Введение к работе
Актуальность проблемы. NAD+ и NADP+ - коферменты, играющие огромную роль во всех живых клетках. NADP+ отличается от NAD+ всего лишь тем, что 2'-гидроксильная группа рибозы аденозина в молекуле NADP+ заменена остатком фосфорной кислоты. Однако в живых клетках NAD+ и NADP+ выполняют принципиально различные функции. NADPH используется в организме в реакциях синтеза различных соединений, a NAD+, напротив, участвует преимущественно в окислительных процессах, и полученный NADH расходуется на удовлетворение энергетических потребностей клетки. Подавляющее большинство ферментов, катализирующих реакции с участием NAD+ и NADP+, высокоспецифичны по отношению к определенному коферменту и лишь немногие дегидрогеназы проявляют близкую активность с NAD+ и NADP+. Это позволяет клетке осуществлять раздельную регуляцию процессов получения NADH, необходимого для синтеза АТР, и синтеза различных соединений с участием NADPH. Таким образом, реакции, катализируемые NAD+- и ЫА0Р+-зависимыми дегидрогеназами, представляют собой прекрасный пример реализации механизма высокоспецифичного молекулярного распознавания близких по структуре соединений.
ЫА0+-зависимая формиатдегидрогеназа (КФ 1.2.1.2) катализирует окисление формиат-иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD+ до NADH. Среди большого разнообразия ФДГ отдельную группу образуют ферменты, состоящие из двух идентичных субъединиц и не содержащие ионов металлов и простетических групп. ФДГ этой группы принадлежит к суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксиксилот. ФДГ катализирует очень простую реакцию, механизм которой включает только гидридный перенос без стадии кислотно-основного катализа. Субстрат этой реакции - формиат-ион - одно из простейших органических соединений. Поэтому ФДГ рассматривается как модельный фермент для изучения структуры и механизма действия всего суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксикислот. Наиболее изученным ферментом среди ФДГ данной группы является формиатдегидрогеназа из бактерий Pseudomonas sp.101 (РвеФДГ*). Для ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 в банке данных трехмерных структур PDB имеется несколько структур высокого разрешения как для апо-, так и для
* В данной работе приняты следующие сокращения: ФДГ - формиатдегидрогеназа, РэеФДГ - ФДГ из Pseudomonas sp.101, АгаФДГ - Arabidopsis thaliana, СЬоФДГ - Candida boidinii, БсеФДГ -Saccharomyces cerevisiae, БоуФДГ - сои Glycine max, NAD+ и NADH -окисленная и восстановленная формы никотинамидадениндинуклеотида, NADP+ и NADPH - окисленная и восстановленная формы никотинамидадениндинуклеотидфосфата.
холофермента. В нашей лаборатории методом направленного мутагенеза были получены различные мутантные РэеФДГ с измененной коферментной специфичностью, с повышенной химической и температурной стабильностью. Вторая по изученности ФДГ - фермент из дрожжей Candida boidinii. Для нее в 2007 году была опубликована структура апо-фермента и получены мутантные формы с повышенной температурной и химической стабильностью, но по своим свойствам эти мутанты значительно уступают мутантным ФДГ из Pseudomonas sp.101 (Tishkov V.I. ,2006).
Плохая изученность ФДГ из растений связана с тем, что выход этого фермента из природных и трансгенных растений очень низок, а экспрессия в E.coli приводила к образованию телец включения. Проблема экспрессии растительных ФДГ в клетках E.coli в активной и растворимой форме была решена в нашей лаборатории в конце 2004 г., когда были созданы рекомбинантные штаммы-продуценты для ФДГ из растений Arabidopsis thaliana и Glycine max. Их наличие сделало возможными исследования ФДГ из растений методом направленного мутагенеза.
Все природные ФДГ высокоспецифичны к NAD+. Однако формиатдегидрогеназы из различных источников отличаются по степени специфичности к NADP+. Наибольшую коферментную специфичность к NAD+ по сравнению с NADP+ проявляет ФДГ из дрожжей Saccharomyces cerevisiae (эффективность катализа с NAD+ в 3,0x109 раза больше, чем с NADP+). В случае ФДГ из Pseudomonas sp.101 эффективность катализа с NADP+ выше и уступает эффективности катализа с NAD+ только в 2400 раз. Данные о коферментной специфичности растительных ФДГ в литературе отсутствуют.
В нашей лаборатории были получены мутанты ФДГ из Pseudomonas sp.101, специфичные к NADP+. Однако оказалось, что первая генерация мутантов имеет узкий рН-оптимум связывания кофермента в щелочной области (до рН 7,4). Получение второй генерации мутантов позволило расширить рН-оптимум связывания кофермента до рН 9,0. Для практического применения необходимо расширение рН-оптимума связывания NADP+ до рН 10,0. Для ФДГ из Candida boidinii также был получен ЫА0Р+-зависимый фермент, кинетические свойства и термостабильность которого значительно (на порядок и более) хуже по сравнению с таковыми для ЫА0Р+-зависимых ФДГ из Pseudomonas sp.101. Для растительных ферментов данных об изменении коферментной специфичности нет.
Таким образом, проблема детального исследования коферментной специфичности ФДГ методом направленного мутагенеза является важной фундаментальной и практической задачей.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было:
Получение мутантов ЫАОР+-зависимой РвеФДГ с расширенным рН-опти-мумом связывания кофермента в диапазоне рН 7,0-10,0. Как уже отмечалось выше, ранее в нашей лаборатории были получены ЫА0Р+-зависимые РвеФДГ, эффективно связывающие кофермент при рН не выше 9,0.
Повышение продуктивности генетических конструкций для экспрессии ЫА0Р+-зависимых РвеФДГ. Использованные ранее штаммы-продуценты E.coli обеспечивали низкий уровень экспрессии выход мутантных ЫА0Р+-зависимых РвеФДГ (не более 1-2% от общего растворимого белка клетки). Для применения новых мутантных ФДГ на практике необходимо было повысить уровень их экспрессии.
Повышение химической и температурной стабильности ЫА0Р+-зависимых мутантов РвеФДГ. Ранее были получены мутанты ЫАО+-зависимой РвеФДГ с увеличенной температурной и химической стабильностью. Решено было объединить в одном мутанте замены, обеспечивающие специфичность РвеФДГ к NADP+, с заменами, увеличивающими химическую и температурную стабильность РвеФДГ.
Получение ЫА0Р+-зависимых мутантов ФДГ из растений резуховидки Таля Arabidopsis thaliana и сои Glycine max. В литературе данные о коферментной специфичности растительных ФДГ, и, тем более, о создании ЫА0Р+-зависимых форм ФДГ из растений отсутствуют.
Научная новизна. В данной работе были созданы подходы, позволяющие с помощью направленного мутагенеза расширить рН-оптимум связывания кофермента ЫА0Р+-зависимыми мутантами РвеФДГ. Было показано, что возможно независимое объединение мутаций, которые обеспечивают улучшение различных свойств РвеФДГ - повышенную температурную и химическую стабильность, с одной стороны, и специфичность к NADP+, с другой. Таким образом, мы продемонстрировали аддитивность таких мутаций.
Полученные данные свидетельствуют о том, что с помощью всего одной аминокислотной замены можно на порядок повысить сродство растительных ФДГ из A.thaliana и G.max к NADP+. Таким образом, впервые были получены ФДГ из растений с измененной коферментной специфичностью. В результате проведенных экспериментов было показано, что подход к изменению коферментной специфичности, разработанный в нашей лаборатории в приложении к бактериальным ФДГ, универсален и его можно использовать для изменения коферментной специфичности ФДГ из эволюционно далекого источника (растений).
Практическая значимость работы. Формиатдегидрогеназа используется в процессах синтеза оптически активных соединений с участием NAD(P)+-зависимых дегидрогеназ в качестве фермента, способного регенерировать кофермент. Полученная нами ЫА0Р+-зависимая форма биокатализатора была успешно испытана в ряде зарубежных лабораторий.
Создание высокоэффективных штаммов-продуцентов рекомбинантной ЫАОР+-зависимой ФДГ из бактерий и растений дает основу для разработки процессов получения ЫА0Р+-зависимых мутантов ФДГ в больших количествах.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих Международных и российских конференциях: 1-й Международный Конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2002), 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, Россия, 2003), Конференция «И.В.Березин - 80 лет» (Москва, Россия, 2003), Международная конференция «Ломоносов - 2006» (Москва, Россия, 2006), 4-й Международный Конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007), III Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 6 тезисов докладов конференций. Обе статьи опубликованы в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, опубликованный на сайте ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит 119 страниц печатного текста, 25 рисунков, 20 таблиц и 150 ссылок.
