Введение к работе
Актуальность проблемы
Инвазия и метастазирование рака являются результатом ряда взаимозависимых процессов, важную роль в регуляции которых играют протеолитические ферменты (Liotta L.A., Kohn Е.С., 2001). В процессе канцерогенеза малигнизированные клетки вырабатывают ряд протеаз, разрушающих клеточные мембраны и внеклеточный матрикс, способствуя тем самым проникновению раковых клеток в окружающие ткани.
Протеолитические ферменты, участвующие в опухолевой прогрессии и метастазировании, принадлежат к четырём основным типам протеаз: матриксные металлопротеиназы, сериновые протеазы, цистеиновые и аспартатные протеазы (Del Rosso М, Fibbi G., Pucci, et al, 2002; Egeblad M., Werb Z., 2002; Turk V., Kos J., Turk В., 2004). Лизосомальные цистеиновые протеазы (катепсины) относятся к семейству папаиноподобных протеолитических ферментов, локализующихся главным образом в эндосомах и лизосомах. Семь цистеиновых протеаз, катепсины В, С (дипептилил пептидаза I), F, Н, L, О и X (другие названия: катепсин Z, катепсин Р) экспрессируются всеми типами клеток организма, тогда как остальные папаиноподобные цистеиновые протеазы (катепсины J, К, S, V, и W) экспрессируются только специфическими типами клеток (Deussing J., Kouadio М., Rehman S. et al, 2002, Rawlings N.D, Barret A.J., 2002).
Традиционно считалось, что лизосомальные цистеиновые протеазы выполняют неспецифические функции в лизосомах (Barret A.J., 1992). Тем не менее, на протяжении последних двух десятилетий были получены множественные доказательства специфических функций этих ферментов в ряде физиологических и патологических процессов (Friedrichs В., et al, 2003, Goulet В., et al, 2004). Было показано, что лизосомальные протеазы способны секретироваться внеклеточно, где они были обнаружены в больших
количествах при некоторых заболеваниях, включая рак (Sloane B.F., et al, 2005). Повышенная экспрессия катепсина В была выявлена в клетках карциномы молочной железы человека (Poole A.R., et al, 1978). Кроме того, увеличение экспрессии и протеолитической активности лизосомальных протеаз (например, аспартатных протеаз, катепсина D и цистеиновых протеаз, катепсинов В и L) часто связывают с плохим прогнозом для пациентов с различными злокачественными образованиями, в том числе с аденокарциномой молочной железы (Castiglioni Т. et al, 1994, Frohlich Е. et al, 2001, Staack A. et al, Koenig F. et al, 2002).
Большинство экспериментальных доказательств участия лизосомальных цистеиновых протеаз в образовании опухолей было получено с использованием моделей ex vivo (Couliably S., et al, 1999, Mohanam S. et al, 2001, Premzl A. et al, 2003). Недавнее исследование с использованием ингибитора цистеиновых катепсинов широкого спектра в модели мышей Ripl-Tag2 идентифицировало роль цистеиновых катепсинов в ангиогенезе, росте и инвазивности опухоли поджелудочной железы (Joyce J.A., et al, 2004). Несмотря на то, что полученные данные подтверждают важность этого класса протеаз, они не раскрывают значимости отдельных катепсинов, в частности катепсина В, в отдельных этапах прогрессии in vivo, что является целью планируемого исследования.
Для установления роли катепсина В в развитии рака молочной железы была разработана трансгенная модель мышей с отсутствием катепсина В путём скрещивания катепсин-В-дефицитных мышей (Halang W., et al, 2000) с предрасположенной к раку молочной железы линией мышей [polyoma middle Т antigen (РуМТ)], в которой экспрессия РуМТ индуцируется в эпителиальных клетках молочной железы за счёт использования промотора вируса опухоли молочной железы мышей (mouse mammary tumor virus (MMTV)) (Guy СТ., et al, 2002).
Результаты исследований в этом направлении позволят установить роль катепсина В в возникновении и развитии РуМТ-индуцированной карциномы молочной железы и её гистопатологической прогрессии. Кроме того, исследования первичной клеточной культуры раковых клеток, полученных от трансгенных мышей, позволят установить роль отдельных катепсинов в патогенезе раковой прогрессии.
Цель исследования:
Установить роль катепсина В в патогенезе РуМТ-индуцированной карциномы молочной железы.
Задачи исследования
Разработать и оценить модель экспериментального длительного исследования формирования, роста и развития опухолей молочной железы у мышей.
Оценить влияние катепсина В на формирование и рост РуМТ-индуцированных опухолей.
Определить роль катепсина В в процессе гистопатологической прогрессии рака молочной железы.
Изучить свойства раковых клеток с разными генотипами катепсина В in vivo.
І І П ГТЛЧЛОЇЇ1І" ПІ »»»/ЛЛ»Я» «T »n І1Л гіоічтіт-іт
iiUJiumcnun) ooiiiuviiiviDic псі эащщу
1. Экспериментальная модель карциномы молочной железы, разработанная с использованием РуМТ трансгена у мышей, характеризуется формированием опухолей эпителиального и мезенхимального типа, среди которых аденокарциномы составляют значительную долю. Экспрессия middle Т-антигена в трансгенных линиях животных под контролем промотора MMTV-
LTR (mouse mammary tumor virus promotor) приводит к синхронному появлению мультифокальных опухолей во всех молочных железах, при этом у большинства животных развиваются многочисленные лёгочные метастазы.
2. Лизосомальная цистеиновая протеаза катепсин В способствует
возникновению, росту, инвазии и метастазированию РуМТ-индуцированной
карциномы молочной железы в экспериментальной модели PyMT;ctsb+/+
мышей.
3. Сроки развития аденокарциномы у PyMT;ctsb+/+ мышей короче, а
скорость прогрессирования достоверно выше по сравнению с PyMT;ctsb-/-
генотипом. Объём лёгочных метастазов у PyMT;ctsb+/+ мышей на 45%
превышает таковой у PyMT;ctsb+/- и на 60% - у PyMT;ctsb-/- животными.
Научная новизна
Впервые изучена роль катепсина В в процессах формирования, роста и развития опухолей молочной железы в эксперименте. Установлено, что карциномы у PyMT;ctsb-/- мышей развиваются медленнее, чем у PyMT;ctsb+/+ животных.
Обосновано, что катепсин В способствует разрастанию опухолевой ткани и увеличению общей массы опухолей.
Впервые показано также, что катепсин В-зависимые изменения пролиферации могут способствовать развитию небольших опухолей и торможению процессов метастазирования у PyMT;Ctsb+/- и ?yMT;Ctsb-/-мышей.
Результаты результаты исследования гистопатологической прогрессии РуМТ-опухолей молочной железы позволяют сделать вывод о том, что отсутствие катепсина В снижает количество злокачественных опухолей у нокаутов по сравнению с выходом их у PyMT;ctsb+/+ животных в возрасте 14 недель.
Научно-практическая значимость:
Установлена роль катепсина В как фактора, ускоряющего рост и гистопатологическую прогрессию РуМТ-индуцированной карциномы молочной железы. При этом обосновано, что РуМТ-индуцированная карцинома развивается раньше и быстрее у PyMT;ctsb+/+ генотипа мышей. Данный генотип характеризуется и большим объёмом лёгочных метастазов. Результаты исследования первичной клеточной культуры раковых клеток, полученных из трансгенных мышей, выявляют вклад отдельных катепсинов в патогенезе раковой прогрессии и могут быть использованы при разработке новых патогенетически обоснованных подходов к терапии злокачественных новообразований.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены и обсуждены:
на 22-й зимней школе по протеиназам и их ингибиторам (Тирс: Италия, 2005г.);
на 4-м заседании Международного сообщества протеолиза (Квебек: Канада, 2005г.);
на 23-й зимней школе по протеиназам и их ингибиторам (Тирс: Италия, 2006г.)
на 4-й конференции экспериментальной онкологии (Краньска Гора: Словения, 2006г.)
на 5-й международной конференции посвященной цистеиновым протеиназам и их ингибиторам (Порторож: Словения, 2006)
на 5-й заседании Международного сообщества протеолиза (Патрас: Греция, 2007г.)
на 5-й конференции экспериментальной онкологии (Краньска Гора: Словения, 2008г.)
Публикации
По результатам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ - 1, в журналах перечня PubMed - 2, в тезисах докладов на съездах и конференциях международного уровня - 8.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 96 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», описания собственных результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 13 рисунками. Список литературы состоит из 217 источников, из них 21 отечественный и 196 иностранных.
