Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1. Иммунопатогенез СД 1-го типа 12
1.1.1. Аутоантитела к инсулину 17
1.1.2. Аутоантитела к цитоплазматическим антигенам островковых клеток 17
1.1.3. Аутоантитела к поверхностным антигенам островковых клеток 18
1.2. Современные иммуномодуляторы: принципы их применения в эндокринологии 20
1.2.1. Фармакологические свойства прополиса 23
1.2.2. Фармакологические свойства маточного молочка 30
ГЛАВА II. Материал и методы исследования 37
2.1. Характеристика больных СД 1-го типа 37
2.2. Методы исследования 42
2.2.1. Исследование показателей клеточного звена иммунитета 42
2.2.2. Определение циркулирующих аутоантител к декарбоксилазе глутаминовой кислоты в сыворотке крови 43
2.2.3. Определение антител к бычьему, свиному и рекомбинантному человеческому инсулину в сыворотке или плазме 46
2.2.4. Определение циркулирующих IgG-аутоантител к клеткам островков Лангерганса в сыворотке крови 47
2.2.5. Определение иммуноглобулинов A, G, М человека в сыворотке крови 50
2.2.6. Определение С-пептида 50
2.2.7. Определение гликированного гемоглобина 50
2.2.8. Статистическая обработка результатов исследования 51
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований и их обсуждение 52
3.1. Особенности клинической картины и иммунного статуса у больных СД 1-го типа 52
3.1.1 Клиническая характеристика обследованных больных в зависимости от длительности и тяжести течения заболевания 52
3.1.2. Изучение состояния клеточного иммунитета у больных СД 1-го типа 58
3.1.3. Изучение состояния гуморального иммунитета у больных СД 1-го типа 62
3.1.4. Изучение продукции аутоантител у больных СД 1-го типа 64
3.2. Влияние апитерапии на иммунную систему больных СД 1-го типа 68
3.2.1. Иммунокорригирующая терапия больных СД 1-го типа прополисом 69
3.2.1.1. Влияние прополиса на клеточный иммунитет 70
3.2.1.2. Влияние прополиса на гуморальный иммунитет 74
3.2.1.3. Влияние прополиса на углеводный обмен 80
3.2.2. Иммунокорригирующая терапия апилаком больных СД 1-го типа 85
3.2.2.1. Влияние апилака на клеточный иммунитет 85
3.2.2.2. Влияние апилака на гуморальный иммунитет 89
3.2.2.3. Влияние апилака на углеводный обмен 93
3.2.3. Иммунокорригирующая терапия прополисом и апилаком больных СД1-го типа 97
3.2.3.1. Влияние прополиса и апилака на клеточный иммунитет 98
3.2.3.2. Влияние комбинированной терапии на гуморальный иммунитет 102
3.2.3.3. Влияние прополиса и апилака на углеводный обмен 106
Заключение 113
Выводы 122
Практические рекомендации 124
Список литературы 125
- Современные иммуномодуляторы: принципы их применения в эндокринологии
- Определение циркулирующих аутоантител к декарбоксилазе глутаминовой кислоты в сыворотке крови
- Определение циркулирующих IgG-аутоантител к клеткам островков Лангерганса в сыворотке крови
- Клиническая характеристика обследованных больных в зависимости от длительности и тяжести течения заболевания
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сахарный диабет (СД) является одной из наиболее острых проблем внутренней медицины в связи с всё увеличивающимся числом больных требующих пожизненного лечения. Большая социальная значимость СД состоит в том, что он приводит к ранней инвалидизации и летальности в связи с поздними сосудистыми осложнениями, в числе которых - микроангиопатии (ретинопатия и нефропатия), макроангиопатии (инфаркт миокарда, инсульт, гангрена нижних конечностей), нейропатии [1, 2, 9]. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире насчитывается более 150 млн. больных СД. Распространенность диабета в России составляет 3%. По данным обращаемости в 1997 г. насчитывалось более 2 млн. больных СД, из которых 252 410 приходилось на больных, страдающих сахарным диабетом первого типа (СД1) [3,18, 20].
Изучение патогенеза и клиники СД1 представляет одну из важных задач эндокринологии. В последние годы доказано, что ключевую роль в развитии СД1 играют аутоиммунные процессы, ведущие к деструкции р-клеток и развитию абсолютного дефицита инсулина. Одним из наиболее ярких подтверждений участия иммунной системы в развитии СД1 является высокая-ассоциация этого- заболевания с определенными генами системы* МНС (Major histocompatibility complex - главный комплекс тканевой совместимости), представленного у человека системой HLA (Human Leukocyte Antigens - антигены лейкоцитов человека) [7, 46]. Вбиоптатах поджелудочной железы у больных СД1 обнаруживаются признаки инсулита в виде Т-клеточной инфильтрации' и гиперэкспрессия молекул I класса системы HLA на островковых клетках. Данные признаки коррелировали с наличием у пациентов в сыворотке крови диабетических аутоантител к декарбоксилазе глутаминовой кислоты (GADA -glutamic acid decarboxylase antibodies), к инсулину (IAA - insulin autoantibodies), к клеткам островков Лангерганса (ICA - islet cell autoantibodies) [49, 50].
Достижения в области иммунологии и применение современных иммунологических методов позволяют исследовать роль иммунной- системы в развитии СД.
Возросший интерес к натуральным биологически активным продуктам пчеловодства (БАЛЛ) является не случайным, а продиктован их уникальными свойствами, подтвержденными в эксперименте и клинике и получившими особое значение в век экологической напряженности и высокой заболеваемости СД. Применение БАШ 1 с лечебными и профилактическими целями — апитерапия - выдержало испытание временем и круг их практического использования постоянно расширяется. В последние годы в России и за рубежом- открыты уникальные свойства БАЛЛ. Они исследуются в самых различных направлениях медико-биологических наук, в том числе в иммунологии и диабетологии [7, 34, 37, 39, 54].
Во всём мире ведется поиск новых средств, обладающих и сахаросни-жающим, и иммуностимулирующим эффектами [52]. Несмотря на существование достаточного количества лекарственных средств для лечения и профилактики осложнений СД, наряду с базисной терапией в последние годы начали использовать фармакологические препараты на основе БАЛЛ, которые обладают иммуностимулирующими, антивирусными, противовоспалительными, антиоксидантными свойствами. Известно, что прополис повышает резистентность организма к инфекциям и обладает гипогликемическим эффектом [8, 37]. Иммуностимулирующее и адаптогенное действие маточного молочка изучено при лечении хирургических больных, хронических рецидивирующих инфекций [37].
Малочисленные научные данные свидетельствуют о том, что изучение показателей иммунитета и особенностей иммунотропного действия БАЛЛ у больных СД1 является перспективным и представляет интерес для клинического применения прополиса и маточного молочка при разных стадиях и сроках СД1 у лиц с высоким риском развития иммунодефицита [33].
Цель исследования. Изучить клиническую картину и особенности иммунного статуса у больных СД1, и оценить роль иммуномодуляторов прополиса и маточного молочка в комплексной терапии СД1.
Задачи исследования
Изучить клиническую картину и состояние углеводного обмена у больных СД1 в зависимости от длительности и тяжести течения заболевания.
Оценить показатели клеточного звена иммунитета: относительное и абсолютное число Т-лимфоцитов, субпопуляции иммунорегуляторных Т-лимфоцитов и их соотношение у больных СД1 в зависимости от степени тяжести и длительности заболевания.
Изучить уровень иммуноглобулинов А, М, G и наличие аутоантител к GAD, IAA, ICA у больных СД1 с различной длительностью течения и степенью тяжести заболевания.
Исследовать влияние прополиса, маточного молочка и их комбинации на состояние клеточного иммунитета (CD3+, CD4+, CD8+, CD20+) у больных
сді.
Определить особенности влияния прополиса, маточного молочка и их комбинации на продукцию GAD A, ICA, IAA, IgA, IgM, IgG.
Изучить влияние прополиса, маточного молочка и их комбинации на клиническое течение и состояние углеводного обмена у больных СД1 с учетом длительности и степени тяжести заболевания.
Научная новизна работы В работе впервые получены данные о влиянии прополиса и маточного молочка на показатели клеточного и гуморального иммунитета, уровень гликемии, концентрацию С-пептида у больных с СД1. Апитерапия прополисом и маточным молочком при монотерапии и их комбинации у больных СД1 сопровождается увеличением уровня CD3+, CD4+ и CD20+ клеток. Терапия с использованием прополиса сопровождается снижением уровня аутоантител к IAA, ICA GAD, наиболее выраженной у больных со средней тяжестью течения
и продолжительностью гипергликемии не более 5 лет, что объясняется инги-бицией активности аутореактивных клонов В-лимфоцитов.
Лечение больных СД1 апилаком сопряжено с повышением уровня сывороточного IgG в основном у больных со средней тяжестью течения и продолжительностью гипергликемии не более 5 лет. Иммуномодулирующая активность комбинации прополиса и апилака у больных СД1 способствует снижению уровня аутоантител у пациентов с СД1 длительного течения и в фазе декомпенсации.
Впервые дано научное обоснование применения прополиса и маточного молочка у больных СД1.
Показана диагностическая значимость наличия ICA и GADA в сыворотке крови для определения типа диабета. Снижение уровня IgG на фоне повышения концентрации IgA и IgM характеризует тяжелое течение СД1. Наблюдается достоверная прямая корреляция числа CD20+ клеток с уровнем IgA, IgM и аутоантителами к инсулину и обратная корреляция с уровнем сывороточного IgG и аутоантителами к ICA и GAD.
Практическая значимость
Показаны изменения в системе гуморального и клеточного иммунитета. По мере нарастания длительности СД1 изменения иммунитета становятся более выраженными, а именно, происходит снижение числа CD3+, CD4+ и CD20+-клеток. На основании этих данных целесообразно применение иммунотроп-ных препаратов - биологически активных продуктов пчеловодства: прополиса и апилака. Выявлено, что наличие аутоантител к островковым клеткам поджелудочной железы является прогностическимкритерием в развитии СД1.
Показана иммуномодулирующая эффективность апипрепаратов: лечение прополисом и апилаком больных СД1 сопровождалось увеличением уровня CD3+, CD4+ и CD20+ клеток, снижением уровня аутоантител к IAA, ICA GAD, наиболее выраженной у больных со средней тяжестью течения и продолжительностью гипергликемии не более 5 лет.
Доказано гипогликемическое действие апипрепаратов при комплексном лечении инсулином больных СД1.
Личное участие автора в получении результатов исследования
Автор обследовала и проводила терапию пациентов, включенных в диссертационную работу. Автор освоила методы оценки иммунного статуса, определения уровня аутоантител и лично проводила исследования крови. Автор контролировала ход лечения апипрепаратами больных СД1. Полученный материал обработан автором с применением методов вариационной статистики и представлен в виде таблиц и графиков. Выводы и практические рекомендации сформулированы также лично автором.
Основные положения, выносимые на защиту
Клинико-иммунологические особенности СД1 претерпевают значительные изменения у больных с длительностью заболевания более пяти'лет и тяжелым течением с более частым развитием ретино-, нейро-, нефропатии на фоне гипергликемии и снижения С-пептида в крови.
Изменения показателей клеточного иммунитета у больных СД1 сопровождаются снижением CD3+, CD4+ клеток, а также инверсией соотношения CD4/CD8, особенно у лиц с длительностью заболевания более десяти лет и тяжелым течением СД1. Выявлена достоверная обратная корреляция между уровнем CD3+, CD4+, CD20+ клеток и продолжительностью заболевания СД1.
Гуморальный иммунитет у пациентов с СД1 характеризуется' снижением уровня сывороточного IgG, что больше выражено у пациентов'с тяжелым течением заболевания. Выявлена достоверно прямая корреляция числа CD20* клеток с уровнем IgA, IgM и IAA и обратная корреляционная связь с уровнем сывороточного IgG и аутоантителами к ICA и GAD.
Иммуномодулирующая активность прополиса у больных СД1 характеризуется увеличением числа CD3+, CD4+ и CD20+ лимфоцитов на фоне снижения количества CD8+ клеток, повышением уровня сывороточных IgA, IgG и
снижением IgM, а также уровней аутоантител: IAA и GADA, в основном у больных со средней тяжестью течения и продолжительностью гипергликемии не более пяти лет.
Терапия апилаком больных СД1 сопровождается увеличением числа CD3+, CD4+ и CD20+ лимфоцитов на фоне снижения количества CD8+ клеток преимущественно у пациентов с тяжелым течением; повышением уровня сывороточного IgG в основном у больных со средней тяжестью течения и продолжительностью гипергликемии не более пяти лет.
Иммуномодулирующая активность комбинированной терапии прополисом и апилаком характеризуется увеличением числа CD3+, CD4* и GD20+ лимфоцитов на фоне снижения количества CD8+ клеток, особенно у больных со средней тяжестью течения. СД1, а также незначительным снижением уровня аутоантител к GAD.
Клинико-иммунологические эффекты прополиса и апилака позволяют констатировать наличие у них иммунотропных свойств и рекомендовать эти препараты в комплекснойтерапии больных СДГ. '.
Внедрение результатов исследования в клиническую практикуй учебный
процесс
Результаты исследования включены в программу преподавания клинической фармакологии студентам 5 курса лечебного^ педиатрического^ стоматологического, медико-профилактического и фармацевтического факультетов ГОУ ВПО «ДГМА ФАЗ СР» по теме: «Клиническая фармакология: иммунотропных средств».
Способ лечения*СД1: с применением апипрепаратов,внедрен в:клиническую практику эндокринологического отделения РКБ, о чем имеются акты внедрения. Подана заявка на изобретение «Способ лечения сахарного-диабета первого типа», регистрационный № 2007135456, от 24 сентября 2007 года.
Апробация работы
Результаты работы доложены на: международной научно - практической конференции по апитерапии (Рязань, 2002), II Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергологии (Москва, 2004), конференции, посвященной 15-летию ЦНИЛ ДГМА (Махачкала, 2006), международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры фармакологии Даггосмедака-демии (Махачкала, 2006).
Апробация диссертации состоялась 26 июня 2007 года на межкафедральной научной конференции ГОУ ВПО «ДГМА ФАЗ СР».
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 17 научных работ, из них 1 - в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК МОН РФ (Аллергология и иммунология. - М., 2004. - Т. 5. - № 1. - С. 100).
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 137 страницах, состоит из введения и 3 глав (обзор литературы, материал и методы, результаты собственных исследований), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 121 работу, из них иностранных - 46. Работа иллюстрирована 65 таблицами и 20 рисунками.
Автор выражает глубокую благодарность доценту кафедры клинической фармакологии и фармации Даггосмедакадемии, к.м.н. Атаеву Магомед - Расу-лу Гаджиевичу, старшему научному сотруднику ЦНИЛ, к.м.н. Курбанову Казбеку Зайналабидовичу за оказанную помощь при проведении данной работы.
Современные иммуномодуляторы: принципы их применения в эндокринологии
Иммунная система человека выполняет важную функцию по сохранению постоянства внутренней среды организма, осуществляемую путем распознавания и элиминации из организма чужеродных веществ антигенной природы, как эндогенно возникающих, так и экзогенно протекающих. Эта функция иммунной системы осуществляется с помощью факторов врожденного и приобретенного иммунитета. При нарушении количества и функциональной активности клеток иммунной системы развиваются заболевания иммунитета: иммунодефицита, аллергические, аутоиммунные и лимфопролиферативные процессы. Лечение этих заболеваний осуществляется, с помощью комплекса методов иммунотерапии, одним из которых является применение иммуно-тропных лекарственных препаратов. Иммунотропные лекарственные препараты — это препараты, у которых лечебный эффект связан с их преимущественным (или селективным) действием на иммунную систему человека. Различают три основные группы иммунотропных лекарственных препаратов: иммуномодуляторы, иммуностимуляторы и иммунодепрессанты [43].
Иммуномодуляторы — это лекарственные препараты, восстанавливающие в терапевтических дозах функции иммунной системы (эффективную иммунную защиту). Следовательно, иммунологический эффект иммуномодуляторов зависит от исходного состояния иммунитета больного: эти лекарственные средства снижают повышенные и повышают сниженные показатели иммунитета. В соответствии с названием иммуностимуляторы — это такие лекарственные препараты, которые преимущественно усиливают иммунитет, доводя сниженные показатели до их нормальных значений [32]. В настоящее время выделяют несколько групп лекарственных препаратов с иммуномодулирующими свойствами [10, 74, 89]: 1. Микробные средства: рибомунил, бронхомунал, имудон, ИРС-19, ликопид; 2. Тимические средства: тактивин, тималин, тимоген, имунофан; 3. Костно-мозговые препараты: миелопид, серамил; 4. Цитокины: лейкинферон, суперлимф, ронколейкин, беталейкин, лейкомакс, нейпоген; 5. Нуклеиновые кислоты: натрия нуклеинат, деринат, полудан; 6. Апипрепараты: прополис, маточное молочко (апилак); 7. Растительные препараты: иммунал, диуцифон; 8. Химически чистые вещества: галавит, гепон, глутоксим, аллоферон, поли-оксидоний. В последние годы все шире применяются иммуномодулирующие препараты в эндокринологии. Эксперименты на крысах BB/W и мышах NOD показали, что иммунотерапия, начатая до развития клиники диабета, может предотвратить его начало. Оправданность данной терапии подтверждается тем фактом, что клиническое начало сахарного диабета соответствует уже значительному разрушению Р-клеток. [98]. Однако, момент возникновения заболевания до сих пор неизвестен, в связи с этим P. Pozzili [112, 113] рекомендует: 1) установить начало аутоиммунного процесса для того, чтобы начать патогенетическую терапию; 2) принять меры для предотвращения разрушения р-клеток. Современные аспекты изучения патогенеза СД1 предполагают, что начало заболевания близко ко времени появления иммунологических маркеров. В свете этих исследований, латентный период перед появлением гипергликемии можно считать наиболее благоприятным для начала иммунотерапии. Иммунотерапия на сегодня включает два различных подхода - иммуно-модуляцию и иммуносупрессию. Было несколько попыток использовать им-муномодуляторы, включая у-глобулин [89], интерферон [119], левамизол [32] у больных с впервые выявленным СД1. Ни одна из этих попыток не дала опту тимого эффекта в удлинении фазы ремиссии заболевания. Однако большинство этих исследований было проведено на ограниченном контингенте больных, в отсутствии контрольной группы. Интерес к применению иммуномодулято-ров вновь возрос в связи с новым препаратом - циамексоном. У 7 из 11 пациентов, получавших этот препарат, ремиссия заболевания длилась около года [17]. Возрастающий интерес проявляется также к препаратам, удаляющим свободные кислородные радикалы, которые принимают участие в деструкции (3-клеток. Так, известно, что стрептозотоцин вызывает диабет именно путем выработки свободных радикалов, разрушающих (3-клетки поджелудочной железы. Никотинамид, способный удалять свободные радикалы, уменьшает клеточную цитотоксичность, опосредованную лимфоцитами, а в эксперименте способствовал регенерации (3-клеток [13]. Никотинамид применялся у больных с впервые выявленным сахарным диабетом, в дозе 3 г ежедневно, при этом у 3-х из 7 пациентов была достигнута полная ремиссия заболевания.
В отечественной литературе описано применение Т-активина [47, 76] у больных СД1, осложненным интеркурентными воспалительными заболеваниями. Отмечен положительный эффект при применении этого препарата -восстановление у больных СД1 определенных звеньев нарушенного иммунитета: количества и функциональной активности Т-лимфоцитов, активность и интенсивность фагоцитоза, содержания иммуноглобулинов.
В настоящее время уделяется большое внимание применению» препаратов на основе продуктов пчеловодства. Среди апипрепаратов, обладающих иммуномодулирующим эффектом, наиболее изученными являются прополис и маточное молочко. У прополиса выявлено много биологических эффектов, из которых представляет особый интерес его иммуномодулирующее действие. Опубликованы единичные тезисы о применении прополиса и маточного молочка при комплексном лечении СД1. В этих работах отмечены гипогликеми-ческие и иммунокорригирующий эффекты прополиса и маточного молочка [8, 11]. Первые попытки применения иммуносупрессоров были предприняты в конце 70-х годов. Описано применение азотиоприна, преднизолона; а также комбинации этих препаратов [17]. Многочисленные попытки лечения иммуно-супрессорами больных с впервые выявленным СД1, к сожалению не увенчались успехом минимум по двум причинам. Прежде всего, применяемые имму-носупрессивные средства неспецифичны, то есть подавляют иммунитет вообще. Кроме того, применяемые иммуносупрессоры обладали еще и другим спектром побочных действий. В настоящее время большой интерес представляют те фармацевтические средства, которые могли бы повысить регенераторную способность р-клеток и если не восстановить, то хотя бы сохранить оставшиеся клетки. Такое направление лечения на ранних стадиях манифестного сахарного диабета, или лучше - латентно протекающего инсулита, без сомнения, можно считать одним из самых перспективных.
Определение циркулирующих аутоантител к декарбоксилазе глутаминовой кислоты в сыворотке крови
Тест основан на принципе твердофазного непрямого иммуноферментно-го анализа. Высокоочищенные GADA адсорбируются на стенках лунок микропланшета. При нанесении исследуемых сывороток в лунки, присутствую щие в них IgG-антитела к GAD связываются с иммобилизованными антигенами. Несвязавшиеся антитела удаляются в результате промывки. После этого в. лунки вносятся козьи антитела к IgG человека, меченые ферментом (конъю-гат), которые связываются с комплексом "антиген-антитело", иммобилизованным на поверхности лунок. Несвязавшийся конъюгат удаляется в результате второй промывки. Добавление субстрата приводит к появлению окраски, интенсивность которой измеряется спектрофотометрически. Оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации GAD в образце. Результаты рассчитываются на основании сравнения оптической плотности образца со значениями оптической плотности калибраторов по калибровочному графику.
Брали 5 мл венозной крови в сухую стеклянную пробирку. Отделяли сыворотку центрифугированием после формирования сгустка. Образцы сыворотки замораживали (-20С). Перед проведением исследования и приготовлением реагентов прогревали реагенты и сыворотки до комнатной температуры. Методика исследования. 1. Подсчитали количество стрипов, необходимое для настоящего исследования. Вставили нужное количество стрипов в рамку. Лунки А1 и В1 зарезервировали для Бланка. Сделали необходимые пометки по размещению образцов в планшете. 2. Добавили 100 мкл калибраторов, положительного контроля, отрицательного контроля и разведенных образцов в лунки стрипов. Оставили лунки А1 и В1 пустыми в этом шаге анализа для бланка, они будут использованы позднее. 3. Закрыли планшет специальной пленкой для планшетов (для предотвращения контаминации) и инкубировали 1 час при комнатной температуре (25±1С). 4. После окончания инкубации вытряхнули жидкость из лунок, промокнули планшет фильтровальной бумагой и промыли планшет 3 раза по 300 мкл промывочным буфером, используя автоматическую многоканальную пипетку. Высушили планшет на фильтровальной бумаге после третьей промывки. 5. Добавили по 100 мкл рабочего раствора конъюгата во все лунки за исключением бланка (лунки А1 и В1). 6. Закрыли планшет пленкой для планшетов и инкубировали 1 час при комнатной температуре в темноте (25±1С). 7. После окончания инкубации промыли планшет, как описано в шаге 4 данного раздела и высушили планшет на фильтровальной бумаге. 8. Внесли по 100 мкл субстратного раствора во все лунки, включая бланки. 9. Закрыли планшет парафилмом или пленкой для планшетов и инкубировали 30 минут в темноте при комнатной температуре (25±1С). 10. Через 30 минут добавляли по 50 мкл раствора для остановки реакции во все лунки планшета. 11. Профотометрировали планшет на планшетном фотометре при длине волны 405 нм против бланка (лунки А1 и В1). 12. Рассчитали результаты Расчет результатов. Результаты рассчитывали- по калибровочной кривой. По оси X откладывали значения концентрации калибраторов, по оси Y значения абсорбции. Провели линию между 3-мя точками. Рассчитали среднее значение оптической плотности для дублей образцов и контролей. Рассчитали по полученному графику концентрацию. Положительный результат ( 1,05) означает присутствие антител в образце, отрицательный ( 1,0) означает отсутствие антител в образце. Если результат оказался неопределённым (1,0-1,05), образец должен исследоваться повторно. Если и повторный результат окажется в пограничной зоне, другой сывороточный образец необходимо проанализировать попозже и интерпретировать в соответствии с клиническим статусом пациента. Правильность: 85,8% Специфичность: 87,1% Чувствительность: 85,0%. Оптическую плотность определяли при длине волны 450 нм. 2.2:3. Определение антител к-бычьему, свиному и рекомбинантному/ человеческомуинсулину в сыворотке или плазме Образец в объеме 10 мкл был разбавлен 1:100 буфером для образцов. Общее время инкубации составило 60 минут при комнатной температуре (18-28 С). Диапазон калибровки: 6,3-100 Ед/мл. Чувствительность 0,5 Ед/мл. Формат набора: 96 тестов. Настоящий набор использует принцип непрямого твердофазного ИФА -ELISA. Он разработан для количественного измерения антител класса IgG к инсулину в образцах человеческой сыворотки или плазмы. Микроячейки покрыты смесью высокоочищенных бычьего, свиного и рекомбихантного человеческого инсулинов. Анализ используется для первичной диагностики диабета 1 типа, а также для детекции IAA у пациентов с инсулиновой терапией. В ходе анализа проходят связывание аналита, образование сэндвичего комплекса и ферментная цветная реакция в следующих фазах реакции: Фаза 1: Стандарты, контроли и предварительно разбавленные пробы сыворотки пациентов вносили в микроячейки. Присутствующие антитела связываются с иммобилизованными в микроячейках антигенами. После 30-минутной инкубации ячейки промыли, при этом промывочный раствор удаляет несвязавшиеся компоненты сыворотки.
Определение циркулирующих IgG-аутоантител к клеткам островков Лангерганса в сыворотке крови
Представляет интерес изучение содержания HbAi поскольку его уровень позволяет оценить степень компенсации СД1 на протяжении предшествовавших 110-120 дней [18]. В среднем у больных СД1 выявлено повышенное содержание глюкозы в крови (13,6±0,5 ммоль/л, в контрольной группе14,4±0,1 ммоль/л) и моче (5,6±0,9 г/%, в норме не определяется), а также HbAj в крови (11,6±0,4 %, у здоровых 5,3±0,4 %), снижение С-пептида в крови (0,34±0,02 нмоль/л, в норме 0,52±0,02 нмоль/л) по сравнению со здоровыми добровольцами в группе контроля (табл. 3.1.4). При сравнении данных углеводного обмена у больных СД1 с длительностью более 5 лет нами выявлена достоверно значимое снижение С-пептида (на 59%) от нормы) по отношению к таковому параметру у больных СД1 со стажем болезни до 5 лет (на 18% от нормы). Уровни глюкозы и НЬАі в крови в этих группах больных не отличались друг от друга, хотя их содержание превышало норму в 3 и 2 раза соответственно.
Как видно из таблицы 3.1.5, у больных СД1 с тяжелым течением отмеча ется достоверное повышение уровня глюкозы в моче и крови. Так, уровень? глюкозы в; крови у больных превышал норму в 3 раза; а НЬАі - в 2 раза. Вто же время концентрация С-пептида в крови у больных с тяжелым течением СД1 по сравнению с контролем была в 1,5 раза ниже. При этом отмечаются несколько более выраженные отклонения значений углеводного обмена от нормы у больных с тяжелым течением СД1.
Таким образом, в углеводном обмене отклонения от нормальных значений носят более выраженный характер у больных СД1 с впервые выявленным заболеванием и при стаже болезни более 10 лет, а также у пациентов с тяжелым течением.
Состояние клеточного иммунитета у больных СД1 было изучено по следующим параметрам: процентные и количественные показатели Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+); В-клеток (CD20+); ИРИ (CD4/CD8). Учитывая данные литературы о наличии множественных дефектов в иммунной системе у больных СД1, а, также принимая во внимание тот факт, что иммунологические тесты, взятые в отдельности, имеют ограниченное клиническое зна чение, мы все иммунологические исследования у больных СД1 проводили параллельно с клиническим, инструментальным и лабораторным обследованием: Результаты проведенных исследований свидетельствуют о наличии существенных изменений в иммунном статусе больных в зависимости от длительности заболевания.
Обращает на себя внимание различия показателей і клеточного иммунитета у больных ЄД1 в зависимости от длительности заболевания; В частности, как видно из таблицы 3.1.6, достоверные различия определяются у больных СД1 с длительностью заболевания от 1 до 5 лет по CD20+ клеткам в сторону снижения абсолютных значений по сравнению с контрольной группой (р 0 05). У больных с впервые выявленным СД1 выявлено достоверное снижение абсолютного числа СОЗ+лимфоцитов в периферической крови; (Г,18±0,09-109/л, р 0;05), а также достоверное снижение относительного и абсолютного числа CD8+ клеток (17±0,45% и 0,30±0,02Т09/л соответственно). Эти данные совпадают с мнением некоторых исследователей о том, что снижение содержания CD8+ клеток способствует поддержанию течения аутоиммунного процесса [13, 21, 72]. Также отмечается достоверное повышение ИРИ (2,54±0,07, р 0,05) у больных с впервые выявленным СД1 за счет значительного снижения числа CD8+ клеток. Достоверные различия; определяются также у больных СД1 с длительно-стью.заболевания 6-10 лет по CD3+, CD4+, CD20+ клеткам (в сторону снижения абсолютных значений; р 0,05). У больных СД1 со стажем заболевания более 10 лет достоверно снижены все параметры клеточного иммунитета, по сравнению с таковыми у больных с меньшим стажем заболевания, а также относительно значений параметров у лиц контрольной группы, за исключением CD8+ клеток, количество которых имело тенденцию к увеличению.
С нарастанием длительности заболевания происходит снижение ИРИ до 1,0±0,04 (р 0,05) у болеющих более 10 лет. Таким образом, с нарастанием продолжительности СД1 происходит значительное угнетение клеточного иммунитета.
Анализ клеточного состава иммунной системы показал, что у больных СД1 с длительностью заболевания до 5 лет отмечается значительное снижение числа CD20+ клеток на 24% относительно группы здоровых лиц. С "увеличением периода длительности СД1 более 5 лет наблюдается заметное снижение CD3+ (на 17%), CD4+ (на 22%), CD20+ (на 38%) клеток и ИРИ (на 24%) по сравнению с нормой.
Представляет интерес выяснение взаимосвязи между параметрами- клеточного иммунитета, поскольку известно, что длительность заболевания непосредственно отражается на количестве и функциональном состоянии иммунокомпетентных клеток.
Выявлена обратная корреляция между количеством клеток иммунной системы и продолжительностью СД1. При этом коэффициент ранговой корреляции Спирмена для CD3+, CD4+, CD20+ оказался достоверным (р 0;02) (табл. 3.1.7).
Достоверный коэффициент корреляции согласуется с данными.литературы об обратных взаимоотношениях между количеством иммунокомпетентных клеток и длительностью заболевания [30].
Клиническая характеристика обследованных больных в зависимости от длительности и тяжести течения заболевания
Исследования последних лет, безусловно, доказывают участие иммунной системы в развитии многих заболеваний, в том числе - СД1. В литературе достаточно подробно представлены исследования, показывающие, что началу диабета предшествует длительный продромальный период, который может длиться в течение нескольких лет. Нарушение синтеза и секреции инсулина в этот период может быть выявлено только с помощью теста определения толерантности к глюкозе [18]. В большинстве случаев у этих лиц с асимптоматическим течением СД1 выявляются 1С А и/или IAA. Описаны случаи выявления ICA за 8 и более лет до появления клинических признаков СД1 [49], то есть определение уровня ICA может служить для ранней диагностики и выявления предрасположенности к СД1. У пациентов с наличием ICA наблюдается прогрессивное снижение функции (3-клеток, что проявляется в нарушении ранней фазы секреции инсулина. При полном нарушении этой фазы секреции появляются клинические признаки СД1. Исследования показали, что ICA определяются у 70% больных с впервые выявленным СД1 [19,29,30,65, 114].
Установлено, что одним из проявлений продромального периода может быть инсулит (лимфатическая инфильтрация панкреатических островков). Ин-сулит сопровождается появлением в крови ICA. Выявление ICA может свидетельствовать о доклинической или начальной стадиях СД1 [24].
Ряд исследователей [22, 72, 75] придает большое значение изменениям в клеточном звене иммунитета, считая, что с одной стороны, патологические изменения играют роль в патогенезе СД и развитии его осложнений, а с другой стороны, нарушение обмена веществ в иммунокомпетентных клетках вследствие недостаточности инсулина ведет к изменению иммунной системы организма. Для характеристики клеточного иммунитета используется подсчет Т- и В-лимфоцитов, а также регуляторных субпопуляций и их соотношение.
Характер течения аутоиммунного СД1 складывается, прежде всего, из наличия и уровня диабетических антител, уровня С-пептида, а также клиниче ских характеристик дебюта заболевания. Так, острое начало с выраженным ке-тоацидозом и гипергликемией предполагает наличие деструктивного инсулита и в перспективе исчезновение С-пептида. С другой стороны, выраженность аутоиммунной реакции предполагает неблагоприятный патофизиологический исход. Важность сохранения остаточной секреторной функции (3-клеток, как представляется по современным данным, обусловлена рядом позитивных биологических эффектов, опосредованных секрецией сохранившейся частью р клеток таких гормональных агентов, как С-пептид и амилин. Данные пептиды в настоящее время привлекают внимание как полноправные участники регуляции углеводного обмена и соответственно патофизиологии диабета и его осложнений [49, 97].
Отсутствие комплексного исследования гуморального и клеточного звеньев иммунитета, противоречивые данные, обнаруженный дисбаланс им-мунорегуляторных клеток при СД1 обусловили необходимость более тщательной и комплексной оценки показателей гуморального и клеточного иммунитета в зависимости от длительности и тяжести заболевания и поиск способов иммунокоррекции.
Учитывая все вышесказанное, целью нашей работы явилось комплексное изучение ряда показателей гуморального и клеточного иммунитета в зависимости от степени тяжести и длительности течения СД1 и возможности применения иммуномодуляторов прополиса и апилака.
При исследовании 120 больных СД1 нами выявлено значительное угнетение Т-клеточного звена иммунитета при длительном течении болезни. У впервые заболевших СД1 выявлено некоторое уменьшение содержания CD3+iaieTOK в периферической крови, но с нарастанием продолжительности заболевания отмечается достоверное снижение абсолютного содержания Т-лимфоцитов до 0,93±0,11 109/л. Выявлена обратная корреляция между процентом CD3+ и длительностью заболевания у больных (Rxy=-0,568; р 0,05). По данным других авторов [90, 116, 118], общее содержание СБЗ+клеток в периферической крови пациентов, недавно заболевших СД1, существенно не изменено, хотя есть работы [23, 111], в которых сообщается о статистически достоверном снижении относительного и абсолютного содержания CD3+ioieTOK в периферической крови у детей в возрасте 8-14 лет с впервые выявленным СД1. Отсутствие значительных изменений или некоторое уменьшение содержания СБЗ+клеток в периферической крови было также описано при обследовании недавно заболевших СД1 юношей и взрослых [19, 72,115].
По нашим данным, выявилось достоверное снижение абсолютного и относительного содержания CD4+ клеток с нарастанием длительности заболевания - процент CD4+ клеток от 42,82±0,71 у больных с впервые выявленным СД1 типа до 28±1,52% (р 0,05) у больных со стажем болезни более 10 лет; число CD4+ клеток от 0,82±0,06 -109/л до 0,52±0,07-109/л (р 0,05) соответственно. Литература, касающаяся содержания одной из основных регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов - CD4+ клеток в периферической крови больных СД1 в некоторой мере противоречива. Большинство авторов либо не находило у больных с впервые выявленным СД1 существенных изменений относительного и абсолютного количества CD4+ клеток [96, 116] либо выявляло снижение их числа в периферической крови [22, 115]. Значимое снижение содержания CD4+ клеток в периферической крови описано при длительно текущем СД1 [115]. В то же время отдельные авторы сообщают о повышении содержания CD4+ клеток в периферической крови при СД1 [116].
Вместе с тем у больных с впервые выявленным СД1 мы наблюдали достоверное снижение содержания CD8+ (17,0±0,45%). Эти данные совпадают с мнением некоторых авторов о том, что снижение содержания CD8+ клеток способствует поддержанию течения аутоиммунного процесса [20, 23, 65]. Причиной снижения уровня CD8+, по мнению исследователей, может быть повышенное образование иммунных комплексов, которые нарушают функцию су-прессорных клеток, а также метаболические нарушения при декомпенсации СД1 [30].
