Введение к работе
Актуальность проблемы. Активация протеолитической системы является универсальным звеном в развитии опухолевого процесса (Локшина Л. А., 1991: Оглоблина О. Г. и Арефьева Т. И., 1994; LahT. and Kos J., 1998; Ferreras M. et al, 2000: DeClercke Y. et al, 2004). С повышенной способностью синтезировать и секретировать цистеиновые, сериновые и аспартильные протеиназы опухолевыми клетками связывают инвазивный рост (Keppler D. et al., 1994; Kirchke H. et al, 1997; Levicar N. et al, 2003), ангиогенез и метастазирование злокачественных опухолей (Werle В., 1997; Korolenko Т. A. et al, 1998; Turk В. et al, 2002; Sloane В. F. et al, 2003). Высокая активность цистеиновых протеиназ характерна для мембранных фракций опухолевых клеток (Okamoto I. et al, 1999, Verle В. et al, 2003). В тканях многих опухолей показано повышение экспрессия мРНК цистеиновых протеиназ, увеличение активности и содержания ка-тепсинов В, L и Н (Kirschke Н. et al, 1995; Korolenko Т. A. et al, 1998; Lah Т. et al, 2003), обнаружено нарушение гликозилирования катепсинов, увеличение их предшественников (Moin К. et al, 1998; Короленко Т. А. и др., 2004). Лизосо-мальные цистеиновые протеиназы расщепляют многие белки внеклеточного матрикса, что приводит к деструкции ткани, лизису базальной мембраны и способствует инвазии опухолей. Протеиназы могут ослаблять антигенные свойства раковых клеток путем расщепления определенных участков, ответственных за иммуноспецифичность, модифицировать иммуноглобулины таким образом, что последние теряют свою защитную функцию против раковых клеток (Веремеенко К. Н., 2000).
Функции цистеиновых протеиназ регулируются эндогенными ингибиторами — цистатинами, стефинами и кининогенами (Hibbetts К. et al, 1999; Grubb А, 2000). Предполагают, что внутриклеточные ингибиторы лимитируют активность протеолитических ферментов, тем самым сдерживают инвазию и метастазирование опухолей (Turk В et al, 2002; Sever N et al, 2003). Снижение количества ингибиторов цистеиновых протеиназ при трансформации доброкачественной папилломы в карциному у мышей (Hawley-Nelson P. et al, 1998), низкая концентрация ингибиторов в опухолевой линии эмбриональных фибробла-стов крыс по сравнению с нормальными клетками (Sloane В. F. et al, 1999) приводят к неконтролируемому росту опухоли. Проведение исследований, связанных с изучением эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ при различных патологических состояниях, в том числе и канцерогенезе, затруднено тем, что количество ингибиторов в биологических жидкостях и тканях измеряется в нано- и пикомолях и становится возможным с развитием иммуноферментных технологий. До настоящего времени роль внутриклеточных ингибиторов, лимитирующих действие протеиназ при опухолевом росте, изучено недостаточно.
,Г РОС. НАЦИОНАЛЬНА» I
J БИБЛИОТЕКА 1
\ 09 МО0--*^ *
Перспективным в этом отношении является поиск факторов, влияющих на повышение содержания эндогенных ингибиторов в организме, что может стать новым подходом к терапии злокачественных опухолей. Например, применение синтетических ингибиторов цистеиновых протеиназ Е-64 или флюорометилке-тона in vivo приводит к стойкому и полному подавлению некоторых экспериментальных опухолей (Coulibaly S et al, 1999, Van Noorden С. J. et al, 2000). Введение гена цистатина С в клетки карциномы мыши сопровождается снижением инвазивной способности опухоли (Huh С. J. et al, 1999).
На современном этапе развития онкологии все большее внимание уделяется изысканию средств, патогенетически влияющих на опухолевый процесс и усиливающих эффективность химиотерапии. Для клинической медицины наиболее перспективны водорастворимые полисахариды, такие как карбоксимети-лированный и сульфоэтилированный (1—*3)-р-0-гликаны, обладающие способностью стимулировать секрецию цитолитических /цитостатических факторов макрофагов. Обнаружено противоопухолевое и антиметастатическое действие (1—*3)-р-В-гликанов на моделях опухолей мышей с химически индуцированной саркомой печени, меланомой и при клиническом использовании у человека (Czop J., Kay J, 1991; Kasai S et al, 1991; Kogan G., 2003). Однако, до настоящего времени остается не исследованным влияние цитостатиков и водорастворимых полисахаридов со структурой (1—»3)-Р41>-гликанов на содержание эндогенных ингибиторов в тканях опухоли. Неизвестно, связан ли механизм их действия со способностью изменять уровень эндогенных ингибиторов в организме. Остается неизученным, могут ли исследуемые гликаны стимулировать синтез и секрецию ингибиторов протеиназ в макрофагах, подобно синтезуФНО-а. Представляет интерес изучение Украина (Ukrain, Nowicky Pharma, Австрия) - нового полусинтетического средства, приготовленного на основе растительного сырья (производное алкалоидов Чистотела большого, Chelidonium maps L), известного как иммуностимулирующий препарат с антинеопластическим действием (Liepins А. etal, 1996; Nowicky J., 1996)).
В последнее время обсуждается иммуномодулирующая роль липопротеи-нов, известных ранее только как средство транспортировки триглицеридов, холестерина и других липидов в организме. Сегодня липопротеины привлекают внимание в связи с выполнением ими функций, не связанных с обменом липидов: влияние на стероидогенез (Поляков Л. М., Панин Л. Е., 2000), сердечнососудистую (Parhami F et al, 2002) и иммунную системы (Desanctis J. В. et al, 1995; Доценко Э. А. и др., 2001), защита организма от инфекции (Burger D., Dayer J., 2002). В современной литературе имеются лишь единичные сообщения о стимулирующем влиянии липопротеинов и их белковых компонентов на экспрессию отдельных генов и синтез некоторых белков (Ashby D. Т. et al, 1998; Zerbinatti С, Dyer С, 1999). Липопротеины могут изменять функциональ-
ную активность макрофагов (Banfi С. et al, 2002; Salomonsson L. et al, 2003). Полагают, что с активацией макрофагов сопряжена их противоопухолевая активность (Литвяков Н. И. и др., 2001; Herbeuval J-Ph. et al., 2003). Остается не исследованным влияние липопротеинов на синтез и секрецию ингибиторов цистеиновых протеиназ в макрофагах в норме и в условиях опухолевого роста.
Цель исследования. Выявить роль эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ как факторов, сдерживающих инвазию и метастазирование злокачественных опухолей и изучить механизмы их регуляции под влиянием противоопухолевых препаратов.
Для этого были поставлены следующие задачи:
-
Определить содержание цистатина С и стефина А в тканях и биологических жидкостях человека и мыши в норме.
-
Исследовать содержание цистатина С и стефина А в опухолевой ткани и органах, не вовлеченных в опухолевый процесс (печень, селезенка, сыворотка крови) при развитии экспериментальных мышиных опухолей: лимфосаркомы LS, НА-1 гепатомы и аденокарциномы легких Льюис LLA.
-
Исследовать взаимосвязь между противоопухолевым эффектом цикло-фосфана, водорастворимых (1—»3)-Р-0-гликанов, Украина и содержанием ингибиторов цистеиновых протеиназ в тканях и сыворотке крови при изолированном и совместном введении препаратов на моделях лимфосаркомы LS и аденокарциномы легких Льюис LLA.
-
Исследовать взаимосвязь между противоопухолевым эффектом Украина, карбоксиметилированного (1—>3)-Р-П-гликана и содержанием ингибиторов цистеиновых протеиназ в тканях и в сыворотке крови при изолированном введении препаратов на модели НА~ 1 гепатомы.
-
Исследовать содержание цистатина С в сыворотке крови при развитии и лечении лимфосаркомы BLS, резистентной к противоопухолевой химиотерапии.
-
Изучить взаимосвязь между весом опухоли и содержанием цистатина С в тканях опухоли и в сыворотке крови мышей с экспериментальными опухолями. Оценить возможность использования количественного определения ингибитора в сыворотке крови, как биологического маркера опухолевого роста и показателя эффективности проводимой химиотерапии.
-
Изучить влияние различных макрофагальных стимуляторов полисаха-ридной природы (ЛИС, КМГ, SE-гликана), нативных липопротеинов и их комбинации на секрецию цистатина С и стефина А в культуре перитонеальных макрофагов интактных мышей и мышей с НА-1 гепатомой.
-
Изучить влияние нативных липопротеинов на синтез и секрецию апо-протеинов A-I и Е в культуре гепатоцитов и клетках Купфера.
Научная новизна. Показано, что цистатин С и стефин А обнаруживается во многих тканях и сыворотке крови интактных мышей линии СВА, (СВАхС57В1/6) Fi, A/Sn, наибольшее количество ингибитора обнаружено в ткани мозга. В тканях мышей концентрация стефина А больше, чем цистатина С.
Впервые показано, что развитие экспериментальных опухолей с различными гистологическими типами характеризуется низким содержанием цистатина С и стефина А в опухолевой ткани по сравнению с другими органами. Минимальное количество цистатина С выявлено в опухолевой ткани аденокар-циномы LLA, характеризующейся метастазами в легкие. Рост исследуемых опухолей сопровождается снижением концентрации цистатина С в печени, селезенке и сыворотке крови.
Впервые показано, что циклофосфан, подавляя рост основного опухолевого узла и оказывая антиметастатический эффект, увеличивает содержание основных внутриклеточных ингибиторов в ткани опухоли, печени и селезенки и в сыворотке крови у мышей с лимфосаркомой LS и аденокарциномой LLA
Впервые выявлено, что карбоксиметилированный и сульфоэтилированный (1->3)-р-В-гликаны или Украин потенцируют действие циклофосфана, совместное применение одного из стимуляторов макрофагов и противоопухолевого препарата приводит к максимальному увеличению содержания ингибитора в тканях и сыворотке крови.
Впервые показано, что применение нового противоопухолевого препарата Украина у мышей с НА-1 гепатомой увеличивает продолжительность жизни мышей, снижает ежедневный прирост массы опухоли, асцита и массу асцитной жидкости, изменяет клеточный состав асцита, снижая количество опухолевых клеток и увеличивая количество макрофагов. Введение Украина увеличивает содержание цистатина С и стефина А в клетках опухоли и восстанавливает концентрацию ингибиторов в печени и селезенке. Подобный положительный противоопухолевый эффект на примере НА-1 гепатомы продемонстрирован при введении животным карбоксиметилированного (1—>-3)-Р-В-гликана.
Впервые выявлены изменения концентрации цистатина С в сыворотке крови в динамике развития (на 12, 17 и 20 день) аденокарциномы легких Льюис LIA и при введении противоопухолевых препаратов. Установлено что, модификаторы биологического ответа, гликаны, оказывают положительный эффект на содержание цистатина С в сыворотке крови у мышей с LIA в зависимости от массы опухоли: при небольшой массе опухоли (не более 2,7 г) КМГ или SE-гликан позволяют снизить дозу циклофосфана в 2-5 раз без снижения его противоопухолевого и антиметастатического эффекта. Если вес опухоли достигает более 5,7 г, одного введения циклофосфана недостаточно для достижения по-
ложительного эффекта, КМГ, SE-гликан или Украин усиливают действие цик-лофосфана.
Развитие лимфосаркомы RLS, резистентной к противоопухолевой терапии по сравнению с опухолью LS, отличалось злокачественным течением: более быстрым ростом трансплантатов и ранней гибелью животных, в сыворотке крови содержание цистатина С в 1,5 раза ниже, чем при US. Введение цикло-фосфана в дозе 150 мг/кг веса не изменяет содержание ингибитора в сыворотке крови мышей с RLS.
Впервые изучено влияние различных стимуляторов полисахаридной природы и липопротеинов плазмы крови на секрецию и синтез цистатина С и стефина А в культуре перитонеальных макрофагов интактных мышей. Сульфоэти-лированный и карбоксиметилированный (I—>3)-Р-В-гликаны в 4-5 раз увеличивают секрецию ингибиторов в примированных макрофагах. Липопротеины низкой и высокой плотности увеличивают секрецию цистатина С и стефина А, их стимулирующий эффект более выражен по сравнению с изученными полисахаридами. При совместном воздействии липопротеинов и (l-»3)-P-D гликанов наблюдается многократное увеличение секреции ингибиторов. Действие ЛПВП почти в два раза больше, чем ЛПНП, а через два часа более выражено (в 4,6 раза) по сравнению с 30-минутным сроком.
Впервые показано, что перитонеальные макрофаги мышей с экспериментальной НА-1 гепатомой секретируют больше цистатина С, чем интактные клетки. Липопротеины низкой и высокой плотности увеличивают секрецию цистатина С в среду инкубации макрофагов мышей с НА-1 гепатомой. При совместном действии липопротеинов с КМГ или SE-гликаном этот эффект усиливается.
Установлено, что липопротеины высокой плотности совместно с гидрокортизоном усиливают в несколько раз синтез и секрецию цистатина С макрофагами от мышей с гепатомой НА-1, аполипопротеина Е - в культуре клеток Купфера, аполипопротеина A-I — в культуре гепатоцитов.
Впервые показано изменение содержания цистатина С в сыворотке крови у больных с гемобластозами (острый лейкоз, злокачественная неходжскинская лимфома, лимфогранулематоз, миеломная болезнь) и раком тела матки I и II стадии заболевания.
Практическая значимость. Выявленное антигенное сходство между ингибиторами человека и мыши позволило использовать наборы для определения цистатина С и стефина А человека для исследования содержания эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ у экспериментальных животных, в частности мышей линии A/Sn, СВА, (СВАхС57В1/6) F1.
Увеличение концентрации ингибиторов цистеиновых протеиназ в сыворотке крови при введении противоопухолевых препаратов коррелировало со снижением веса основного опухолевого узла экспериментальной опухоли. Это предполагает использовать определение ингибиторов в сыворотке крови в качестве маркера опухолевого роста и для оценки эффективности проводимой химиотерапии не только у животных, но и в сыворотке крови больных со злокачественными новообразованиями.
Водорастворимые карбоксиметилированный и сульфоэтилированный (1->3)-Р-В-гликаны или Украин при совместном введении с циклофосфаном потенцировали его противоопухолевое действие и приводили к максимальному увеличению содержания ингибитора в тканях и сыворотке крови мышей с экспериментальными опухолями, что позволяет снизить дозу основного противоопухолевого препарата. Это открывает новые возможности применения глика-нов или Украина для клинического использования при химиотерапии злокачественных опухолей человека.
Полученные данные по применению иммуностимулятора Украина подтвердили его противоопухолевый эффект, связанный с повышением содержания ингибиторов цистеиновых протеиназ (цистатина С и стефина А) в клетках мышиной НА-1 гепатомы.
Липопротеины и водорастворимые (1->3)-Р-0-гликаны, обладающие иммуностимулирующими свойствами, при совместном введении во много раз увеличивали синтез и секрецию цистатина С и стефина А в макрофагах, что предполагает разработку препарата, усиливающего содержание ингибиторов цистеиновых протеиназ в организме, как нового противоопухолевого средства.
Внедрение результатов исследования. Теоретические и практические аспекты, разрабатываемые в диссертационном исследовании, внедрены в научный и учебный процесс кафедр патологической физиологии и онкологии Новосибирской государственной медицинской академии МЗСР РФ по тематическим разделам «Патология тканевого роста» и «Канцерогенез».
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Развитие мышиных экспериментальных опухолей с различными гистологическими типами характеризуется очень низкой концентрацией эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ в опухолевой ткани, а опухоленоситель-ство сопровождается снижением содержания ингибиторов в печени, селезенке и сыворотке крови.
-
Водорастворимые (1—»3)-|3-0-гликаны (КМГ, SE-гликан) или Украин повышают эффективность противоопухолевого действия циклофосфана, позволяют снизить дозу цитостатика и значительно увеличивают содержание ингибиторов в тканях опухоли, печени, селезенки и сыворотке крови.
-
Содержание цистатина С в сыворотке крови является прогностическим критерием опухолевого роста и проводимой противоопухолевой терапии.
-
Мышиные перитонеальные макрофаги секретируют внеклеточно ингибиторы цистеиновых протеиназ (нистатин С и стефин А). Макрофагальные стимуляторы полисахаридной природы (КМГ, SE-гликан) и/или нативные ли-попротеины увеличивают секрецию ингибиторов in vitro.
-
Процесс усиления синтеза и секреции белков под влиянием липопротеи-нов универсален и имеет место в различных клетках в норме и при развитии опухоли. Липопротеины усиливают секрецию цистатина С в макрофагах ин-тактных мышей и мышей с экспериментальной гепатомой НА-1, аполипопро-теина Е - в клетках Купфера и повышают содержание аполипопротеина A-I в культуре гепатоцитов.
Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены на Всесоюзной конференции «Здоровье человека в Сибири» (Новосибирск, 1989), X Всесоюзном симпозиуме «Структура и функция клеточного ядра» (Гродно, 1990), Ш съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997), XII рабочем совещании Европейской группы по исследованию лизосомальных нарушений (Vidago, Португалия, 1999), I Международной конференции и V ежегодном собрании международного общества по химиопрофи-лактике опухоли «Профилактика и генетика опухоли» (St Gallen, Швейцария, 2000), V Всемирном конгрессе: «Травма, шок, воспаление и сепсис» (Munich, Германия, 2000), Рабочем совещании с международным участием «Лизосомные болезни, модели, терапия» (Новосибирск, 2000), Научной сессии к 65-летию НГМА (Новосибирск, 2000), ХШ рабочем совещании ESGED (Woudschoten, Нидерланды, 2001), П Международном конгрессе по иммунологии (Stockholm, Швеция, 2001), II Международной конференции по биологии экспериментальных опухолей (Bovec, Словения, 2002), X Братиславском симпозиуме по сахаридам (Smolenice, Словакия, 2002), Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: функциональные и клинические аспекты» (Новосибирск, 2002), второй научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения профессора М. Г. Колпакова «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002), IV съезде физиологов (Новосибирск, 2002), П Международной конференции «Профилактика и генетика опухоли» (St. Gallen, Швейцария, 2002), Ш Международной конференции «Противоречия в профилактике и генетике опухоли» (St. Gallen, Швейцария, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 53 работы, из них 30 статей - в рецензируемых отечественных (18) и - иностранных журналах (12) Получено авторское свидетельство на изобретение: А/с №1737340 «Способ определения апопротеина A-I в сыворотке крови» от 1 февраля 1992 г.
Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 241 странице машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, список используемой литературы. Диссертация иллюстрирована 31 таблицей и 29 рисунками. Список цитируемой литературы включает 384 источника, в том числе 72 отечественных и 312 зарубежных авторов.
