2.1. Система биофотолиза воды: "Цианобактерия/синезеленая водоросль/ - термофильная водородообразующая бактерия" 187
5.2.2. Система биофотолиза воды: "фотосинтезирующая водоросль - термофильная водородообразующая бактерия" 197
5.3. Преобразование солнечной энергии в метан, основанное на системе "Фотосинтез- метаногенез" 201
- "Биофотометан"
5.3.1. Система биофотометана: "Фотосинтезирующая водоросль - термофильная метаногенная ассоциация" 202
5.3.2. Система биофотометана: "Цианобактерия /зеленая водоросль/ - термофильная метаногенная ассоциация" 205
ГЛАВА 6. Методы исследования . 208
6.1. Анализ образующихся газов 208
6.1.1. Измерение водорода 208
6.1.2. Разделение водорода, метана и углекислого газа 210
6.1.3. Анализ метана и метана при низких концентрациях 210
6.1.4. Анализ летучих продуктов в жидкой фазе 213
6.2. Методы исследования ферментов - гидрогеназ 217
6.2.1. Определение активности гидрогеназ по восстанов-влению метилвиологена водородом 217
6.2.2. Определение активности гидрогеназ по выделению водорода 217
6.2.3. Исследование влияния эффекторов на гидрогеназных активность 218
6.3. Методы исследования метанообразования 219
6.3.1. Выращивание термофильной метаногенной ассоциации М. kuzneceovii 219
6.3.2. Получение бесклеточного экстракта термофильной метаногенной ассоциации М. kuzneceovii 220
6.3.3. Методы исследования кинетики метанообразования клетками метаногенной ассоциации М. kuzneceovii 221
6.3.4. Исследование этиленообразования клетками метаногенной ассоциации М. kuzneceovii 221
6.3.5. Исследование кинетических закономерностей конверсии биомассы в метан метаногенной ассоциацией М. kuzneceovii 221
6.3.6. Непрерывное культивирование термофильной метаногенной ассоциации М. kuzneceovii 222
6.4. Методы исследования водородообразующей культуры 223
6.4.1. Конверсия глюкозы водородообразующей культурой 223
6.4.2. Непрерывное культивирование водородообразующей культуры 225
6.5. Метода иммобилизации 225
6.5.1. Молекулярная сшивка с помощью полифункциональных реагентов 1,3,5-трибензальдегида и терефта-левого диальдегида 225
6.5.2. Ковалентное присоединение фермента к пористому неорганическому стеклу 226
6.5.3. Иммобилизация гидрогеназы на модифицированной матрице полиакрилонитрила 227
6.5.4. Модифицирование полиакрилонитриловых образцов 228
Выводы 229
Список литературы
- Водород - уникальный субстрат гидрогеназ - идеальное газообразное топливо
- Проблемы практического использования и промышленного получения биометана
- Биоконверсия биомассы азоллы в метан
- Система биофотолиза воды: "Цианобактерия/синезеленая водоросль/ - термофильная водородообразующая бактерия"
Введение к работе
Прогрессирующий дефицит ископаемых топлив ставит ряд проблем, связанных с поиском и технологическим освоением новых источников и новых способов преобразования энергии. Большие перспективы имеет солнечная энергия, одним из достоинств которой является экологическая чистота и практически бесконечные резервы. В настоящее время разрабатываются различные способы преобразования солнечной энергии. Одним из них является биологическая конверсия биомассы - продукта фотосинтеза - в газообразное топливо (водород, метан) (рис. I).
В последнее десятилетие значительное развитие получают биотехнологические методы получения газообразного и жидкого топлива. В первую очередь речь идет о системах конверсии целлюлоз ос содержащего сырья, о системах получения водорода биологическим путем, о создании замкнутых биосистем фоторазложения воды на водород и кислород (биофотолиз воды).
Разработка биотехнологических способов получения топлив связана с изучением кинетики и механизмов процессов, протекающих с участием биокаталитических систем.
Проблемамизучения кинетических закономерностей реакций получения водорода и метана биокаталитическими системами различного уровня организации посвящена данная диссертационная работа.
Цель исследования - создание кинетических основ конверсии энергии с использованием ферментов и микроорганизмов.
Кинетические исследования проводились с системами различной степени сложности. Первоначально изучались гидрогеназы -принципиально важные ферменты активации и использования водорода. Окислительно-восстановительные реакции с участием гидроге- І ф І % -*. БИОМАССА
ФОТОСИНТЕЗ
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ
РАСТВОРИМЫЕ сн3соон сн, углЕвода
АЦЕТОГЕНЕЗ
МЕТАНОГЕНЕЗ
Рис.I. Схема преобразования солнечной энергии в газообразное топливо /водород, метан/. наз играют важную роль в ряде биохимических процессов, например, образование молекулярного водорода под действием световой энергии у ряда фотосинтезирующих микроорганизмов. Разработка систем преобразования солнечной энергии путем биоконверсии биомассы - продукта фотосіштеза в биогаз непрерывно связана с изучением биохимических особенностей гидрогеназ, кинетики и механизма их действия.
Следующим этапом работы был переход к новому, содержащему высокоактивную гидрогеназу, термофильному микроорганизму - во-дородообразующей бактерии, выделенной из гидротерм Камчатки. Исследование динамических и кинетических закономерностей механизма образования водорода является основным вопросом практического применения этой культуры для создания системы биофотолиза воды на водород и кислород.
Третьим этапом исследования был поиск закономерностей роста микробных популяций на примере метангенерирующей ассоциации, включающей водородобразующую бактерию.
Метаногены - анаэробные бактерии, которые в ассоциации с другими микроорганизмами конвертируют биомассу в метан. Изучение динамических и кинетических закономерностей механизма образования метана метаногенами и некоторых основных биотехнологических вопросов его получения являются фундаментальными проблемами химико-биотехнологического характера. Развитие последних необходимо для создания обоснованных представлений об интенсификации процесса и его практического применения с целью преобразования солнечной энергии в газообразное топливо.
Завершающий этап исследований был посвящен созданию систем получения газообразного топлива на основе культур микроорганиз- - II - мов, сопряженных по метаболитам. Были разработаны системы конверсии солнечной энергии в водород и кислород и в метан.
Задачи исследования включали:
Изучение кинетики и механизма катализа гидрогеназами, разработка способа иммобилизации и частичной стабилизации ферментов.
Изучение кинетических закономерностей развития термофильной водородообразугощей бактерии - нового биокатализатора для получения топлив. Изучение некоторых свойств культуры: соотношение продуктов метаболизма, скорость роста, скорость образования продуктов в зависимости от концентрации субстрата, от концентрации ионов водорода и от температуры. Изучение условий непрерывного культивирования и кинетических закономерностей образования этанола, уксусной кислоты, водорода и углекислого газа в зависимости от температуры, скорости разбавления и рН. Определение параметров, оптимальных для синтеза соответствующих продуктов и максимальной скорости газовыделения.
Изучение кинетических закономерностей метанообразова-ния симбиотрофной термофильной метаногенной ассоциацией, в том числе, влияния карбонових кислот на выделение метана из внутриклеточных субстратов. Изучение биоконверсии глюкозы в метан метаногенной ассоциацией в качестве модельной системы для исследования анаэробной конверсии биомассы. Выявление наиболее важных химических реакций и построение кинетической схемы процесса метанообразования.
Исследование биотехнологических вопросов процесса метанообразования с целью его промышленного применения; и методов обработки биомассы фотосинтетиков с целью интенсификации процесса получения газообразного топлива.
5. Исследование возможности создания биологического цикла преобразования солнечной энергии в энергию биогаза на основе комбинированной системы "фотосинтез - метаногенез" и "биофотолиз воды". - ІЗ -
Водород - уникальный субстрат гидрогеназ - идеальное газообразное топливо
Водород является одним из наиболее "простых" субстратов, что создает основу для количественной физико-химической интерпретации эффектов, наблюдаемых с этим субстратом в актах катализа. Исследование механизма активации водорода гидрогеназами, возможно, позволит сделать важные выводы о фундаментальных причинах, обусловливающих природу ускорений ферментами окислительно-восстановительных реакций.
Водород является важным реагентом в химическом синтезе. Это один из наиболее сильных и "чистых" восстановителей. Исследование свойств и особенностей гидрогеназ позволяет надеяться разработать эффективные катализаторы гидрирования - дегидрирования на основе использования принципов действия гидрогеназ, или, непосредственно, на основе использования ферментов этого класса, иммобилизованных на различных матрицах.
Развитие современной энергетики делает водород наиболее перспективным синтетическим топливом. Водород - достаточно энергоемкое соединение. В расчете на единицу веса он превосходит все соединения, могущие служить в качестве топлива. По энергоемкости на единицу веса водород в 2,6 раза превосходит природный газ, в 3,3 раза - жидкие углеводороды нефти, в 6,6 раз -метанол, в 8,3 раза - природный продукт фотосинтеза - целлюлозу
Водород - экологически "чистое" топливо, не вызывающее загрязнения окружающей среды. Практически единственным продуктом сгорания водорода является вода. Полностью отсутствуют характерные для углеводородных топлив загрязняющие атмосферу соединения, такие как углекислота, окись углерода, двуокись серы, пары углеводородов и т.д. Единственным обнаруженным побочным продуктом при сгорании водорода на воздухе является окись азота, но это соединение образуется в ничтожных количествах. При условии получения водорода из воды энергетика, использующая в качестве топлива водород, в отличие от энергетики на основе углеводорода, является замкнутой /1,3/.
Особенностью водорода является возможность эффективного преобразования энергии топлив в электроэнергию с использованием электрохимических генераторов (топливных элементов), КПД преобразования энергии в разработанных уже в настоящее время топливных элементах достигает 40-80% /1,4/.
Преимущества энергетики, основанной на использовании водорода, достаточно очевидны. Однако, на пути реализации этой идеи предстоит решить ряд принщшиальных научных и технических задач, одной из которых является поиск пути получения водорода.
Очевидно, что в настоящее время реализуется несколько путей получения водорода, в рамках нашей работы рассматривается получение водорода микроорганизмами, в которых участвует ферментная система - гидрогеназа.
Особенность строения активного центра гидрогеназ Имеющиеся в настоящее время факты дают основание предполагать, что гидрогеназы обладают свойствами, близкими к свойствагл негеминовых железопротеинов, функционирующих в качестве перенос - 15 чиков электронов при некоторых биохимических процессах, названных ферредоксинами ж для каталитической активности гидрогеназ важнейшее значение имеют ионы железа /5,6/. Найдено, что добавление иона железа к ферменту заметно повышает аго активность /7,8/ и активность бесклеточных препаратов гидрогеназ сильно подавляется такими соединениями, образущими комплекс с железом, как 8-оксихинолин, нитрат, О-фенантролин, ОІ -дшщридил, цианид, кислород /9-15/.
Доказательством участия негеминового железа в активном центре гидрогеназ является то, что гидрогеназы имеют максимум поглощения в области 408-410 нм /15-20/. Это поглощение на 408 нм характерно для ряда железо-сульфо-протеинов /21-24/.
Б настоящее время одной из наиболее изученной в биохимическом плане гидрогеназой является фермент из т. roseopersicina. Спектр поглощения гомогенного препарата этого фермента имеет максимум- при 280 тл и характерный для белков, содержащих негеми-новое железо , максимум в области 400-410 нм. При добавлении ди-тионита натрия имеет место снижение поглощения в этой области на 15$, что также указывает на наличие в составе гидрогеназы негеминового железа /25-27/.
Проблемы практического использования и промышленного получения биометана
При получении метана энергия солнца переходит в доступное для использования топливо и химическое сырье.
Микробиологическое получение метана имеет ряд преимуществ. Во-первых, сырьем для получения метана служат разнообразные органические остатки: отходы сельского хозяйства (солома, ботва, трава, листья, отходы животноводства и птицеводства), отходы пищевой, текстильной и других отраслей промышленности, отходы коммунального хозяйсива, сточные воды. Почти все органические остатки в большей части состоят из целлюлозы, легко поддающейся анаэробному разложению с образованием метана. Лигнин, составляющий 30% массы растений и неразлагающийся в анаэробных условиях, необходимо предварительно обработать при температуре до 200 и при рН ІЗ. В этих условиях лигнин разлагается с образованием циклических продуктов гидроксилирования, которые затем могут быть сброжены бактериями. При этом выход метана увеличивается на 40% и на 18% снижаются твердые отходы . Микробиологическое получение метана может быть экономически выгодным даже в случае использования органического материала с малой концентрацией распределения его в воде
Во-вторых, коэффициенты конверсии энергии в системах получения метана из органического сырья весьма высоки. Получение метана микробиологическим путем происходит с коэффициентом эффективности по углероду 94%, тогда как получение метана при газификации биомассы термическим путем протекает с коэффициентом эффективности 30-50% /378/. Так как углеводы могут быть переведены в метан в оптимальном случае по уравнению: то в соответствии с этой реакцией может происходить диспропор-ционирование углевода и значительное концентрирование энергосодержания в метане, потеря тепла при этом будет пренебрежимо мала (2-3%). Если же полисахариды разлагаются до углекислоты и воды по уравнению биологического распада веществ /155/:
(С6Н1005)п+п02 ПСО2+ п%0 + X ккал., то потери тепла с каждой тонны составляют 3,5 10 ккал. Получение метана микробиологическим путем выгодно по энергии. Например, восстановление углекислоты в метан водородом в присутствии неорганического катализатора - никеля, требует температуры от 450 до 500 /379/, в то время как восстановление микробиологическим путем в присутствии метанобактерий требует температуры лишь 25-35 (для мезофильных бактерий) или 50-65 (для термофильных).
В-третьих, полученный в метановом брожении биогаз, легко использовать. Он состоит на 54-80% из метана, 20-45% из углекислого газа, 1-10% сероводорода и 0-10% водорода /360/. Биогаз можно не очищать от углекислоты. Работающие на биогазе тракторы, автомашины и двигатели электростанций не загрязняют окружающей среды. В сжатом виде (до 200-250 атм.) биогаз пригоден как горючее для тракторов и автомашин, а при низком давлении (100-200 мм ртутного столба) или до 15% содержания в смеси - для любой газовой аппаратуры: печей, плиток, котельных, холодильников и т.п. Биогаз тлеет большую теплотворную способность - 6«1Сг ккалДг, октановое число II0-II5 при нижнем пределе температуры вспышки 645С /155/.
В-четвертых, при получении метана микробиологическим способом источник топлива оказывается вблизи крупных производств, что увеличивает их автономность и сокращает расходы на транспортировку топлива или электроэнергии по газопроводам или линиям электропередач к относительно мелким потребителям.
В-пятых, метановое брожение является наиболее радикальным и эффективным способом очистки сточных вод, что весьма существенно для решения крупнейших современных экологических проблем охраны окружающей среды и регенерации воды. Проблема "чистой воды" - одна из важнейших современных технических и экологических проблем. Метановое брожение снижает содержание в воде органических веществ в 10 раз и превращает их в доступное топливо. Преимущество анаэробного разложения наиболее очевидно при высоких концентрациях органических веществ, от 2% и выше, и обходится этот способ вчетверо дешевле аэробных /380/. Кроме этого, метановое брожение осуществляет санитарную обработку сточных вод, уничтожая яйца гельминтов, вредную микрофлору и семена сорняков.
В-шестых, использование метанового брожения навоза позволяет наилучшим способом сохранить его свойства как удобрения, приводит к полной минерализации азота и фосфора. Например, потери азота после ферментации навоза составляют лишь 2%, а после гниения - от 14 до 50$ /155/, а потери углерода - до 50$. При метановом брожении отходов можно наряду с биогазом получать ценные биологические соединения /381/ такие, как витамин В- /382,383/ и реагенты для химической промышленности /355,384,385/
Все вышеизложенное позволяет считать биогаз одним из лучших видов горючего, получение которого технически не сложно, а применение - экономически выгодно.
Биоконверсия биомассы азоллы в метан
Таким образом, в работе была показана возможность использования фотосинтезирующих водорослей в качестве субстрата для метаногенеза. Однако существенным недостатком процесса является низкая скорость процесса и относительно малые выходы метана.
Как известно, метанообразующие бактерии, входящие в состав термофильной метаногенной ассоциации , использованной в данной работе, образуют метан из углекислого газа и водорода /387/, которые образуются при разложении биомассы ацетогенной фазой ассоциации. По-видимому, ацетогеиная фаза, входящая в состав метаногенной ассоциации, не обладает целлюлазной активностью, что вызывает большой лаг-период разложения биомассы на углекислый газ и водород, а следовательно, и большой лаг-период в образовании метана и его незначительны выход.
В связи с этим проводили предварительную обработку культуры водорослей целлюлазным комплексом Пектофоетидином ГІ0Х при температуре 40, рН 4,0-4,5 в течение 24 часов. Процесс контролировали по количеству образовавшейся глюкозы, концентрация которой к концу гидролиза составляла 0,034% (табл. 4.1). Метановое брожение на гидролизате проводили аналогично брожению на необработанных водорослях. Результаты показали , что предварительная обработка клеток водорослей целлюлозолитическим комплексом снижает лаг-период образования продуктов, повышает скорость образования метана в 2 раза и коэффициент преобразовашш энергии от 10-15% до 20-23% за 20 дней работы.
Влияние гидролиза на выход метана, по-видимому, связано с повышением количества глюкозы в культуральной среде вследствие гидролиза. Чем больше время гидролиза, тем выше выход метана при ферментации биомассы хлореллы (рис. 4.2).
Была показана возможность предварительной обработки водорослей гидролитическими ферментами для ускорения процесса образования метана и для увеличения его выхода.
При преобразовании солнечной энергии в энергию биогаза важно найти подходящий эффективный "медиатор", который, с одной стороны, имеет высокий коэффициент преобразования солнечной энергии в энергию биомассы, с другой стороны, легко конвертируется в газообразное топливо. В этом отношении использование биомассы азоллы имеет большие перспективы /414-416/. Во-первых, в странах с субтропическим климатом, например, во Вьетнаме,где средняя температура воздуха в самое холодное время (январь, февраль) не ниже 15-17, азолла имеет высокий энергетический КПД (5,5-6,5$), следовательно, большую продуктивность биомассы: 400-500 Т сырой азоллы с одного гектара в год /417/. Во-вторых, биомасса азоллы богата углеводами, содержание которых колеблется в пределах 35-39% по весу. В состав углеводов в основном входят легкоусвояемые сахар и крахмал. Доля крахмала составляет 65% от общего содержания углеводов, доля моносахаридов - 20% /418/. Поэтому биомасса азоллы легко подвергается ферментации и является перспективным медиатором для системы преобразования солнечной энергии в энергию биогаза.
Экспериментальные данные показали, что анаэробное разложение биомассы азоллы представляет собой типичную картішу метано-генеза. Сначала в газовой фазе с небольшим периодом индукции 1-2 часа идет накопление водорода и углекислого газа, а затем с периодом индукции 50-60 часов идет экспоненциальное образо-вание метана, причем, концентрация водорода в газовой фазе резко падает из-за расходования его на образование метана (рис. 4.3). Таким образом, как и в типичном процессе метаногенеза, первоначально идет разложение азоллы ацетогенной культурой, входящей в состав метаногенной ассоциации, на промежуточные соединения - водород, углекислоту. При достаточно большом количестве посевного материала (10%) ферментация азоллы проходит практически без лаг-периода. В газовой фазе обнаружены метан, углекислота и водород, причем последний в малом количестве (1 10 ). К концу процесса ферментации 10 г азоллы (10% по весу) в жидкой фазе были обнаружены уксусная, пропионовая и масляная кислоты (0,047, 0,0025 и 0,0067%, соответственно).
Система биофотолиза воды: "Цианобактерия/синезеленая водоросль/ - термофильная водородообразующая бактерия"
Показано, что дотирование электронов происходит на уровне фотосистемы I и определенная часть водорода образуется без участия фотосистемы П. Это было подтверждено в опытах с мутантами зеленых клеток, лишенными фотосистемы П, в которых наблюдается эффективное выделение водорода /438/, и в опытах с диуроном, который при концентрации КГМ подавляет выделение кислорода в фотосистеме П, практически не затрагивая выделения водорода.Из этого видно, что фотовыделение водорода в биосистемах существенно изменяется, если действуют на процесс донирования электронов на уровне фотосистемы I. Это показано также в опытах Гаф-фрона, при которых выделение водорода сильно стимулируется введением органических соединений1, таких как глюкоза. При условии, что донором электронов является вода на уровне фотосистемы П, можно было бы ожидать стехиометрического разложения воды и осуществления реакции биофотолиза воды. Надо отметить то обстоятельство, что восстановленный виологен активно реагирует с кислородом (окисляется) с образованием перекиси, поэтому возникают трудности при наблюдении восстановления виологена и в стационарном режиме обычно не удается наблюдать одновременно стехиометрического выделения кислорода и водорода.
В лаборатории Красновского /427,428/ было обнаружено фотовыделение водорода хлоропластами в присутствии гидрогеназы, однако не удалось наблюдать одновременно идущего выделения водорода и кислорода. Наблюдается либо реакция Хилла - фотовыделе ниє кислорода воды, сопряженное с восстановлением экзогенных акцепторов электрона, - либо выделение водорода с использованием экзогенных доноров электрона. Для эффективного наблюдения выделения водорода предполагается либо инактивировать выделение кислорода (работу фотосистемы П), например, нагреванием, либо вводить в суспензию хлоропластов систему, потребляющую кислород. Пршленяли такие системы поглощения кислорода в процессе фотовосстановления метилвиологена с выделением водорода: цисте-ин и дихлорфенолиндофенол /445/: глюкоза и глюкозооксидаза /449/; этанол и каталаза /450,451/; гидразин /452/. Экспериментально были созданы некоторые системы биофотолиза воды, которые представляют собой хлоропласти высших растений, переносчик электронов (ферредоксин или метилвиологен) и бактериальные гидрогеназы. В этих системах скорость выделения водорода варьировалась от 10 до ТО""1 шаль й-)/час на мг хлорофилла /433-435,453-456/.
Определенная возможность использования микроорганизмов для выделения водорода из воды была открыта еще в 1942 году /88/.
Принципиально биофотолиз воды, основанный: на системах микроорганизмов, разделяется на две стадии. В первой стадии под действием света происходит разложение воды с выделением кислорода:
Принципиально возможно использовать для целей биофотолиза воды системы из двух культур микроорганизмов /122/. Несколько упрощенную схему процесса, в которой реакция фотораз-ложения воды на водород и кислород проводится на основе использования двух, сопряженных по метаболитам, культур микроорганизмов, можно представить в таком виде /377/:
Первая стадия процесса - фотосинтез микроскопическими водорослями. Ацетат может служить источником углерода для микроскопических водорослей и включается в метаболические циклы на уровне трикарбоновых кислот /457/.
Вторая стадия - темповая реакция - эффективно осуществляется анаэробншли продуцентагли водорода типа Clostridium /377/. Суммарным процессом цикла является фотолиз воды (уравнение 2.1).
Была показана принципиальная возможность осуществления реакции биофотолиза воды при использовании культур микроорганизмов. Например, была продемонстрирована реакция фотообразования водорода клетками С. butyricum - продуцентом водорода - при использовании в качестве истоника углеводов продуктов метаболизма различных фотосинтезирующих микроскопических водорослей: Anabaena variobilis, Ankistrodesmus braunii, Chlorella fusca, Chlorella pyrenoidosa, Chlamydomonas girus,
Scenedesmus obiiquenes. в этих системах выход водорода с предварительной обработкой микроводорослей целлкшазой достиг 10% /377/
Реакцию биофотолиза воды осуществляли в двух связанных между собой системах. В первой - фотосинтетическом реакторе -осуществляется фотосинтез водорослями с выделением кислорода. Во второй - ферментере - осуществляется темновая реакция выделения водорода водородобразующей культурой из метаболитов водоросли . Две системы связаны так, что продукт фотосинтеза -биомасса - служит субстратом для водородообразования; продукт водородообразования - метаболиты служат источником углерода для фотосинтеза. Кислород из первой системы и водород из второй отдельно собраны в разных емкостях (рис. 5.2). Перед тем как связать две системы, было проведено их предварительное исследование.
