Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. О химической природе и свойствах препарата тизоль 11
1.2. Фармакодинамические и фармакокинетические свойства тизоля 14
1.3. Влияние экстремальных воздействий на состояние регенераторных процессов 21
1.4. Современные представления о механизмах восстановления тканей после воздействия ионизирующего излучения 23
1.5. Изменение процессов клеточного обновления, возникающие в системе гемопоэза и в системе желудочно - кишечного тракта после воздействий ионизирующего излучения 28
1.6. Основные аспекты терапии острой лучевой болезни 36
Заключение 37
Глава 2. Методические вопросы исследования 40
2.1. Общая характеристика лабораторных животных использованных в исследованиях 40
2.2. Дозы и способы введения препаратов 40
2.3. Облучение лабораторных животных на гамма-терапевтической установке 42
2.4. Методы исследования кроветворной ткани 45
2.5. Методы оценки регенераторных процессов в слизистой оболочке тощей кишки 50
2.6. Методы статистической обработки полученных результатов 52
Глава 3. Влияние тизоля на состояние миелоиднои ткани в физиологических условиях, а также в условиях воздействия ионизирующего излучения 53
3.1. Состояние миелоидной ткани на 1 сутки у лабораторных животных, не подвергшихся воздействию ИИ. после введения препаратов тизоль и деринат 53
3.2. Состояние миелоидной ткани на 1 сутки у лабораторных животных, подвергшихся воздействию ИИ дозой 0,5 Гр, на фоне введения препаратов тизоль и деринат 62
3.3. Состояние миелоидной ткани на 1 сутки у лабораторных животных, подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, на фоне введения препаратов тизоль и деринат 77
3.4. Состояние миелоидной ткани на 7 сутки у лабораторных животных, не подвергшихся воздействию ИИ, после введения препаратов тизоль и деринат 91
3.5. Состояние миелоидной ткани на 7 сутки у лабораторных животных, подвергшихся воздействию ИИ дозой 0,5 Гр, на фоне введения препаратов тизоль и деринат 102
3.6. Состояние миелоидной ткани на 7 сутки у лабораторных животных, подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, на фоне введения препаратов тизоль и деринат 115
Заключение 129
Глава 4. Влияние тизоля на регенерацию эпителия тощей кишки в физиологических условиях, а также в условиях воздействия ионизирующего излучения 133
4.1. Регенерация слизистой оболочки тощей кишки на 1 сутки у лабораторных животных, не подвергшихся воздействию ИИ, после введения препаратов тизоль и деринат 133
4.2. Регенерация слизистой оболочки тощей кишки на I сутки у лабораторных животных, подвергшихся воздействию ИИ дозой 0,5 Гр, на фоне введения препаратов тизоль и деринат 136
4.3. Регенерация слизистой оболочки тощей кишки на 1 сутки у лабораторных животных, подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, на фоне введения препаратов тизоль и деринат 140
4.4. Регенерация слизистой оболочки тощей кишки на 7 сутки у лабораторных животных, не подвергшихся воздействию ИИ, после введения препаратов тизоль и деринат 146
4.5. Регенерация слизистой оболочки тощей кишки на 7 сутки у лабораторных животных, подвергшихся воздействию ИИ дозой 0,5 Гр, на фоне введения препаратов тизоль и деринат 149
4.6. Регенерация слизистой оболочки тощей кишки на 7 сутки у лабораторных животных, подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, на фоне введения препаратов тизоль н деринат 152
4.7. Верификация апоптоза эпителия тощей кишки флуоресцентно-микроскопическим методом с целью оценки эффективности проводимой цитопротективной терапии 157
4.8. Вероятный механизм антиапоптогенного действия глин еросольвата титана 159
Заключение 165
Общее заключение 170
Выводы 184
Список литературы 185
- Современные представления о механизмах восстановления тканей после воздействия ионизирующего излучения
- Методы исследования кроветворной ткани
- Состояние миелоидной ткани на 1 сутки у лабораторных животных, подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, на фоне введения препаратов тизоль и деринат
- Регенерация слизистой оболочки тощей кишки на 1 сутки у лабораторных животных, подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, на фоне введения препаратов тизоль и деринат
Введение к работе
Актуальность проблемы. Раскрытие новых механизмов регенерации тканей в экстремальных условиях позволяет определить и внедрить новые принципы патогенетической терапии, вести поиск новых активных факторов, влияющих на эти процессы. С этой целью используются биологически активные вещества, влияющие на митогенную активность, обладающие свойством адаптогенов, цитопротекторов и др. (Горизонтов П.Д., 1976, Меерсон Ф.З., 1986, Ястребов А.П., 2005).
Однако в настоящее время остается актуальной проблема восстановления регенерации тканей в условиях воздействия экстремальных факторов, а ее успешное решение во многом зависит от поиска новых активных препаратов, способных усиливать тканевую регенерацию.
В этом отношении наше внимание привлек аквакомплекс глицеросольвата титана (тизоль). Препарат тизоль рекомендован МЗ РФ ( Р 001667/01 - 2002) в качестве лекарственного средства для местного применения как обладающий противовоспалительным действием, что послужило толчком для активного внедрения тизоля в клиническую практику и внесения в государственный реестр лекарственных средств МЗ РФ (Ларионов Л.П., Емельянова И.В., 2003). Химическая формула тизоля: ТЮ4*(СзН7О2)*(СзН8Оз)*(Н2О)40, молекулярная масса 2054.
Тизоль был разработан и выпускается предприятием «ОЛИМП» («Общество лабораторных исследований медицинских препаратов», г. Екатеринбург; Емельянова И.В., Лопатина Г.П., Филатова Е.А. 1988).
На основании ранее проведенных экспериментальных исследований установлено, что тизоль обладает радиопротекторным, противовоспалительным, анальгезирующим действием, а также проводниковой активностью при применении в комплексе с другими лекарственными препаратами (Знаменский В.В., Берзин С.А., Герасимов В.Б., Ларионов Л.П., 2003г.).
Тизоль не токсичен и не является потенциальным аллергеном. Выявлено, что при парентеральном введении тизоль депонируется в клетках паренхиматозных органов, а также в клетках быстро обновляющихся тканей (миелоидная ткань, эпителий кишечника). Через 2 недели после введения тизоля его содержание в организме (на основании исследования кинетики титана) соответствует значениям нормы, что свидетельствует о достаточно быстром выведении препарата из организма экспериментальных животных (Ларионов Л.П., 1989 г.).
Было показано также, что тизоль оказывает выраженный радиопротекторный эффект при энтеральном его введении до радиационного облучения экспериментальным животным. Между тем парентеральное введение этого препарата в клинической практике пока не используется вследствие отсутствия экспериментальных данных о его влиянии на органы и системы как в физиологических условиях, так и при патологических процессах, а также воздействии экстремальных факторов.
Известно, что результирующая клеточного обновления, дающая основание для оценки регенерации ткани, определяется учетом пролиферации клеток и программированной клеточной гибели (апоптоза). В этом отношении нельзя было исключить, что тизоль мог оказаться активным по отношению к обоим процессам.
Можно было предположить также, что действие препарата тизоль на регенерацию тканей могло быть усилено совместным использованием цитопротек-тивных препаратов, действие которых направлено на генетический аппарат клетки (деринат, лейкоген и др.). Между тем, такая комбинация тизоля со стимуляторами клеточной пролиферации не исследовалась, в то время как соче-танное действие могло оказаться весьма благоприятным на исход клеточной репарации в условиях воздействия экстремальных факторов.
Среди экстремальных факторов наше внимание было сосредоточено на действии ионизирующего излучения, поскольку его повреждающее действие распространяется преимущественно на быстрообновляющиеся ткани, которые нуждаются в поддержании высокого регенераторного потенциала.
Все изложенное выше и позволило обосновать цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования. Изучить действие препарата тизоль при его парентеральном введении в физиологических условиях и в условиях воздействия ионизирующего излучения.
Задачи исследования:
Исследовать действие различных доз тизоля на регенераторную и мутагенную активность эпителия кишечника, а также изучить состояние кроветворения и регенерацию эпителия кишечника в физиологических условиях в различные сроки после парентерального введения тизоля.
Выяснить особенности течения регенераторных процессов, мутагенную активность в миелоидной ткани и в эпителии тонкого кишечника после воздействия различных доз ионизирующего излучения и введения тизоля.
Оценить возможность использования при постлучевом воздействии препарата деринат для усиления цитопротективного действия тизоля.
Охарактеризовать цитопротективное действие сочетанного парентерального введения тизоля и дерината при воздействии ионизирующего излучения.
Дать сравнительную характеристику механизму цитопротективного действия тизоля и дерината в условиях воздействия на организм экспериментальных животныхионизирующего излучения.
Научная новизна. В настоящей работе впервые выявлено, что при парентеральном введении препарат тизоль оказывает выраженное антиапоптогенное действие на радиочувствительные ткани (миелоидная ткань, эпителий тощей кишки). Показано, что снижение апоптоза при терапии тизолем имеет дозоза-висимый характер.
Антиапоптогенное действие тизоля усиливается после комбинированного введения цитопротектора тизоль и препарата деринат.
На фоне терапии тизолем, деринатом и комплексной терапии тизолем и деринатом отмечено снижение мутагенной активности. Однако при комбинированном введении препаратов снижение мутагенной активности в эпителии тощей кишки было достоверно более значимым.
Теоретическая и практическая значимость работы. В эксперименте показано терапевтическое действие на радиочувствительные ткани (миелоидная ткань и эпителий тощей кишки) на фоне терапии цитопротектором тизоль и комплексной терапии тизолем и деринатом. При этом наиболее предпочтительным является использование комплексной терапии, поскольку помимо анти-апоптогенного действия здесь имело место более выраженное снижение мутагенной активности.
Обоснована возможность комбинированного введения цитопротектора обладающего антиапоптогенным действием и препарата стимулирующего регенерацию для терапии постлучевого синдрома, предшествующей интенсивной химиотерапии.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:
Научно - практической конференции «Человек и здоровье: применение биокорректоров», г. Москва, 2005 г.
Научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», г. Санкт - Петербург, 2006 г.
IX Всероссийской научно - практической конференции «Человек и его здоровье», г. Санкт - Петербург, 2006 г.
4.61 научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения», г. Екатеринбург, 2006 г.
5. X Российский онкологический конгресс, г. Москва, 2006 г. Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ. На защиту выносятся следующие положения:
Тизоль при парентеральном введении в условиях воздействия ионизирующего излучения оказывает антиапоптогенное действие, снижает мутагенную активность, стимулирует процессы клеточного обновления. Антиапоптогенное действие тизоля имеет дозозависимый характер, о чем свидетельствует снижение выраженности апоптоза при увеличении дозы вводимого препарата.
Тизоль при парентеральном введении в условиях воздействия ионизирующего излучения оказывает антиапоптогенное действие, снижает мутагенную активность, стимулирует процессы клеточного обновления. Антиапоптогенное действие тизоля имеет дозозависимый характер, о чем свидетельствует снижение выраженности апоптоза при увеличении дозы вводимого препарата.
Комплексное использование тизоля и репаранта деринат в условиях постлучевого повреждения оказывает наиболее существенный цитопротективный эффект. При этом цитопротективное действие дерината реализуется через стимуляцию митотической активности и снижение индуцированного мутагенеза, в
то время как тизоль обладает преимущественным действием на снижение апоптоза.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 216 станицах, содержит 99 таблиц, 10 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, двух глав собственных исследований, общего заключения, выводов и списка литературы, включающего 110 работ на русском языке и 160 на иностранных языках.
Современные представления о механизмах восстановления тканей после воздействия ионизирующего излучения
Проблема клеточного восстановления после воздействия повреждающего фактора продолжает оставаться актуальным вопросом современной биологии и медицины.
Регенерация (regeneratio - возрождение, возобновление) - универсальный процесс восстановления утраченных или поврежденных структур организма, являющийся структурной основой адаптации и компенсации нарушенных функций и обеспечивающий сохранение гомеостаза в изменяющихся условиях среды.
Регенерация признана универсальной формой обеспечения компенсаторно - приспособительных процессов жизнедеятельности в организме. Она протекает на всех уровнях организации живого и в обычных условиях (физиологическая регенерация) обеспечивает функционирование всех систем органов [188, 189, 190, 195].
По преобладающему способу регенерации все клетки можно разделить на несколько групп:
1 группа: осуществляется только клеточная регенерация за счет митотиче-ского деления клеток (клетки эпителиальных тканей: кишечных крипт, слизистых, кожи, серозных оболочек, эндотелия; все виды клеток соединительных тканей: костной, хрящевой, рыхлой соединительной ткани, лимфоидной, мие-лоидной {за исключением мегакариоцитарного ростка).
2 группа: регенерация осуществляется на клеточном и внутриклеточном уровнях.
3 группа: регенерация протекает преимущественно на внутриклеточном уровне [6, 25, 96, 159].
Еще в 1972 году исследователи Kerr J.F., и Searle J., обратили внимание на несоответствие парадоксально медленной скорости клеточного обновления и значительной митотической активности клеток поврежденных тканей [3, 11, 24, 32,78,85,83, 121,122, 149-158, 160, 170- 174].
Причину этого несоответствия авторы связали со своеобразной гибелью клеток. Исследователи предположили, что эта форма гибели клеток является важным фактором в определении скорости клеточного обновления [15, 30, 44, 47,58-61,232].
На сегодняшний день известно, что выявленная исследователями «особая» форма гибели клеток - апоптоз.
Апоптоз - это регулируемая гибель клеток, одна из сторон клеточного го-меостаза (вторая - деление клеток) в различных тканях млекопитающих при многих условиях в нормальном онтогенезе, тератогенезе, канцерогенезе, при терапевтически обусловленной регрессии новообразований, атрофии и инволюции тканей и органов [1, 5, 17,40, 43,97- 110].
Апоптоз - следствие действия на клетку различных факторов эндогенной и экзогенной природы. Установлено, что апоптоз осуществляется и контролируется генетическими, иммунными, гормональными и другими механизмами [127,131,134,175-181].
Под влиянием действия на организм ионизирующего излучения могут возникать изменения двоякого рода. В тех случаях, когда интенсивность действия повреждающего фактора превалирует над процессами восстановления, развиваются дистрофические, а затем и некротические изменения в тканях, которые, соответственно, приводят к нарушению специфических функций выполняемых данной тканью; можно говорить об угнетении процессов регенерации [33, 39, 44,111,123,125,146,147].
После воздействия повреждающего фактора (ионизирующее излучение) имеет место две основные формы гибели клеток: апоптоз и некроз.
Гибель клеток по некротическому пути начинается с увеличения объема клетки и разрыва клеточной мембраны. Наступающее нарушение целостности клеточной мембраны приводит к выходу цитоплазматического материала во вне- клеточное пространство, из-за которого в организме развивается воспалительная реакция (апоптотическая гибель клеток не сопровождается воспалением).
Апоптоз клеток в физиологических условиях рассматривается как условие нормального существования организма. В наиболее общей форме назначение апоптоза (в сочетании с его альтернативой - пролиферацией) состоит в определении размеров и «архитектуры» организма, что проявляется:
поддержание численности клеток в популяции на заданном уровне;
определение уровня численности клеток и его изменение под влиянием внешних (по отношению к клетке) сигналов вплоть до полной элиминации данного типа клеток;
селекция разновидностей клеток внутри популяции (в том числе элиминация клеток с генетическими дефектами).
Эти функции апоптоза реализуются на уровне клеточных популяций - в процессе дифференцировки клеток и поддержания их численности [8, 31, 54]. Роль апоптоза в популяции неделящихся клеток минимальна; обычно она сводится к реакции на внешние воздействия (ионизирующее излучение). Напротив, в формирующихся и обновляющихся популяциях клеток апоптозу принадлежит существенная роль фактора, уравновешивающего процессы пролиферации и корригирующего дифференцировку. Из этого следует, что апоптоз играет большую роль в быстро обновляющихся тканях [48, 63, 69, 76, 87].
Зная о роли апоптоза в осуществлении физиологических процессов можно предположить, что недостаточность проявления апоптоза должна отразиться на процессах морфогенеза, элиминации клеток с генетическими поломками, выражаться в форме разного рода дефектов развития, аутоиммунных процессов и злокачественных опухолей. Однако моделирование ослабления апоптоза путем трансфекции мышам гена Всі- 2 в форме, предусматривающей его спонтанную экспрессию показало, что спектр проявляющихся при этом дефектов уже, чем можно было ожидать. Основное последствие гиперпродукции Всі - 2 состоит в развитии аутоиммунных процессов. У мышей не наблюдалось повышения частоты развития злокачественных опухолей. Лишь при одновременной гиперэкспрессии трансфецированного гена с - туе у мышей наряду с аутоиммунными развивались лимфопролиферативные процессы (Strasser A. et at., 1991).
Вторую большую группу заболеваний, к генезу которых имеет отношение подавление апоптоза, образуют злокачественные опухоли, особенно имеющие гематогенное происхождение (Kornblau S. М. et. al., 1998). В этом случае ключевым событием, способствующим развитию патологии, чаще всего служат соматические мутации, затрагивающие ген р53. Фактор р53 трансформирует сигнал о нерепарированных разрывах цепей ДНК в сигнал к развитию апоптоза [161,174,178,182].
Распространенными вариантами патологии, развивающейся в сформировавшемся организме в связи с усилением апоптоза, являются разного рода аплазии и дегенеративные процессы: апластическая анемия, анемии при дефиците железа, фолатов, витамина В12 и др.
Большую группу заболеваний, связанных с усилением апоптоза, образуют инфекционные процессы. Индукторами апоптоза служат бактериальные эндотоксины и экзотоксины. Последние, как правило, выступают в роли суперантигенов, вызывая массовую пролиферацию Т - лимфоцитов с их последующей гибелью по механизму апоптоза (Kawabe Y., Ochi А., 1991).
Другим примером болезней, связанных с усилением апоптоза, являются заболевания нервной системы, вызываемые атрофией ее определенных участков (болезнь Альцгеймера).
Со временем увеличивается доля патологических процессов, основывающихся на усилении апоптоза, которое вызвано действием апоптогенных факторов. Первое место среди них занимает ионизирующая радиация. В связи с тем, что она индуцирует апоптоз преимущественно лимфоидных клеток, эта сторона ее действия проявляется в иммунной недостаточности, хотя вызываемые облучением нарушения кроветворения, частично обусловлены индукцией апоптоза клеток-предшественников [21, 40, 66, 70, 79, 130, 143, 166,].
Восстановление организма после острого лучевого поражения в первом приближении можно свести к пролиферации клеток, сохранивших жизнеспособность, благодаря чему восполняется убыль популяции клеток критических органов и систем, а, следовательно, восстанавливается их функциональная полноценность [34, 72, 82, 165, 170, 187, 192, 199, 200, 211].
Методы исследования кроветворной ткани
Морфологическое исследование крови и костного мозга. Кровь для исследования брали у крыс из хвостовой вены. Подсчет количества лейкоцитов проводили в счетной камере Горяева (КостЕ.А. 1968).
При определении числа ретикулоцитов их подсчитывали в окрашенных бриллиант - крезнл - блау мазках крови на 2000 эритроцитов.
Мазки периферической крови окрашивали по Романовскому. Подсчет лейкоцитарной формулы проводили на 200 клеток.
Для исследования морфологии костного мозга его извлекали из бедренной кости. Мазки костного мозга окрашивали по Нохту (Кост Е.А., 1975). Подсчет миелограммы производили на 500 клеток.
Определяли общее количество миелокариоцитов в костном мозге бедренной кости (Груздев Г. П., 1965). Для этого костный мозг бедренной кости с помощью резинового баллона выдували на часовое стекло, где его осторожно растирали стекляной палочкой и быстро насасывали в смеситель для эритроцитов до метки «0,5», а затем до отметки «101» набирали 3 % раствор уксусной кислоты. После этого поступали так же, как при подсчете лейкоцитов крови.
Содержание клеток в костном мозге (данные миелограммы) и периферической крови (данные лейкоцитарной формулы) было выражено в процентном отношении к контролю.
Оценка апоптоза и пролиферативной активности элементов гранулоцитар-ного и эритроидного ростков производилась в цитологических мазках костного мозга при окраске гематоксилин - эозином.
Пролиферативную активность эритроидного и гранулоцитарного ростков оценивали с помощью определения митотического индекса (МИ) соответствующих дифферонов. Подсчитывали элементы с четырьмя морфологически выделяемыми стадиями митоза встречаемых на 500 клеток, полученный результат выражали в промилях.
С целью количественной оценки интенсивности процессов регенерации в изучаемых днфферонах рассчитывали индекс клеточного обновления (ИКО), равный отношению митотического индекса к апоптотическому.
Производили подсчет патологических митозов эритроидного и гранулоцитарного ростков, после чего, выражали их в процентном отношении к количеству нормальных митозов.
Приготовление, окраска, микроскопия и подсчет микроядер в ретикулоци-тах костного мозга крыс.
1 .Забой животных осуществляли методом цервикальной дислокации, после чего извлекали бедренная кость.
2.Кожа над коленом задней конечности была собрана в складку, после чего производился надрез ножницами. Стянутую под коленом кожа и мышечная масса протыкали вблизи сустава одной браншей ножниц и, в дальнейшем разрезали их. Задние конечности были отделены от тела вместе с частью тазовых костей. Растягивая коленный сустав и осторожно вывертывая его, производилось вычленение дистальной части бедренной кости из коленного сустава. Скальпелем производилось удаление мягких тканей бедра. Вывертывая из вертлужной впадины тазобедренного сустава проксимальный конец осуществлялось окончательное отделение бедренной кости. Марлевой салфеткой удалялись остатки мягких тканей, сгустки крови.
3. На обезжиренное оптическое стеклышко наносилась сыворотки АВ0 (IV) группы крови человека.
4. Срезая эпифизы бедренной кости, производили открытие костномозгового канала. На проксимальный конец бедренной кости натягивали резиновую трубочку (длина 15 см), другой конец которой сообщался с резиновой грушей. Резкое сжатие груши приводило к выбросу костного мозга из костномозгового канала на оптическое стеклышко.
5. Далее стеклянной палочкой, круговыми движениями готовили суспензию клеток костного мозга, она должна быть определенной плотности - иметь беловатую опалесцирующую окраску.
6. После приготовления, каплю этой суспензии наносили на край обезжиренного предметного стекла. Распределение материала по стеклу осуществляли перемещением позади шлифованного стекла под углом 45. Оптимальная длина мазка 2-3 см.
7. Мазок высушивался на воздухе в течение суток.
8. Окрашивание мазков по Паппенгейму (производилось на следующий день).
Фиксация в метаноле 1 минуту.
Краситель Май-Грюнвальд (спиртовой раствор): смешивался с фосфатным буфером 1:1. Время покраски 1,5 минут.
После того, как краску слили, без промывания, залили раствором красителя Романовского-Гимзы. Время покраски 10 минут.
Раствор Романовского-Гимзы готовили на водопроводной воде 1:6 (10 мл Романовского + 60 мл воды). Краску готовили непосредственно перед окрашиванием.
Затем промывание в гистологичеких стаканчиках под струей воды (струя не на стекла!).
Обезжиривание стекол.
1. Стекла моют губкой с порошком под проточной водой.
2. Вымачивают в хромовом растворе сутки.
3. Достают пинцетом и укладывают в глубокий эксикатор.
4. Промывают в проточной воде в течение 20-40 минут.
5. Промывают дистиллированной водой.
6. Высушивают на воздухе между листами фильтровальной бумаги или в сушильном шкафу.
7. Хранят в растворе эфира и спирта (смесь Никифорова).
Приготовление смеси Никифорова.
Смесь представляет собой смесь спирта и эфира в пропорции 1:1, Сначала в емкость выливают спирт, а за тем добавляют эфир. Приготовление идет под вытяжкой. Емкость для смеси предварительно моют по всем правилам приготовления посуды. Оптимальный объем смеси составляет I см3 на 1 стекло (с учетом испарения).
8. Микроскопия осуществлялась в проходящем свете под объективом с масляной иммерсией с матовым фильтром. Анализировались отдельно лежащие ретикулоциты и ретикулоциты с микроядрами. МЯТ рассчитывали как отношение числа ретикулоцитов с микроядрами к 1000 подсчитанных ретикулоцитов, выраженное в промилях (Методические рекомендации по оценке мутагенной активности химических веществ микроядерным тестом, подготовлены Всесоюзным научно - исследовательским институтом дезинфекции и стерилизации Министерства здравоохранения СССР, Москва 1984).
Показателем качества мазка является отсутствие поврежденных ядерных клеток. Эритроциты хорошо расправлены. Зрелые эритроциты оранжево-красные, ретикулоциты серовато-голубые.
Микроядра - в абсолютном большинстве случаев округлой формы, реже овальной или кольцевой. Расположены центрально или эксцентрично; представляют собой гомогенно окрашенные в красно-фиолетовый цвет - хромати-новые тельца. Не преломляют свет, размером не более % диаметра эритроцита. В одной клетке крайне редко встречаются два и более микроядер.
Состояние миелоидной ткани на 1 сутки у лабораторных животных, подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, на фоне введения препаратов тизоль и деринат
Вызванное воздействием ионизирующего излучения значительное угнетение гемопоэза. сделало невозможным подсчет МЯТ.
В контрольной подгруппе при подсчете числа митозов в клетках эритроидного и гранулоцитарного дифферонов установлено значительное снижение пролиферативной активности.
При подсчете клеток в состоянии апоптоза эритроидного и гранулоцитарного дифферонов. выявлено выраженное повышение уровня апоптоза.
Интенсивность регенерации в изучаемых ростках, была ниже контрольных значений.
При подсчете числа патологических митозов (рис. 6) в эритроидном и гра-нулоцитарном ростках, установлено, что их содержание превышало контрольные контрольные показатели (табл. 3.3.1).
При подсчете миелограммы отмечено угнетение эритропоэза и гранулоци-топоэза, вследствии того, что происходит уменьшение содержания элементов этих ростков. ГЭС превышает контрольные значения, так как эритроидный росток проявил большую чувствительность к воздействию ИИ. Содержание лимфоцитов в костном мозге значительно ниже границы нормы.
Процесс гемоглобинизации элементов красного ростка соответствовал значениям нормы (табл. 3.3.2).
При подсчете ретикулоцитов ПК, подсчете лейкоцитарной формулы, выявлен ретикулоцитоз, нейтрофильный лейкоцитоз, лимфопения (табл. 3.3.3).
В подгруппе лабораторных животных, которым вводился препарат тизоль при подсчете числа митозов в клетках эритроидного и гранулоцитарного дифферонов не отмечено значимого терапевтического действия тизоля на пролифе-ративную активность и значения митотического индекса на 1 сутки оставались ниже нормы.
При подсчете клеток в состоянии апоптоза эритроидного дифферона, выявлено антиапоптогенное действие (АИ 4,21 ± 0,41 %о, р 0,05 по сравнению с контрольной подгруппой). При этом уровень апоптоза оставался повышенным.
При подсчете клеток в состоянии апоптоза гранулоцитарного дифферона установлено снижение уровня апоптоза (АИ 4,54 ± 0,32 %о, р 0,05 по сравнению с контрольной подгруппой), но, также как и в эритроидном ростке уровень апоптоза превышал значения нормы.
Анализируя интенсивность регенерации в эритроидном и гранулоцитарном диффероне, отмечено увеличение скорости клеточного обновления (ИКО 0,42 ± 0,14, р 0,05 и 0,36 ± 0,06, р 0,05 соответственно). Однако полного восстановления регенераторной активности не произошло, и она оставалась ниже нормы.
При подсчете числа патологических митозов в эритроидном ростке, выявлено снижение количества аномальных митозов (ПМ 16,14 ± 1,18 %, Р 0,05).
При подсчете числа патологических митозов в гранулоцитарном ростке, не отмечено изменений подобной митотической активности по сравнению с контрольной подгруппой (табл. 3.3.4).
При подсчете миелограммы установлено стимулируюшее действие препарата на эритропозз (Эр.эл. 8,03 ± 1,08 %, р 0,05). Этот эффект обусловлен увеличением количества базофильных (1,14 + 0,26 %, р 0,05) и полихроматофиль-ных нормобластов (5,30 ± 0,95 %, р 0,05). Общее количество элементов красного ростка было ниже значений нормы. Таким образом, нашло свое отражение действие препарата на регенерацию эритрона.
Общее содержание гранулоцитов было снижено, однако отмечено увеличение содержания отдельных элементов данного ростка (миелоциты 6,29 ± 0,84 %, р 0,05).
Значение ГЭС было достоверно выше, чем в контрольной группе, что обусловлено большей радиочувствительностью эритрона.
На фоне введения препарата, отмечалось нарушение процесса созревания нейтрофилов в сторону преобладания более зрелых форм. В то же время не выявлено значимого изменения скорости процессов созревания нейтрофилов и эритронормобластов по сравнению с подгруппой контроля.
В настоящем эксперименте количество лимфоцитов в костном мозге, при значительной лучевой нагрузке к концу 1 суток было значительно ниже нормы. В данном случае процесс гибели преобладает над процессом миграции лимфоцитов в костный мозг и, как следствие, выраженное уменьшение содержания лимфоцитов в костном мозге. При облучении дозой 3 Гр мы уже не наблюдаем значительного лимфоцитарного пика в костном мозге. Реактивный выход рети-кулоцитов и нейтрофильных гранулоцитов в периферическую кровь выражен в большей степени, чем при облучении 0,5 Гр (табл. 3.3.5).
В подгруппе лабораторных животных, которым вводился препарат деринат при подсчете числа митозов в клетках эритроидного и гранулоцитарного диф-феронов выявлено снижение пролиферативной активности по сравнению с группой контроля. В данном случае, препарат не проявил значимого влияния на митотическую активность.
При подсчете клеток в состоянии апоптоза эритроидного и гранулоцитарного дифферонов не установлено значимой разницы в уровне апоптоза между опытной и контрольной подгруппой.
Изучая интенсивность регенерации, в обоих анализируемых дифферонах, не отмечено достоверного влияния препарата на процессы регенерации. Отмечалось угнетение процессов клеточного обновления по сравнению с контрольной группой.
При подсчете числа патологических митозов в эритроидном ростке, не отмечено значимого изменения изучаемого показателя по сравнению с контрольной подгруппой.
При подсчете миелограммы, выявлен терапевтический эффект после введения дерината на популяцию эозинофилов (1,06 ± 0,11, р 0,05). Тем не менее, сохранялось угнетение эритропоэза и гранулоцитопоэза. Показатель ГЭС превышал значения нормы, что обусловлено выраженным снижением количества элементов эритрона. То есть при облучении 3 Гр эритроидный росток вновь проявил большую радиочувствительность по сравнению с гранулоцитарным.
Регенерация слизистой оболочки тощей кишки на 1 сутки у лабораторных животных, подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, на фоне введения препаратов тизоль и деринат
В контрольной подгруппе при гистологическом исследовании срезов тощей кишки выявлено: диффузная деструкция в области верхушек ворсин, местами некротические изменения достигают подслизистой оболочки; имеет место выраженная перифокальная гранулоцитарная инфильтрация. В собственном слое слизистой и в подслизистой оболочке выраженный отек и лимфоплазмо-цитарная инфильтрация; со стороны сосудов микроциркуляторноного русла отмечается резко выраженный капилляростаз и лимфостаз. Визуально определяется резкое снижение количества митотически делящихся клеток крипт.
При подсчете числа митозов, установлено резкое угнетение митотической активности эпителиоцитов крипт.
При подсчете эпителиоцитов в состоянии апоптоза обнаружено резкое увеличение уровня апоптоза.
Интенсивность клеточного обновления в слизистой оболочки тощей кишки резко снижена.
При подсчете средней клеточности в I крипте, подсчете числа патологических митозов в собственном слое слизистой, отмечено увеличение анализируемых показателей (табл. 4.3.1).
В подгруппе лабораторных животных, которым вводился препарат тизоль, при гистологическом исследовании срезов тощей кишки выявлены диффузные деструктивные изменения верхушек ворсин с выраженной перифокальной гра-нулоцитарной инфильтрацией. В собственном слое слизистой и в подслизистой оболочке умеренно выраженный отек и лимфоплазмоцитарная инфильтрация; менее выраженный, чем в контрольной подгруппе капилляростаз и лимфостаз. Визуально определяется выраженное уменьшение количества митотически делящихся клеток.
При подсчете числа митозов в криптах, не отмечено изменения пролифера-тивной активности по сравнению с контрольной подгруппой и значение МИ было достоверно ниже границы нормы.
При подсчете эпителиоцитов в состоянии апоптоза, выявлено снижение апоптоза (АИ 8,71 ±0,42 %, Р 0,05). Уровень апоптоза оставался выше значений СУА.
Интенсивность процессов регенерации в слизистой оболочке тощей кишки, как следствие влияния терапии тизолем на митотическую активность и на апоптоз эпителия, была выше, чем в контрольной подгруппе (ИКО 0,50 ± 0,03, р 0,05).
При подсчете средней клеточности в 1 крипте, установлено увеличение содержания криптального эпителия (СКК 58,43 ± 1,92, р 0,05), тем не менее, этот показатель был значительно ниже нормы.
При подсчете числа патологических митозов в собственном слое слизистой, отмечено снижение мутагенной активности по сравнению с контрольной подгруппой, в то же время количество аномальных митозов было выше значений нормы (табл. 4.3.2).
В подгруппе лабораторных животных, которым вводился препарат деринат при гистологическом исследовании срезов тощей кишки выявлено: диффузные некротические изменения верхушек ворсин с умеренно выраженной перифокальной гранулоцитарной инфильтрацией. В собственном слое слизистой я в подслизистой оболочке резко выраженный отек и лимфоплазмоцитарная инфильтрация, выраженное полнокровие сосудов микроциркуляторного русла и лимфостаз. Визуально определяется уменьшение количества митотически делящихся клеток.
При подсчете числа митозов в криптах, не выявлено значимого пролиферативного ответа на введение препарата, и митотическая активность оставалась ниже значений нормы.
При подсчете эпителиоцитов в состоянии апоптоза, установлено снижение апоптоза (АИ 9,58 ± 0,32 %, Р 0,05), антиапоптогенное действие препарата, вероятно, обусловлено его репаративными возможностями. В то же время, уровень апоптоза в опытной подгруппе превышал СУА.
Интенсивность процессов регенерации в слизистой оболочке тощей кишки, не отличалась от значения этого показателя в контрольной подгруппе.
При подсчете средней клеточности в крипте, подсчете числа патологических митозов в собственном слое слизистой, не выявлено значимой разницы изучаемых показателей по сравнению с контрольной подгруппой (табл. 4.3.3).
В подгруппе лабораторных животных, которым проводилось комплексное введение тизоля и дерината при гистологическом исследовании срезов тощей кишки выявлено: очаговые некротические изменения верхушек ворсин с умеренно выраженной перифокальной гранулоцитарной инфильтрацией. В собственном слое слизистой и в подслизистой оболочке умеренно выраженный отек и лимфоплазмоцитарная инфильтрация, умеренно выраженное полнокровие сосудов микроциркуляторного русла и лимфостаз.
При подсчете числа митозов в криптах, не отмечено изменения пролифера-тивной активности, при этом она оставалась ниже значений нормы.
При подсчете эпителиоцитов в состоянии апоптоза, выявлено антиапопто-генное действие (АИ 10,12 ± 0,56 %, р 0,05), однако уровень апоптоза все же превышал значения СУА.
Анализируя интенсивность процессов регенерации в слизистой оболочке тощей кишки, следует отметить, что здесь нашло свое отражение действие комплексной терапии на апоптоз; скорость клеточного обновления была выше, чем в контрольной подгруппе (ИКО 0,51 ± 0,05, р 0,05).
При подсчете средней клеточности в 1 крипте, установлено увеличение клеточности крипты {СКК 58,03 ± 4,04, р 0,05), тем не менее, этот показатель был ниже границы нормы (табл. 4.3.4).
При подсчете числа патологических митозов в собственном слое слизистой, выявлено снижение мутагенной активности по сравнению с контрольной подгруппой (ПМ 8,40 ± 1,27 %, р 0,05).
Таким образом, следует подчеркнуть, что тизоль при облучении подопытных животных дозой 0,5 Гр и 3 Гр оказывал выраженное антиапоптогенное действие (АИ 5,28 ± 0,48, - 19,0 %, р 0,05 и 8,71 ± 0,42, - 24,9 %, р 0,05). Это нашло свое отражение в увеличении регенерации эпителия тощей кишки и в увеличении содержания криптального эпителия (3 Гр: СКК + 19,7 %, р 0,05). На фоне терапии тизолем отмечено снижение мутагенной активности (3 Гр: ПМ-17,6%,р 0,05).
После введения препарата деринат, выявлено увеличение количества митозов (0,5 Гр: МИ + 18,3 %, р 0,05), снижение апоптоза (3 Гр: АИ - 17,4 %, р 0,05), увеличение скорости регенерации и, как следствие, увеличение численности эпителия крипт (0,5 Гр: СКК + 19,6 %, р 0,05). На уровень патологических митозов терапия деринатом значимого действия не оказывала.
На фоне комплексной терапии выявлено усиление цитопротективного действия тизоля, которое выражалось в значительном снижении индуцированной мутагенной активности в эпителии тощей кишки. Уровень патологических митозов на фоне комплексной терапии был на 22,9 % (р 0,05) ниже, чем после введения тизоля и на 23,8 % (р 0,05) ниже относительно введения дерината. Также было выявлено антиапоптогенное действие (АИ 0,5 Гр: - 18,2 %, р 0,05; ЗГр: - 12,7 %, р 0,05), увеличение скорости регенерации.
На митотическую активность значимого эффекта выявлено не было, тем не менее, установлено увеличение значения средней клеточности крипты (3 Гр СКК: 58,03 ±4,04,+ 18,8 %, р 0,05), данный показатель на 13,0 % (р 0,05) превышал значение СКК после введения дерината. Этот факт можно объяснить влиянием комплексной терапии на выраженность апоптоза.
