Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .
1.1. Омега-3 жирные кислоты в системе сердечно-лёгочной патологии 9
1.2. Механизмы действия омега-3 жирных кислот . 16
Глава 2. Материалы и методы исследования . 29
Глава 3. Результаты экспериментального исследования...
3.1. Экспериментальные диеты и их влияние на вес тела 48
3.2. Влияние экспериментальных диет на липиды плазмы и липопротеины 49
3.3. Эффекты экспериментальных диет на развитие атеросклероза 52
3.4. Воздействие экспериментальных диет на васкулогенез . 61
3.5. Эффекты экспериментальных диет на воспаление . 65
3.6. Эффекты экспериментальных диет на тканевую экспрессию генов . 68
3.7. Изменение уровней циркулирующего PCSK9 на фоне эксперимен тального лечения . 77
3.8. Влияние экспериментальных диет на липидные медиаторы 78
Глава 4. Результаты клинического исследования
4.1. Клиническая оценка эффектов омега-3 ПНЖК в комбинации аспи
рина и статина 91
4.2. Особенности проведения ЧКВ у больных ИБС в сочетании с ХОБЛ 95
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 98
Выводы 109
Практические рекомендации . 111
Список сокращений . 112
Список литературы
- Механизмы действия омега-3 жирных кислот
- Влияние экспериментальных диет на липиды плазмы и липопротеины
- Эффекты экспериментальных диет на воспаление
- Особенности проведения ЧКВ у больных ИБС в сочетании с ХОБЛ
Введение к работе
Актуальность темы. Атеросклероз является ведущей причиной развития большинства сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), способствующих росту смертности, инвалидности и основной статьёй расхода здравоохранения РФ и США (Бойцов С.А., 2013; Bonow R. et al., 2002). Прогресс в изучении клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе атерогенеза, привёл к выработке единого соглашения по патогенезу данного процесса, рассматривая вовлечение хронического воспаления на каждом этапе развития атеросклероза, от начала, прогрессирования и до клинической манифестации (Massaro M. et al., 2008; Hansson GK. et al., 2005). Также следует отметить взаимосвязь развития ССЗ и повышенных уровней триглицеридов (ТГ) и провоспалительных маркёров (. et al., 2011). Основываясь на множестве как животных, так и клинических моделей длинноцепочечные n-3 полиненасыщенные жирные кислоты (омега-3 ПНЖК), содержащиеся в рыбе, такие как эйкозапентаеновая (ЭПК) и докозагексаеновая кислоты (ДГК), считаются атеропротективными молекулами за счёт мощного триглицерид-снижающего и противовоспалительного эффектов (Shearer G. et al., 2012). В последние годы всё чаще обсуждаются дополнительные свойства омега-3 ПНЖК, отличные от их влияния на обмен ТГ. Так, по мнению большинства экспертов, именно изучение противовоспалительных свойств незаменимых n-3 ПНЖК является приоритетом современных исследований (Mozaffarian D. et al., 2011). Не менее глобальной проблемой современной медицины является адекватная терапия хронической обструктивной болезни лёгких (ХОБЛ), занимающей лидирующие позиции по своей социоэкономической значимости (Meyer K. et al., 2013; Чучалин А.Г., 2011). Рассмотрение ХОБЛ с позиции текущих этиопатогенетических представлений, свидетельствует также в пользу единства процессов воспаления и атерогенеза. Была показана чёткая зависимость нарушения спирометрических показателей при ХОБЛ и прогрессирования сердечно-сосудистой патологии и смертности (Ukena C. et al., 2010; Anthonisen N. et al., 2005). В этой связи, назрела необходимость изучения новых противовоспалительных лекарственных комбинаций в рамках двух описываемых нозологий, что и определило цель и задачи настоящего исследования.
Работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России. Номер государственной регистрации – 0120.1151670. А также в рамках сотрудничества с Национальным институтом сердца, лёгких и крови (NIH, NHLBI, г. Бетесда, США) при поддержке локальной исследовательской программы NIH, NHLBI DIR.
Цель исследования: изучить атеропротективные и противовоспалительные эффекты терапевтического приёма омега-3 ПНЖК как самостоятельно, так и в комбинации с ацетилсалициловой кислотой в экспериментально-клиническом исследовании.
Задачи исследования:
1. Определить влияние омега-3 ПНЖК, а именно ЭПК и ДГК, а также ацетилсалициловой кислоты на систему воспаления в период 13 недель лечения apoE-KO мышей специально сформулированными экспериментальными диетами путём диагностики уровней циркулирующих цитокинов плазмы, активности ЦОГ-1,2, тканевой экспрессии генов в печени; а также анализа метабололипидома лёгких, селезёнки и аорты с помощью жидкостной хроматографии-тандем масс спектрометрии.
2. Провести анализ степени атеросклеротического поражения исследуемых групп apoE-KO мышей по данным изменения липидного спектра плазмы, морфометрического и иммуногистохимического анализа аорты и её ветвей, клеточных эссе неоваскулогенеза и миграционной активности, а также методами поточной цитофлюорометрии и тканевой экспрессии генов в аорте.
3. Оценить эффективность комбинирования омега-3 ПНЖК (Омакор, Abbott) со стандартной медикаментозной терапией по результатам лабораторно-клинического анализа у больных с сочетанием ИБС и ХОБЛ.
4. Проанализировать влияние сочетанного течения ИБС и ХОБЛ на коронарное русло в клиническом исследовании в рамках экспериментально изучаемой концепции воспаления и атерогенеза.
Новизна исследования. Впервые в проведённом эксперименте для моделирования атеросклероза у apoE-KO мышей использовались специально сформулированные диеты, имеющие низкое содержание холестерина и нормализованные по отношению n-3/n-6, что является важным аспектом в дальнейшем изучении как омега-3 ПНЖК, так и продуктов их метаболизма. Впервые была оценена тканевая вариабельность маркёров АК, ЭПК и ДГК и предположена их ассоциация с экспрессией соответствующих таргетных генов. Найденные вариации сопровождались интересными новыми данными по механизмам регуляции PCSK9, что является существенным дополнением в планировании последующих как экспериментальных, так и клинических исследований. Кроме того, наши результаты показали как независимые, так и комбинированные с аспирином противовоспалительные свойства ЭПК и ДГК в клинических условиях у пациентов с сочетанным течением ИБС и ХОБЛ. Полученные экспериментально-клинические результаты объясняют возможность комбинации омега-3 ПНЖК со стандартной медикаментозной терапией у пациентов, перенесших хирургическую эндоваскулярную коррекцию.
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в моделировании и реализации исследования. Им проанализированы зарубежные и отечественные источники по теме диссертации, получены и оценены результаты исследования. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследований с долей личного участия автора 90% с планированием и проведением in vivo и in vitro частей эксперимента, а именно: самостоятельное препарирование и реализация хирургических этапов применённой apoE-KO модели, проведение и статистическая обработка всех частей эксперимента, за исключением масс-спектрометрического анализа, выполненного лабораторией партнёров. Автором самостоятельно проведен набор больных, разделение их на рандомизированные группы, разработка дизайна исследования, осуществление клинических наблюдений и статистическая обработка клинических результатов.
Практическая значимость. Выявленный эффект потенцирования анти-атерогенного влияния ЭПК+ДГК в комбинации с аспирином, в частности снижение циркулирующего уровня PCSK9, должен применяться в клинической практике для лечения атеросклероз-ассоциированных состояний. Более того, показанное положительное воздействие эквивалентных терапевтическим концентраций омега-3 ПНЖК на выработку продуктов метаболизма АК, ЭПК и ДГК необходимо учитывать при лечении состояний, имеющих хронический воспалительный компонент. Противовоспалительный эффект комбинации омега-3 ПНЖК со стандартной медикаментозной терапией у пациентов с ИБС и ХОБЛ следует шире применять в клинической практике, в частности у пациентов, перенесших хирургическую эндоваскулярную коррекцию.
Внедрение результатов в практику здравоохранения. Результаты исследования используются в лечебно-диагностическом процессе кардиологического отделения БМУ «Курская областная клиническая больница», в клинико-диагностической практике «Центра медицинских осмотров и профилактики», в учебном процессе на кафедре внутренних болезней факультета последипломного образования ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России. Результаты диссертационной работы легли в основу доказательной базы проводимых экспериментально-клинических исследований Лаборатории метаболизма липопротеинов Национального института сердца, лёгких и крови (NHLBI), NIH, г. Бетесда, США.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, 4 из которых в изданиях, определенных перечнем ВАК РФ.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Впервые было показано, что диетическое добавление омега-3 жирных кислот существенно изменяет липидный профиль плазмы (снижение ОХ в 1.6 раза, P<0.0005) и сопровождается снижением тканевого уровня экспрессии мРНК PCSK9 (на 60%), и его плазменной концентрации (на 40%) в сравнении с Омега-3 дефицитной диетой, а также замедляет прогрессирование атеросклероза, уменьшая область покрытия атеросклеротическими бляшками аорты, и снижая экспрессию VCAM-1 и MOMA-2 в них.
2. Впервые было показано, что диетическое употребление омега-3 жирных кислот способствует существенному увеличению основных предшественников специализированных противовоспалительных медиаторов (для RvE1 в 29 раз, для RvD1 в 2 раза) в ткани лёгких и аорты, приводит к снижению ключевых провоспалительных маркёров, простагландинов, липоксинов и лейкотриенов, а также существенно снижает экспрессию одного из маркёров воспаления, Ccl2/Mcp1, в печени.
3. Комбинирование аспирина с омега-3 ЖК положительно воздействует на сосудистый компонент атерогенеза за счёт увеличения числа EPC в красном костном мозге, замедления неоангиогенеза, стимулирования миграции эндотелиальных клеток и повышения аортальной экспрессии генов ангиогенеза и активности тромбина.
4. Добавление комбинированного препарата омега-3 ПНЖК (Омакор, Abbott) к стандартной медикаментозной терапии у больных с сочетанным течением ИБС и ХОБЛ, перенесших хирургическую эндоваскулярную коррекцию, обладает противовоспалительным и липидкорригирующим эффектами, а также улучшает качество жизни пациентов и уменьшает выраженность симптомов ХОБЛ.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались в форме постеров на научной сессии Атеросклероза, тромбоза и сосудистой биологии (ATVB) (г. Лэйк Буэна-Виста, штат Флорида, США) в 2013 году, на летней школе по сердечно-сосудистым заболеваниям “Научная теория транслируемая в клинику” Европейского общества кардиологов (ESC) (Европейский дом сердца, г. София-Антиполис, Франция).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах, содержит 12 таблиц, 27 рисунков (мультипанельной структуры), построена по общепринятому принципу и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 195 источников: 2 отечественных и 193 иностранных.
Механизмы действия омега-3 жирных кислот
Интересным является тот факт, что употребление ДЦ n-3 ПНЖК 6 г/день в течение 3 месяцев и затем 3 г/день в течение 21 месяца у 223 пациентов с ангио-графически доказанным поражением коронарных артерий несущественно ослабляло течение коронарного атеросклероза [173]. Однако данные 12 рандомизированных исследований по эффектам влияния употребления рыбьего жира на ресте-ноз каротидных артерий после чрескожной транслюминальной коронарной ан-гиопластки или аорто-кооронарного шунтирования показали сомнительные эффекты [65]. Более того, единственное рандомизированное исследование по эффектам рыбьего жира против плацебо на толщину комплекса интима-медиа и ме-дию сонных артерий выявило ухудшение вместо улучшения на фоне приёма рыбьего жира [54].
В 2006 году было опубликовано 2 систематических обзора, оценивших все имеющиеся доказательства по жирным кислотам в интервенционных исследованиях. Hooper et al. [148], включили в обзор информацию по 48 рандомизированным клиническим трайалам и 41 когортному исследованию, сделав вывод, что длинные цепи и короткие цепи n-3 ПНЖК чётко не влияют на общий уровень смертности, включая сердечно-сосудистые события и рак. Однако, имеется 2 существенных недостатка к подходу их анализа: 1. объединение результатов исследований по -линоленовой кислоте с данными по ДЦ n-3 ПНЖК согласно эпиде 14 миологическим исследованиям по протективным эффектам -линоленовой кислоты явились недостаточно убедительными; 2. суммирование фатальных и нефатальных сердечно-сосудистых событий [75]. Более того, окончательное заключение их обзора по ДЦ n-3 ПНЖК было существенным образом подвержено влиянию со стороны результатов исследования DART-2, которое изобилует методологическими проблемами, обозначенными ранее [101]. Интересно, что исключение результатов DART-2 из проведенного мета-анализа соответствует подтверждению протективных эффектов ДЦ n-3 ПНЖК [148]. Действительно, несколько проведенных ранее мета-анализов показали протективный эффект от приёма рыбы по влиянию на инсульт и фатальную ИБС [119, 4, 111, 106], основанный на 14 рандомизированных клинических исследованиях, 25 проспективных когортных исследованиях и 7 исследованиях случай-контроль. Результатом такого подхода явилось доказательство того, что увеличение потребления n-3 ПНЖК из рыбы или n-3 ПНЖК содержащих препаратов, но не -линоленовой кислоты отдельно, снижает частоту всех причин смертности, сердечной и внезапной смерти [2] и возможно инсульта [118].
Как известно, ХОБЛ и ИБС являются очень распространенными заболеваниями с общими факторами риска, такими как курение, пожилой возраст и другие. Существует чёткая доказательная база, подтверждающая, что пациенты с нарушением функции дыхания имеют значительно больший риск смерти от инфаркта миокарда, не связанный с возрастом, полом и анамнезом курильщика [160]. В триале (Lung Health Trial), включавшим в себя почти 6000 пациентов и наблюдавшихся в течение 14 лет, ОФВ1 было независимым предиктором смерти от инфаркта миокарда. Эта взаимосвязь отмечалась даже при наличии длительного анамнеза курильщика [175]. Пациенты с умеренной ХОБЛ имели большую летальность от сердечно-сосудистых причин, нежели от дыхательной недостаточности [152]. Существует чёткая взаимосвязь между факторами риска, ассоциированными с развитием ХОБЛ и атеросклероз-ассоциированных сосудистых заболеваний. Клинически имеется чёткая зависимость между нарушенной функцией лёгких (ОФВ1) и сосудистой смертностью и отягощенностью. Однако, существует повышенный риск фатального инфаркта миокарда не зависимо от статуса курильщика у больных с ХОБЛ [24]. Крупное популяционное исследование показало, что пациенты с тяжелой и очень тяжелой ХОБЛ имеют в два раза больший риск сосудистых заболеваний и в 1.6 раза большее число развития гипертензии и соответственно госпитализации [133]. Системное воспаление при ХОБЛ вовлечено в патогенез развития ИБС и атеросклероза у пациентов с ХОБЛ [7]. Атеро-склеротическая бляшка является источником воспаления с повышенным содержанием макрофагов, секретирующих Th1, схожих с таковыми в лёгких при ХОБЛ [45]. Хотя имеющаяся чёткая взаимосвязь между ХОБЛ и ИБС изучена не до конца, доказанным считается необходимость скрининга пациентов с ХОБЛ на наличие сосудистой патологии, атеросклероза, так же как и наличие атеросклероза диктует необходимость исследования функции лёгких.
Описанный воспалительный процесс при ХОБЛ вызван, прежде всего, IL-8, TNF- и LTB4, а также другими провоспалительными цитокинами, секретируемые нейтрофилами [25]. Показано, что мокрота пациентов с ХОБЛ содержит высокие концентрации IL-8 и LTB4, которые коррелируют с тяжестью заболевания и обострениями [66]. Считается, что альвеолярные макрофаги являются основным источником LTB4 [78]. Было показано, что нутритивная поддержка омега-3 ПНЖК (0.6 г в день в течение 2 лет) у пациентов с ХОБЛ снижает уровень LTB4, TNF- и IL-8 (p 0.01) в сыворотке и мокроте, а также улучшает толерантность к нагрузкам [66]. В этом же исследовании было обнаружено значительное улучшение теста ходьбы (6-минутная ходьба), дыхательной функции (шкала Борг) и процента сатурации кислорода (p 0.05 для всех). Интересным фактом является то, что пациенты с ХОБЛ могут иметь значительную одышку, в большей части случаев, вызванную атрофией и истощением скелетной мускулатуры. Это ограничение физической активности не связано со снижением дыхательной функции (ОФВ1) и приписывается комбинированным эффектам повышенного оксидативного стресса и IL-6 [66], что частично способно объяснить полученные результаты.
Влияние экспериментальных диет на липиды плазмы и липопротеины
Срезы монтировались при помощи Vectashield, содержащем DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA 94010). Серия тканевых срезов без первичных антител служила негативным контролем. Меченные тканевые срезы анализировались под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом (Zeiss, Thornwood, NY, USA). Макрофаги, VCAM-1 и коллагенпозитивные области анализировались в каждом срезе путём определения области, окрашенной позитивно на исследуемые маркёры. Получение снимков и морфометрический анализ производился с использованием микроскопа (Leica Microsystems, GmbH, Wetzlar, Germany) и программным комплексом (Image-Pro Plus версия 6.2., Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) ”слепым” образом. MOMA-2 и VCAM-1 позитивные области показаны в мм2. Гистопатологическое разделение повреждений на основе стадии развития было проведено ”слепым” методом двумя исследователями согласно классификации Reddick с некоторыми модификациями [139, 3].
Поточная цитофлюорометрия (Определение EPC и СЕС)
Эндотелиальные прогениторные клетки (EPC) подсчитывались согласно стандартному цитофлюорометрическому протоколу [98]. EPC считались клетки, имеющие следующий фенотип, Lin-CD45- /CD34+/CD117+/CD309+. Циркулирующие эндотелиальные клетки (CEC) определялись как CD146/ CD45/ CD133/ CD309. Вкратце, 4-цветная поточная цитофлюоромтерия выполнялась для маркёров CD45 (клон 30-F11, флюорохром PerCP/Cy 5.5), CD34 (клон MEC14.7, флюо-рохром PE), CD117 (клон 2B8, флюорохром APC/Cy7), CD309 (клон Avas12, флюорохром APC), Linage cocktail, CD146 (клон ME-9F1, флюорохром FITC), CD45 (клон 30-F11, флюорохром PerCP/Cy 5.5), CD133 (клон 315-2C11, флюоро-хром Biotin) и CD309 (клон Avas12, флюорохром APC). СЕС определялись как CD146/ CD45/ CD133/ CD309. Антитела были приобретены от BioLegend (San Diego, CA, USA) и сам анализ проводился на BD LSR II поточном цитометре (BD Biosciences, San Jose, California, USA) с FCSExpress (Research Edition), версия 4.0 (De Novo Software, Los Angeles, CA, USA).
Клетки инкубировались с блокирующим буфером (1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) и 1% FBS) в течение 20 минут на льду. Далее клетки инкубировались с флюорохром-меченными противомышиными антителами крысы в течение 30 минут на льду. Клетки отмывались PBS и снова центрифугировались при 300 х g для седиментации и немедленного анализа. Диапазон обнаружения (“ворота”) клеток включал только мононуклеарные клеточные события с исключением дупликата клеток, тромбоцитов и мёртвых клеток/остатков. Для ЕРС вторичные ворота включали только те клетки, которые негативны на CD45 (PerCP/Cy 5.5) и Lin-маркёры. Третьи ворота включали клетки, имеющие двойную позитивную к CD34 (PE) и CD309 (APC) экспрессию и лишь клетки, имевшие высокоинтенсивную двойную флюоресценцию, считались ЕРС. Парные флюорохромные изотипы контроля (PerCP/Cy 5.5-IgG2b, PE- IgG2a, APC/Cy7-IgG2b, APC-IgG2a; BioLegend, San Diego, CA, USA) как и не окрашенные образцы использовались для создания правильных параметров ворот и служили негативным контролем.
Для СЕС вторичные ворота использовались с целью отбора только клеток, имевших негативную CD45 (PerCP/Cy 5.5) и позитивную CD146 (FITC) экспрес сию, только имевшие высокоинтенсивную двойную флюоресценцию (CD146+++/CD45---) клетки считались СЕС. Парные флюорохромные изотипы контроля (FITC-IgG2a, Biotin-IgG2a, PerCP/Cy 5.5-IgG2b, APC-IgG2a; BioLegend, San Diego, CA, USA), как и не окрашенные образцы использовались для создания правильных параметров ворот и служили негативным контролем. Выделение клеток и культивирование
Эндотелиальные клетки из пупочной вены человека (Human Umbilical Vein Endothelial Cells/HUVECs) были получены из Американского клеточного депозитария (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) и культивированы в среде ЕВМ-2 (Lonza, Walkersville, MD, USA) с добавлением 10% бычьей феталь 36 ной сыворотки (Bench Mark Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA), 2 ммоль/л L-глутамина, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (все компоненты от Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) и комплиментарным набором ростовых факторов эндотелиальных клеток от Lonza. HUVEC помещались в специальные покрытые коллагеном I типа (Biocoat) клеточные вентилируемые фляжки размером 75-см2 (Beckon Dickinson, Bedford, MA, USA) при стандартных условиях клеточного роста (37 oC, 5% CO2). Клетки, использованные в экспериментах, были в целом 3-4 генерации. После образования клетками однородного монослоя, наблюдаемого после 2 дней, клетки отмывались 10 мл PBS, pH 7.4 (Gibco, Grand Island, NY, USA) и отслаивались при помощи короткой инкубации с 0.25% Трипсин-ЭДТА, 5 мл (Gibco) с дальнейшем культивированием в различных пропорциях в соответствии с требованиями эксперимента.
Миграционное эссе
Миграционная способность HUVEC оценивалась с помощью модифицированной камеры Бойдена (Boyden) в соответствии с протоколом производителя. Изолированные HUVEC отслаивались при помощи 0.25% трипсин-ЭДТА, сбора клеток центрифугированием, перемешиванием в 1000 l EBM-2 (без бычьей фе-тальной сыворотки и ростовых факторов) с дальнейшим подсчётом в пластиковых счётных камерах (20 l) при помощи Cellometer Auto T4 Cell Counter и Cellometer Auto Counter software, версия 3.3.3 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA). HUVEC в концентрации 2x103 клеток на лунку помещались в верхнюю камеру модифицированной камеры Бойдена, 48-Well Micro Chemotaxis Chamber (Neuro Probe, Inc., Gaithersburg, MD, USA). Тогда как сосудистый эндотелиальный ростовой фактор (VEGF) (Pepro Tech, Rocky Hill, NJ, USA), смешанный с EGM-2 средой в концентрации 50 ug/ml помещался в нижний отсек камеры. Неразведённая плазма пролеченных групп (25 l) использовалась как аттрактант в опытных ячейках. Поликарбонатная, с порами 8-m, 25x80 мм, без поливинилпирролидо-ниевая/polyvinylpyrrolidone (PVP) мембрана от Neuro Probe служила барьером между двумя камерами.
Эффекты экспериментальных диет на воспаление
Эссе активности ЦОГ Различия воспалительного процесса между пролеченными группами оценивались колориметрически определяемой пероксидазной активностью ЦОГ в аорте и лёгких (Рисунок 11, А). Наиболее существенные изменения были найдены в аорте животных, употреблявших только ЭПК и ДГК и их комбинации с аспирином. Как и предполагалось, тканевые уровни активности ЦОГ были меньше в группе аспирина, в сравнении с Омега-3 обогащённой и дефицитной диетами (18890 ± 700.4% vs. 21170 ± 587.2% и 23000 ± 388.3%, соответственно, P 0.05 и P 0.0005). Анализ лёгочной ткани показал такой же характер ингибирования активности ЦОГ, но менее существенный при сравнении. Таким образом, добавление аспирина уменьшало активность ЦОГ, в сравнении с Омега-3 дефицитной группой (25910 ± 686.8 vs. 28660 ± 1372, соответственно, P 0.1) (Рисунок 11, A).
Измерение продукции цитокинов
Одновременно с изменениями активности ЦОГ, мы оценивали уровни циркулирующих цитокинов и хемокинов плазмы, участвующих в атерогенезе и воспалении. Для этих целей использовалась система мультиплекс и ELISA, результаты которых выражались в pg/ml образца плазмы (Рисунок 11, B-I). Статистически достоверными были межгрупповые различия хемоаттрактанта кератиноцитов (mKC), другие изменения цитокинов не достигли поставленного уровня статистической значимости (P 0.05). Кроме того, плазменная концентрация всех цитоки-нов, кроме TGF- и mKC, равнялась наименьшим значениям, определённым производителем использованного набора ELISA. Концентрация TGF- и IL-6 были слегка увеличены в группе комбинации омега-3 ЖК и аспирина. Диетическое употребление ЭПК+ДГК увеличивало уровни IFN- и IL-10, тогда как добавление аспирина потенцировало наблюдаемый эффект. В тоже время, комбинация омега-3 ЖК с аспирином имела обратную зависимость в отношении уровней IL-1b и TNF- (P 0.1). ЭПК+ДГК без аспирина снижали концентрацию IL-12p70, в сравнении с Омега-3 дефицитной и комбинированными с аспирином экспериментальными диетами. И наконец, изменения mKC носили достаточный уровень статистической достоверности, его снижение наблюдалось у животных, получавших Омега-3-содержащию диеты, в сравнении с дефицитной по омега-3 ЖК (35.7 ± 1.7 and 35.2 ± 2.1 vs. 46.4 ± 3.8, соответственно, P=0.01).
Прежде всего, необходимо отметить, что между генами, участвующими в регуляции синтеза холестерина и метаболизма (группа V, Рисунок 12), экспрессия 4 из них изменялась в результате добавления омега-3 ЖК, тогда как комбинация с ацетилсалициловой кислотой драматично не меняла указанные изменения. Экспрессия ядерных рецепторов Insig1 и Srebf1 (также известного, как Srebp-1c) снижалась. Данные рецепторы изменяют синтез холестерина в противоположном направлении (Srebf1 активирует, тогда как Insig 1 ингибирует) [77, 164]. Тем не менее, за счёт того, что контролируемая ими экспрессия генов синтеза холестерина Dhcr7, Fdps и Hmgcr была снижена, становится возможным сделать вывод, что снижение экспрессии Srebf1 обладало доминирующим эффектом.
Ядерный рецептор Nr1h4 (также известный как Farnesoid X-activated receptor; Fxr) регулирует экспрессию генов, вовлечённых в синтез и транспорт жёлчных кислот, особенно ингибируя экспрессию одного из ключевых генов синтеза жёлчи, Cyp7a1 [95, 149]. Экспрессия Nr1h4 возросла в 1.5 раза в печени мышей, принимавших диету с омега-3 ЖК (Рисунок 12). Однако, не смотря на этот факт, экспрессия Cyp7a1 в печени apoE-KО мышей была заметно увеличена за счёт добавления омега-3 ЖК. Сходный эффект влияния омега-3 ПНЖК на Cyp7a1 описан раннее в экспериментах на мышах [27, 68]. Было показано, что ПНЖК стимулированная экспрессия Cyp7a1 сопровождалась увеличенной экскрецией жёлчных кислот и холестерина [27].
Ещё один ген, участвующий в регуляции синтеза и метаболизма холестерина (Рисунок 12), именуемый Prkaa1, достиг увеличения уровня экспрессии в 1.5 раза. Данное изменение экспрессии защищает клетки от стрессов, вызывающих истощение АТФ путём выключения АТФ-расходующих биосинтетических процессов [159, 194]. Стоит заметить, что экспрессия генов Dhcr7, Fdps и Hmgcr, вовлечённых в синтез холестерина (группа IV, Рисунок 12) была снижена в 1.3-4.4 раза. Также, экспрессия генов Acaa2, Cyp7a1 и Hmgcs2, участвующих в катабо 70 лизме холестерина и жирных кислот (группа III, Рисунок 12), была увеличена от 1.5 до более чем 10 раз. Возможно в ситуации, когда синтез холестерина в печени снижался, с целью увеличения входящего тока холестерина, экспрессия генов apoA1, apoB и LCAT в печени, вовлечённых в транспорт холестерина (группа II, Рисунок 12), увеличивалась в 1.3-1.6 раза.
Примечание: Животные, получавшие ЭПК+ДГК сравнивались с группой той же диеты, но дефицитной по ЭПК+ДГК. Каждая из этих групп включала 4 самки. Другая группа мышей, получавших ЭПК+ДГК с добавлением АСК сравнивалась с мышами на ЭПК+ДГК дефицит Необходимо отметить, что добавление омега-3 ЖК сопровождалось существенно сниженной экспрессией гена Pcsk9. Уровень его РНК был меньше, чем в контроле на 2.5-5.9 раза, что вероятно увеличивало уровень функционально активных рецепторов ЛПНП и приток холестерина в гепатоциты [135]. Все описанные выше изменения, наблюдавшиеся в экспрессии генов печени apoE-KО мышей, находившихся на диете, обогащённой омега-3 ЖК, были направлены на снижение синтеза холестерина в тканях, увеличение потока холестерина из плазмы и увеличение синтеза и секреции жёлчных кислот. Как результат, данные изменения сопровождались наблюдавшемся снижением уровня общего холестерина плазмы (Таблица 5, Рисунок 1) и признаками уменьшения воспалительного ответа в печени: экспрессия Ccl2 (Chemokine (C-C motif) ligand 2, также известного как белок-хемоаттрактант моноцитов 1 / monocyte chemoattractant protein 1, Mcp1)
Особенности проведения ЧКВ у больных ИБС в сочетании с ХОБЛ
Результаты наших экспериментов показали, что ПНЖК (ЭПК и ДГК) самостоятельно способны улучшать течение атеросклероза, воздействуя на различные патофизиологические пути. Накопленные доказательства, определяющие свойства омега-3 ЖК, преимущественно относятся к их участию в метаболизме липидов и продукции энзиматически-модифицированных липидных медиаторов, функционирующих как SPM (специализированные проразрешающие медиаторы / specialized proresolution mediators).
Имеющиеся данные свидетельствуют о неоспоримом эффекте n-3 ЖК на снижение уровней ТГ плазмы, как у человека, так и животных [73, 79], в дозоза-висимой манере, приписываемой уменьшению синтеза ЛПОНП и увеличению их катаболизма [12]. Известно, что apoE играет важную роль в метаболизме ТГ и критичен для проявления эффектов по снижению ТГ рыбьим жиром [102]. Приём экспериментальными apoE-/- животными ЭПК и ДГК обогащённых диет с концентрациями эквивалентными 4 г/день омега-3 ЖК для человека не привели к существенному увеличению ТГ плазмы, равно как и не повысили общий холестерин, что не согласуется с предыдущими сообщениями. Более того, добавление омега-3 ЖК в проведённом исследовании существенно снижало уровни общего холестерина пролеченных животных. Ранее было показано, что apoE-/- мыши, получавшие ЭПК и ДГК, обладали повышенными уровнями ТГ плазмы и увеличением или отсутствием изменений концентрации общего холестерина [73]. Тем не менее, имеется ряд исследований, изучавших эффекты раздельного приёма ЭПК и ДГК как на снижение ТГ, так и повышение ЛПНП. Так, было показано, что ДГК возможно проявляет несколько лучший ТГ-снижающий и ЛПВП-повышающий эффекты, в сравнении с ЭПК [188]. С другой стороны, орально назначаемая apoE-/- мышам ЭПК, приводила к уменьшению уровней общего холестерина статистически незначимо [127]. Различия между нашими наблюдениями и другими исследованиями, возможно, частично могут быть объяснены составом диет и возрастом изу 99 чаемых животных. Содержание холестерина в используемых нами модифицированных диетах было низким, около 40ppm, в сравнении с концентрациями, используемыми в атерогенных диетах для apoE-/- мышей ( 2000ppm), тогда как уровень сахарозы был выше в наших диетах, что потенциально способно повлиять на липогенез. Кроме того, каждая экспериментальная диета сразу же формировалась в брикеты и фасовались в индивидуальные пакеты под вакуумом для минимизирования окисления диетических жиров и аспирина. Применяемый принцип помог сохранить биологическую активность ЭПК и ДГК в соответствующих концентрациях и избежать непредвиденных исходов от окисленных продуктов. Также, раннее было показано, что самки apoE-/- мышей имеют существенно ниже концентрации общего холестерина сыворотки и печени после приёма ДГК, в сравнении с мышами-самцами [39]. Независимые эффекты ЭПК и ДГК, отличные от ацетилсалициловой кислоты, определялись двумя специально сформированными группами, Омега-3 дефицитной+AСК и Омега-3 обогащённой+АСК. Более того, было показано, что уровни холестерина и триглицеридов плазмы apoE-/- мышей оставались неизменёнными или увеличивались на фоне приёма аспирина [15].
Прогрессирование атеросклероза в нашем исследовании было достигнуто во всех экспериментальных группах животных независимо от получаемой диеты. Поражения преимущественно располагались в дуге аорты и областях, смежных с её ветвями, что согласуется с ранее полученными результатами [87]. Тем не менее, en-face анализ поражений аорты показал очевидное замедление атеросклероза в группе омега-3 ЖК комбинированных с аспирином. В сравнении с контрольной группой животных, получавших Омега-3 дефицитную диету, группа Омега-3 обо-гащённой+АСК диеты показала снижение аортального атеросклероза в 2.2-раза, тогда как сравнение с контрольной группой не выявило каких-либо изменений на фоне приёма только Омега-3 обогащённой диеты. Основываясь на данных, полученных в результате проведения экспериментов на животных и клинических испытаниях сложно сделать чёткое заключение об эффектах аспирина, ЭПК и ДГК на прогрессирование атеросклероза [190]. Ряд исследователей не обнаружили значимых изменений в размере бляшки после лечения омега-3 ЖК, свидетельст 100 вуя о том, что в apoE-/- модели прямое влияние на общий холестерин может ре-зультировать регрессом атеросклероза. Тем не менее, наша модель чётко показала значимое снижение ОХ в группах диет, обогащённых ЭПК и ДГК и проявивших положительную корреляцию с интенсивностью области поражения, однако данный факт не снижал атеросклероз. Хотя омега-3 ЖК самостоятельно не замедляли атеросклероз, дальнейший иммуногистологический анализ выявил изменения в составе бляшек аортального синуса среди экспериментальных групп. Результаты нашего исследования показали, что аккумулирование макрофагов и VCAM-1 экспрессия были меньше в группе, получавших омега-3 ЖК, добавление аспирина имело сходную тенденцию к регрессу, но менее значимую. Интересно, что нами не было обнаружено подобных изменений в прогрессировании атеросклероза, которые были замечены при en-face анализе. Мы считаем, что результаты иммуно-гистологического исследования отражают более наглядные изменения, обусловленные диетическими составляющими, которые соответствуют имеющейся информации. Доказанным стал тот факт, что экспрессия VCAM-1, IL-6 и MCP-1 в развивающемся и сформировавшемся атеросклеротическом поражении находится среди биоактивных субстанций, инициирующих моноцитарно-эндотелиальное взаимодействие, ингибирование которого ассоциируется со снижением атеросклероза. Состав обеих обогащённых диет приводил к стабилизации бляшки и уменьшал атерогенез за счёт снижения молекул адгезии, аккумулирования макрофагов, провоспалительных цитокинов и хемокинов
