Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 16
1.1 Механизмы нарушения репродуктивной функции: современные патогенетитические и иммунологические аспекты мужского и женского бесплодия 16
1.1.1 Патогенез мужского бесплодия 18
1.1.1.1 Роль иммунной системы в регуляции сперматогенеза 27
1.1.2 Патогенез женского бесплодия 35
1.1.2.1 Роль иммунной системы в регуляции созревания ооцитов, овуляции и имплантации эмбрионов 48
1.1.3 Цитокины и их роль в регуляции репродуктивного потенциала у мужчин и женщин 56
1.1.3.1 Цитокины семенной жидкости и их возможные функции 59
1.1.3.2 Цитокины фолликулярной жидкости и их возможные функции 68
1.2 Современные методы вспомогательной репродукции в лечении женского и мужского бесплодия 79
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 92
2.1 Характеристика обследуемых групп 92
2.1.1 Характеристика мужчин, включенных в исследование 93
2.1.2 Характеристика женщин, включенных в исследование 95
2.2 Методология клинических мероприятий 98
2.3 Методы клинико-лабораторного обследования пациентов 100
2.3.1 Инструментальные методы исследования 100
2.3.2 Лабораторные методы исследования 101
2.4 Специальные методы исследования 101
2.4.1 Порядок забора материала и его предварительная обработка 101
2.4.2 Спермиологическое исследование 102
2.4.3 Исследование параметров иммунитета 103
2.4.3.1 Культивирование лимфоцитов 103
2A3.2 Определение субпопуляций клеток методом проточной цитофлуориметрии 104
2.4.3.3 Метод оценки апоптоза клеток 105
2 A3 А Метод оценки биологической активности сыворотки крови и фолликулярной жидкости 106
2.4.3.5 Определение концентрации цитокинов методом ВЮ-PLEX анализа 108
2.5 Статистическая обработка полученных результатов 109
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 110
3.1 Характеристика клинико-лабораторных параметров у супружеских пар, включенных в программу лечения бесплодия с помощью вспомогательных репродуктивных технологий ПО
3.2 Характеристика параметров иммунитета у супружеских пар, включенных в программу лечения бесплодия с помощью вспомогательных репродуктивных технологий 123
3.2.1 Цитокиновый профиль семенной жидкости у мужчин с нормоспермией и патоспермией 123
3.2.2 Состояние иммунитета у женщин на различных этапах физиологического и стимулированного овариального цикла 133
3.2.3 Цитокиновый профиль фолликулярной жидкости и особенности овариальной функции 143
3.2.4 Клинико-иммунологический анализ эффективности лечения бесплодия с помощью вспомогательных репродуктивных технологий 157
3.3 Анализ информативности иммунологических параметров 173
4 в прогнозе наступления беременности при лечении бесплодия с помощью вспомогательных репродуктивных технологий
ГЛАВА 4. CLASS Обсуждение собственных результато CLASS в 187
Выводы 218
Практические рекомендации 220
Список литературы 222
- Роль иммунной системы в регуляции сперматогенеза
- Современные методы вспомогательной репродукции в лечении женского и мужского бесплодия
- Порядок забора материала и его предварительная обработка
- Цитокиновый профиль семенной жидкости у мужчин с нормоспермией и патоспермией
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Проблема инфертильности супружеских пар приобретает сегодня не только медицинское, но и огромное социально-демографическое и экономическое значение (Анохин Л.В., Коновалов О.Е., 1994; Заславская B.C., 2001; Подзолкова Н.М., 2003). По данным ВОЗ (WHO, 1999) около 100 млн. супружеских пар бесплодны и их число с каждым годом увеличивается. Частота бесплодных браков среди супругов репродуктивного возраста колеблется от 12 до 30,0% (Овсянникова Т.В., 1998; Филиппов О.С., 1999; Speroff L. et al., 1994 Tempelton A.A., 1999). Причиной бесплодного брака в 40-50% случаях является патология репродуктивной системы у одного из супругов, реже - в 25-30,0% у обоих (Селезнева И.Ю., 1999; Фролова О.Г., 2004). ВОЗ выделяет 22 причины женского и 16 причин мужского бесплодия. Женское бесплодие встречается у 35-40% бесплодных браков, на долю мужского бесплодия приходится 30-35% (WHO, 1999).
Бесплодный брак - это отсутствие беременности у женщины детородного возраста в течение одного года регулярной половой жизни без применения каких-либо контрацептивных средств, это сочетание социального неблагополучия, психического дискомфорта и практически всегда физического нездоровья супругов (Кулаков В.И., 2006).
Ситуация бесплодного брака требует от специалистов обширных знаний не только в гинекологии и андрологии, но и в эндокринологии, патофизиологии, терапии, генетике, иммунологии, неврологии, психологии и др. (Кунин А.И.,1989; Антонов А.И.,1992; Оганесян М.Г., 1997; Дейнека Н.В., 2001; Тимченко В.Н., 2007). Поэтому медицинская значимость проблемы инфертильности определяется необходимостью решения вопросов, связанных с совершенствованием методов диагностики, повышением эффективности лечения и профилактики бесплодия.
Известно, что современная диагностическая и лечебная помощь при бесплодии основывается на основополагающих достижениях в области
8 репродукции человека, к которым относятся: расшифровка механизмов гормональной регуляции репродуктивных процессов, что способствовало синтезу и эффективному применению гормонов в клинической практике (Сидорова И.С., 2004; Серов В.Н., 2005; Paul D.S., 1997); ультрасонографи-ческое сканирование, которое стало высокоинформативным при диагностике и лечении заболеваний, являющихся причиной бесплодия (Хачкурузов С.Г., 1999; Смирнова А.А., 2003); эндоскопическая хирургия, изменившая коренным образом научно-практический подход к проблеме бесплодного брака (Гаспаров А.С., 2001; Letterie G.S., 1999); принципиально новый метод лечения инфертильности - экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) и перенос эмбриона, в результате внедрения которого открылись перспективы в изучении неизвестных механизмов оплодотворения и имплантации (Никитин А.И., 1997; Кулаков В.И., 1999; Edwards R.G., 1995). Тем не менее, даже на современном этапе развития науки и практики в 8-10% случаев установить причину бесплодия не представляется возможным (Гаспаров А.С., 1999; Курило Л.Ф., 2000; Савельева, Г.М., 2004; Olsen J., 1996). Это связано с огромным числом разнообразных факторов, влияющих на репродуктивный процесс. Ряд авторов, разделяя мнение о влиянии мужского и женского факторов на зачатие и развитие эмбриона, обращают внимание, что сочетание этих составляющих может колебаться от 40 до 80% (Кулаков В.И., 2006). Так обстоит дело, с заболеваниями, передающимися половым путем, при которых инфекционный агент определяется у обоих половых партнеров. Подобные проблемы значительно быстрее могут быть решены в программах вспомогательной репродукции (ВРТ), когда оценке подвергаются именно те гаметы, которые в данный момент участвуют в процессе оплодотворения и есть возможность оценить состоятельность ранних этапов дробления зиготы и отсеять неполноценные гаметы и порочные эмбрионы. Однако и в этом случае эффективность оценки результатов определяется разрешающей способностью методов оценки качества гамет, включаемых в программу оплодотворения, точно так же, как и состояния образующейся
9 зиготы (Фанченко Н.Д. и др., 2000; Аншина М.Б., 2002; Светлаков А.В. и др., 2002; Тишкевич О.Л. и др., 2004). В то же время в ходе естественного оплодотворения приходится полагаться лишь на суммарные показатели, характеризующие состояние половой системы в момент обследования -показатели спермограмм, характеристики циклической работы яичников, уровни гормонов и т.д. В связи с чем, бесплодие как актуальная проблема требует комплексного подхода к ее решению с изучением не только клинических аспектов заболевания, но и патогенетических молекулярно-клеточных механизмов инфертйльности.
В настоящее время показано, что функционирование репродуктивной системы как у мужчин, так и женщин осуществляется при тесном взаимодействии с иммунной и эндокринной системами (Древаль А.В., 2001; Schlatt S. et al., 1997). Установлено, что пролактин способен вызывать активацию опосредованного макрофагами яичка синтеза TNF-a и как следствие уменьшение наработки стимулируемого гонадотропином тестостерона клетками Лейдига (Huang W.J. et al., 2003). Увеличение же уровня тестостерона усиливает клеточный иммунитет (Donat Н. et al., 2002). Поэтому, можно предположить, что не только локально синтезируемые цитокины, но и цитокины из общего сосудистого русла способны проявлять свои эффекты на тестикулярном уровне. О чем свидетельствуют факты активного участия цитокинов в формировании гамет и регуляции сперматогенеза (Hedger М.Р., Meinhardt А., 2003; Itman С. et al., 2006; Lui W.Y., Cheng C.Y., 2007), а также их вклада в иммуносупрессию семенной плазмы (Ochsenkuhn R. et al., 2006). У женщин, происходящие во время менструального цикла и беременности изменения контролируются со стороны гипоталамо-гипофизарной системы и являются прямым результатом индуцированного гормонами тканевого ремоделирования тканей яичника и слизистой матки. Действие гормонов на клеточном уровне реализуется через вовлечение множества пептидных ростовых факторов, среди которых особая роль отводится цитокинам, синтезируемым иммунокомпетентными клетками
10 (Machelon V., Emilie D., 1997; Al-Harthi L. et al., 2000; Bornstein S.R. et al., 2004). Наряду с регуляцией овариальной функции клетки иммунной системы и продуцируемые ими цитокины выполняют исключительно важную роль в подготовке эндометрия к имплантации эмбриона, а впоследствии — в сохранении беременности (Sharkey А., 1998; Norwittz M.D. et al., 2001; Jones R.L. et al., 2004).
На сегодняшний день наиболее исследованными являются иммунологические аспекты, связанные физиологическим протеканием беременности и включающие изучение механизмов иммунологической перестройки, направленной на подавление реактивности иммунной системы матери по отношению к аллоантигенам плода. Вместе с тем роль иммунной системы в регуляции самых ранних этапов репродуктивного процесса - фолликуло-генеза, овуляции, доимплантационных этапов развития эмбриона и его имплантации, остаются существенно менее изученными (Buculmez О., Arici А., 2000; Szekeres-Bartho J., 2002). Учитывая тесную взаимосвязь иммунной и репродуктивной системы, становится очевидным, что наличие исходных иммунных дисфункций, а также развитие их в процессе стимуляции гиперовуляции может быть серьезной причиной низкого качества ооцитов, дефекта оплодотворения яйцеклетки, нарушения развития и имплантации эмбриона, и, в конечном итоге, невынашивания беременности (Speroff L. et al., 1999). Поэтому большой интерес представляет исследование показателей системного и локального иммунитета, а также овариальной функции в группах женщин, оппозитных по уровню фертильности, качеству эмбрионов, имплантации и клинической беременности. Исследования такого рода имеют большое теоретическое и практическое значение, поскольку позволяют осмыслить новые аспекты иммуно-эндокринной регуляции ранних этапов репродуктивного процесса и патогенеза бесплодия, а, также разработать прогностические критерии эффективности проведения вспомогательных репродуктивных технологий.
Цель. Изучить иммунопатогенетические особенности нарушения фертильной функции у мужчин и женщин, состоящих длительное время в бесплодном браке, и провести анализ изменений иммунного и цитокинового статуса в зависимости от эффективности программы вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО).
Задачи:
1. Исследовать особенности гормонального статуса и состояния
микробиоценоза урогенитального тракта у мужчин и женщин из бесплодных
супружеских пар, включенных в программу вспомогательных репродуктив
ных технологий (ЭКО).
2. Провести спермиологическое исследование с оценкой количества
сперматозоидов, их двигательной способности и морфологических особен
ностей у мужчин, состоящих длительное время в бесплодном браке.
Изучить содержание цитокинов в спермальной плазме при нормоспермии и патоспермии у мужчин, состоящих длительное время в бесплодном браке и провести сравнительную оценку изменения характера цитокинового баланса в зависимости от степени лейкоцитоспермии.
Выявить закономерности взаимоотношений между морфологическими, функциональными характеристиками сперматозоидов и цитоки-нами спермальной плазмы у мужчин, состоящих длительное время в бесплодном браке.
Изучить особенности иммунитета женщин на этапах овариального цикла при его физиологическом течении и в условиях проведения контролируемой гиперстимуляции по программе вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО).
Провести анализ содержания цитокинов в фолликулярной жидкости на пике стимулированной суперовуляции и на этой основе оценить роль цитокинов в процессе созревания ооцитов.
7. Провести сравнительный анализ параметров иммунного и
цитокинового статуса женщин в зависимости от эффективности вспомога
тельных репродуктивных технологий (ЭКО).
8. Проанализировать информативность и прогностическую
значимость показателей иммунитета и овариальной функции в оценке
эффективности лечения бесплодия с помощью вспомогательных репро
дуктивных технологий (ЭКО).
Научная новизна исследования.
Показано, что важным иммунопатогенетическим звеном нарушения фертильной функции у мужчин и женщин, состоящих длительное время в бесплодном браке, является нарушение цитокин-опосредованных и клеточно-опосредованных механизмов регуляции репродуктивного процесса в организме.
Впервые обнаружено, что нарушение локальной продукции цитокинов у мужчин из супружеских пар с бесплодием может негативно сказываться на подвижности и морфологии сперматозоидов и, как следствие, приводить к снижению их фертилизационного потенциала в условиях латентного воспалительного процесса в мужском репродуктивном тракте и эндокринной дисрегуляции сперматогенеза. Установлено, что при патоспермии в семенной плазме мужчин наблюдается повышенный уровень Thl/провоспалительных цитокинов (IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-12) в сочетании с ростом хемокинов (IL-8, МСР-1, МІР-ір) и дефицитом IL-7.
Впервые установлено, что на пике стимулированной суперовуляции происходит изменение баланса регуляторных факторов в сторону доминирования медиаторов с иммуносупрессорной, противовоспалительной и проапоптогенной активностью. Сдвиг баланса регистрируется как на системном (в крови), так и на местном (в фолликулярной жидкости) уровне и сочетается с увеличением доли циркулирующих регуляторных CD4+CD25+ Т-лимфоцитов, что свидетельствуют о супрессорной реорганизации цитокин-
13 опосредованных и клеточно-опосредованных иммунорегуляторных механизмов фолликулогенеза.. . .
Впервые дана характеристика цитокинового профиля микроокружения фолликула у женщин с бесплодием при проведении контролируемой суперстимуляции яичников по программе вспомогательных репродуктивных технологий ( ЭКО). Установлено, что усиление противовоспалительного и иммуносупрессорного потенциала фолликулярных факторов ассоциируется со снижением уровня IL-8 и IFN-y, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, G-CSF цитокинов.
Впервые показано, что у женщин с бесплодием в условиях фолликулярного многокомпонентного дефицита ТЫ/провоспалительных, Тп2/противоспалительных цитокинов, ростовых факторов и хемокинов нарушаются как количественные, так и качественные характеристики ооцитов, и как следствие — эффективность оплодотворения в культуре in vitro при проведении вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО). Баланс и уровень цитокинов в микроокружении фолликула не только определяет количество и качество созревающих ооцитов, но также имеют большое значение для имплантации оплодотворенных яйцеклеток.
Практическая значимость исследования.
В результате выполнения работы получены новые данные, позволяющие расширить существующие научные представления о роли иммунного и цитокинового -статуса в регуляции фертильной функции мужчин и женщин, а также раскрыть иммунно-патогенетических механизмы формирования бесплодного брака.
Комплексное исследование цитокинового спектра семенной и фолликулярной жидкости могут позволить выявить минимальные, «неочевидные» нарушения, которые в изолированном виде не являются определяющими для развития мужского или женского бесплодия, но становятся патогенетически значимыми, когда одновременно присутствуют у супругов, состоящих в бесплодном браке.
Комплексная оценка параметров иммунного и цитокинового статуса у женщин с бесплодием, обследованных на пике стимулированной суперовуляции, может использоваться в качестве ранних прогностических маркеров эффективности программы вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО).
Разработана методологическая основа для выделения диагностического комплекса признаков, прогнозирующего вероятность неэффективного цикла программы вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО), что может послужить дополнительной основой для изменения тактики лечения бесплодия.
Положения, выносимые на защиту.
Наиболее типичными особенностями патогенеза бесплодных пар являются наличие гормональной дисфункции, проявляющейся в андрогенной активности у мужчин и стероидогеннуои активности яичников у женщин, а также нарушение микробиоциноза урогенитального тракта.
В патогенезе нарушения сперматогенеза у мужчин из супружеских пар с бесплодием ведущая роль принадлежит изменению цитокинового баланса, что проявляется в увеличении содержания Thl/провоспалительных, цитокинов, хемокинов и снижением уровня Тп2/противоспалительных цитокинов в семенной плазме.
В овуляторный период менструального цикла на пике контролируемой суперовуляции по программе экстракорпорально оплодотворения у женщин с бесплодием происходит сдвиг баланса регуляторных факторов на системном и местном уровнях, что проявляется усилением иммуносупрессорной и противовоспалительной активности крови и фолликулярной жидкости.
Цитокины, продуцируемые в микроокружении фолликула, принимают активное участие в регуляции процесса созревания ооцитов, определяя не только количественные и качественные характеристики созревающих ооцитов, но также эффективность последующей имплантации
15 оплодотворенных яйцеклеток и развитие беременности у женщин с бесплодием в цикле экстракорпорально оплодотворения.
5. Параметры иммунного и цитокинового статуса, а также показатели овариальной функции женщин, обследованных на этапе стимулированной суперовуляции, могут являться прогностическими критериями результативности экстракорпорального оплодотворения
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 266 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение собственных результатов», выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 506 источников, из них 139 отечественных и 367 иностранных.
Диссертация иллюстрирована 46 таблицами и 9 рисунками.
Роль иммунной системы в регуляции сперматогенеза
Сперматогенез является одним из наиболее динамичных процессов в организме человека, связанных с клеточной регенерацией и дифференциров-кой. Он протекает под контролем специфических генов развивающихся гамет и регулируется совокупностью гормонов, цитокинов и факторов роста. Как известно, основные показатели фертильности спермы - общая концентрация сперматозоидов в эякуляте и их подвижность (Йен С.С.К., Джаффе Р.Б., 1998; KohE.etal., 2006).
Необходимым условием мужской фертильности является завершенный сперматогенез, который включает митотические деления сперматогоний, последовательные мейотические деления сперматоцитов 1-го и 2-го порядка, а также морфофункционалъную дифференцировку сперматид в зрелые сперматозоиды (Леонтьева О.А., Воробьева О.А., 1999; Kretser D.M. et al., 1998). Сперматогенез протекает в яичках, внутри извитых семенных канальцев, имеет четкий ритм и равномерную интенсивность, а полный цикл превращения сперматогония в зрелый сперматозоид занимает по времени у человека около 74—75 сут (Райцина С.С., 1985).
В регуляции сперматогенеза задействованы как эндокринные, так и аутокринные и паракринные механизмы (Древаль А.В., 2001; Schlatt S. et al., 1997). Хотя гормональные сигналы являются обязательными для успешного сперматогенеза, тем не менее, ряд исследований свидетельствует о вовлеченности в этот процесс множества других пептидов, ростовых факторов, цитокинов (Евдокимов В.В. и др., 2003; Останин А.А. и др., 2006; Fresser L.R. et al., 1997; Hedger M.P., Meinhardt A., 2003). Так, показано, что в семенной плазме содержатся различные цитокины и их растворимые рецепторы (Srivatsava M.V. et al., 1996; Maegawa M. et al., 2002). При этом уровень отдельных цитокинов, например, трансформирующего ростового фактора-(31 (TGF-pi), интерлейкина-8 (IL-8), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в семенной жидкости значительно превышает аналогичные сывороточные концентрации, что указывает на потенциальную роль цитокинов в регуляции мужской фертильности (Friebe К., 2003; Gutsche S., 2003).
Основными продуцентами цитокинов, содержащихся в эякуляте являются тестикулярные клетки Лейдига и Сертоли, перитубулярные и эпителиальные клетки придатков яичка, добавочных половых желез (семенных пузырьков, Купера желез, предстательной железы), а также иммунокомпетентные клетки (лимфоциты, моноциты/макрофаги, NK-клетки), широко представленные во всех отделах репродуктивного тракта (Останин А.А. и др., 2006; Wang, D.L. et al., 1991; Teerds K.J. et al., 1993; Hutson J.C., 1994; Kern S. et al., 1995; Syed V. et al., 1995; Hedger M.P., 1997; Stephan J.P. et al., 1997). Хотя есть предположения, что сперматоциты и даже сами сперматозоиды могут синтезировать IL-la (Haugen Т.В. et al.,1994).
Показано, что половые клетки различной степени зрелости, включая сперматозоиды, содержащиеся в эякуляте, экспрессируют на своей поверхности функциональные рецепторы к TGF-B/a (Silwa L., 2003), гепатоцитарному ростовому фактору (НСР) (Catizone A et al, 2002), инсулиноподобному ростовому фактору (IGF-IR), гранулоцитарно-макрофа-гальному колониестимулируюшему фактору (GM-CSF), интерлейкину-2 (IL-2R а- и В- цепи), хемокикам (RANTES, фракталкин) и т.д.
Известно, что яичко, несмотря на его иммунный, привилегированный статус не изолировано от иммунной системы (Hedger, М.Р., 1997). В дополнение к макрофагам «резидентам» в нем были найдены тучные клетки, смежные с подкапсулярными кровеносными сосудами (Gaytan, F. et al., 1989; Roaiah M.M. et al., 2007). Как и в большинстве других тканей, циркулирующие иммунные клетки, включая Т лимфоциты, также имеют относительно свободный доступ к яичку (Hedger М.Р., Meinhardt А., 2000), и яичко имеет эффективный и эффективный лимфатический дренаж к региональным лимфатическим узлам (Head J.R. et al., 1983). Поэтому, локально синтезируемые цитокины, так же как и цитокины из общего кровотока способны проявлять свои эффекты на тестикулярном уровне. Имеются доказательства, что цитокины играют важную роль в реструктуризации Сертоли-Сертоли клеточных и Сертоли-Эмбрион клеточных взаимоотношений на семявыносящем эпителии в процессе сперматогенеза (Lui W.Y., Cheng C.Y., 2007).
Исследования показали, что местная и системная инфекция вызывают переходное низкоуровневое регулирование продукции андрогенов (О Bryan М.К. et al., 2000). Есть признаки, подчеркивающие связь между воспалением в яичке (орхитом) и формированием антиспермальных антител у мужчин с эпидемическим паротитом, что, в конечном счете, приводит к стерильности. Хотя остается вопрос, как различные уровни воспаления оказывают воздействие на стероидогенез и сперматогенез? Часть объяснения может лежать в факте, что те же самые цитокины, вовлеченные в развитие воспаления генерируются в нормальном яичке неиммунными тестикуляр-ными клетками, и добиваются интеграции тестикулярных процессов через различные механизмы.
Современные методы вспомогательной репродукции в лечении женского и мужского бесплодия
В настоящее время известен широкий спектр высокоэффективных методов лечения бесплодия (гормональные препараты, эндоскопические методы, методы вспомогательной репродукции и т.д.), являющихся звеньями одной цепи, конечная цель которой - максимально быстрая реализация мужской и женской фертильности. Эти методы не являются антагонистами, а взаимно дополняют друг друга (Кулаков В.И., Леонова Б.В., 2000). Так, например, для лечения абсолютного трубного бесплодия был предложен способ, заключающийся в оплодотворении яйцеклетки вне организма женщины с переносом эмбриона в полость матки, где и происходит его имплантация. Данная процедура получила название экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и переноса эмбриона. Она имеет общую продолжительность 4-5 недель и включает нескольких этапов: гормональную стимуляцию роста нескольких фолликулов в яичниках (стимуляцию суперовуляции); пункцию фолликулов и забор яйцеклеток; оплодотворение яйцеклеток спермой в условиях in vitro; перенос эмбрионов в полость матки (через 48 - 72 часа после пункции). Показанием для проведения ЭКО является бесплодие, не поддающееся терапии, или вероятность преодоления которого с помощью ЭКО выше, чем другими методами.
Первоначально ЭКО проводились в естественных циклах, однако такой подход имел много недостатков: получение только одного фолликула, высокий риск потери или получения незрелого фолликула, привязанность лаборатории к моменту спонтанной овуляции, низкая частота наступления беременности. Поэтому впоследствии ЭКО стали проводить в режиме контролируемой гиперстимуляции яичников, что позволило резко повысить частоту наступления беременности (АншинаМ.Б., 1995; Никитин А.И., 1995; ; Фанченко Н.Д. и др., 2000; Национальный регистр..., 2002).
В мировой практике ЭКО начали использовать с начала 80-ых годов. В настоящее время этот метод прочно вошел в практику лечения бесплодных браков и перестал быть прерогативой отдельных ведущих зарубежных или отечественных учреждений. Практически во всех крупных городах России созданы центры ЭКО, и число их продолжает стремительно расти. Начиная с 1996 г. в России создан национальный регистр результатов вспомогательных репродуктивных технологий, и наша страна стала участником всемирного и европейского регистров. Это дало возможность проанализировать результаты ЭКО в отечественных центрах и показало сопоставимость полученных результатов с мировым опытом (Аншина М.Б., 2002).
Первый ребенок после ЭКО в России родился в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН (г. Москва) в 1986 году (Кулаков В.И., 2002). По данным Европейской ассоциации репродуктологов в Европе на сегодняшний день существует более 580 клиник, занимающиеся проблемами бесплодия, в которых проводится более 290 000 циклов ВРТ в год, из них 25,5% заканчиваются родами. В США в 430 клиниках ЭКО проводится более 110000 циклов в год с частотой наступления беременности в среднем 32,5%. В России на сегодняшний день зарегистрировано несколько десятков медицинских учреждений, в которых используются методы ВРТ и проводится до 10000 циклов ВРТ в год, при этом частота наступления беременности составляет около 26% (Фанченко Н.Д. и др., 2000; Аншина М.Б., 2002). В тоже время следует отметить, что успех ЭКО во многом зависит от причин бесплодия (Светлаков А.В. и др., 2002; Тишкевич О.Л., и др., 2004). Так, J. Farhi и соавт (1995) провели ретроспективный анализ циклов ЭКО у женщин с документально подтвержденным наличием миомы. Частота имплантации составила 22,1% в расчете на перенос эмбрионов и 6,8% на эмбрион, а частота невынашивания - 36%. Результаты гистероскопического исследования показали, что нарушение имплантации имело место только в случаях, когда миома сочеталась с деформацией полости матки за счет выпячивания ее стенки. Авторами делается вывод, что оперативное удаление миоматозных узлов перед назначением ЭКО показано только при деформации полости матки. Эти выводы подтверждают и другие исследователи (Назаренко Т.А. и др., 2004).
В последнее время активно обсуждается вопрос о целесообразности терапии в течение 4-6 месяцев пролонгированными препаратами а-ГнРГ женщин с миомой матки перед проведением у них ВРТ. При этом удается достичь уменьшения размеров миомы на 30-85% (Stewart Е.А., Friedman A.J., 1992). Однако имеются наблюдения, что миоматозные узлы достигают первоначальных размеров практически в течение 2-х недель последующей индукции суперовуляции гонадотропинами.
Публикации о проведении ВРТ пациенткам с пороками развития матки немногочисленны. N. Lavergne и соавт. (1996) считают, что исходы ВРТ у данной категории пациенток хуже, чем в других группах, однако они во многом зависят от типа порока и возможности его хирургической коррекции. Авторы изучали исходы ЭКО у пациенток с различными аномалиями развития матки. Частота имплантации в исследуемой группе составила 5,8% против 11,7% в контроле, частота наступления беременности - 13,6 и 24,9%) соответственно.
В последние годы ВРТ все чаще применяют для лечения бесплодия у пациенток с эндометриозом, с сопутствующей патологией труб (Barnhart K.et M. et al., 1997; Strandell A. et al., 1999), в основном за счет снижения частоты имплантации эмбрионов. Так, Mukherjee и соавт. (Mukherjee Т. et al., 1996) изучали эмбриотоксическое влияние содержимого гидросальпингса на эмбриогенез мышей in vitro. Результаты исследования показали, что жидкость из гидросальпингса даже при разведении до 1% раствора дает выраженный эмбриотоксический эффект, что приводит к снижению имплантации эмбриона и ухудшению течения беременности.
Порядок забора материала и его предварительная обработка
Кровь у всех обследуемых лиц забирали натощак в утренние часы в положении сидя из локтевой вены в вакуумные пробирки в количестве 10 мл.
После 1-2 часовой экспозиции при 20С кровь охлаждали до 4С и подвергали центрифугированию (1000 g в течение 10 мин при 4С). Полученная сыворотка замораживалась и хранилась при - 60С в контейнере с жидким азотом. Кроме этого материалом исследования служили эякуляты, полученные после 3-4-дневного воздержания. Пробы собирали в стерильные бюксы. Разжижение образцов происходило при 37С в течение 30-60 мин.
Для получения семенной плазмы (СП) часть эякулята центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин, после чего собранный супернатант повторно центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин с целью удаления оставшихся клеточных элементов и дебрита. Полученную СП хранили при - 80С до последующего определения уровня цитокинов.
Образцы фолликулярной жидкости (ФЖ) получали во время процедуры трансвагинальной пункции фолликулов после проведения курса контролируемой стимуляции суперовуляции.
Спермиологическое исследование проводилось в соответствии с рекомендациями ВОЗ (WHO..., 1999). Оценивали объем эякулята, количество сперматозоидов в эякуляте и в 1 мл, количество лейкоцитов в 1 мл, жизнеспособность и морфологию сперматозоидов (относительное содержание нормальных и дефектных клеток с патологией головки, шейки или хвоста), процентное количество сперматозоидов, прошедших через градиент плотности. Подвижность сперматозоидов оценивали по четырем категориям: А - нормокинетические; В - гипокинетические; С - дискине-тические и D - акинетические сперматозоиды.
Для прогнозирования оплодотворяющей способности сперматозоидов проводится анализ их морфологических признаков с использованием критериев нормы, предложенных Т. Kruger и соавт (1986, 1988).
При анализе строения сперматозоидов клетки отделяли от семенной жидкости, наносили тонким слоем на стекло и высушивали. Препараты фиксировали в 70% этаноле в течение 10 мин, после чего высушивали и окрашивали гематоксилином Харриса и бенгальским розовым фирмы «Fisher Scientific». Анализ структуры клеток проводили при увеличении 1000 (об. 100, ок. 10), анализировали по 200 клеток на каждом препарате. Для морфологически нормального сперматозоида характерна овальная форма головки длиной 5-6 мкм, шириной - 2,5-3,5 мкм, акросомальный участок занимает от 40 до 70% площади головки, при этом отсутствуют аномалии шейки, хвоста, срединное тело не выражено. Пограничные формы, имеющие слегка удлиненную головку диаметром 2,0-2,5 мкм или небольшие утолщения в области шейки, но хорошо выраженный акросомальный участок, относили к категории аномальных.
Особенности строения сперматозоидов, отличающие его от морфологически нормальных, оценивались по следующим критериям: патологии головки сперматозоидов, сперматозоиды с патологией шейки и сперматозоиды с аномалиями хвоста. При наличии у сперматозоида нескольких видов изменений его относили к группе с наиболее тяжелыми повреждениями (Menkveld R. et al., 1990; Eggert-Kruse W. et al., 1996).
Иммунологические исследования, осуществлялось совместно с сотрудниками лаборатории клеточной иммунотерапии ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск (руководитель лаборатории доктор медицинских наук, профессор Черных Е.Р.).
В качестве исследуемого материала использовались: лейковзвесь, сыворотка, мононуклеарные клетки (МНК), фолликулярная жидкость и семенная плазма.
Мононуклеарные клетки (МНК) культивировали в планшетах для иммунологических исследований при температуре 37С во влажной атмосфере, содержащей 5% СОг. Полная культуральная среда состояла из среды RPMI-1640, дополненной 10% инактивированной сыворотки доноров AB (IY) группы, 2мМ HEPES-буфера, 0,3 мг/мл глютамина (все реактивы фирмы Sigma) и гентамицином (100 мкг/мл). Количество МНК, вносимых в лунку, составляло 0,1 х 10" клеток в 0,15 мл культуральной среды. Для стимуляции клеток использовали конканавалин А (КонA, Sigma) в концентрации 15 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч по включению в нуклеопротеидные фракции клеток Н-тимидина, вносимого за 18 ч до окончания культивирования в дозе 1 мкКю/лунку. Подсчет радиоактивности материала производили в жидкостном сцинциляционном счетчике SL - 30 (Intertechnic, Франция). Результаты представляли в виде среднего счета (имп/мин) из трех идентичных культур. Рассчитывали индекс влияния (ИВКОНА)5 который представлял собой отношение уровня пролиферативного ответа клеток в стимулированных культурах к уровню спонтанной пролиферации.
Цитокиновый профиль семенной жидкости у мужчин с нормоспермией и патоспермией
В настоящее время установлено, что в семенной жидкости содержатся различные цитокины и их растворимые рецепторы (Huleihel М. et al, 1996; Srivastava M.D. et al., 1996; Maegawa M. et al, 2002). При этом основными продуцентами цитокинов, содержащихся в эякуляте, являются тестикулярные клетки Лейдига и Сертоли, перитубулярные и эпителиальные клетки придатков яичка, добавочных половых желез, а также иммунокомпетентные клетки, широко представленные во всех отделах репродуктивного тракта (Filippini A. et al., 2001; Hedger М.Р., Meinhardt A., 2003; Friebe К. et al., 2003; Motrich R.D. al., 2005). Все это свидетельствует о важной роли цитокинов в репродуктивной физиологии мужчин. Однако, клиническая значимость измерения спермальных цитокинов в лабораторной диагностике мужского бесплодия, оценке фертилизационного потенциала сперматозоидов, отборе пациентов для дифференцированного лечения бесплодия с помощью ВРТ и прогнозе их эффективности, по-прежнему, остается дискуссионной.
Поэтому целью данного фрагмента работы явилось измерение в СП мужчин с нормоспермией и патоспермией уровня 17 цитокинов человека (IL-1р\ TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MCP-1, МІР-1(3).
Для удобства восприятия материала, анализируемые 17 цитокинов, были отнесены к нескольким подгруппам (табл. 16). В тоже время, учитывая полифункциональность многих цитокинов, а также возможность их продукции различными типами клеток, следует признать относительную условность такого разделения. Так, например, Thl и Th2 цитокины продуцируются не только СВ4+Т-хелперами, но также С08+Т-лимфоцитами и другими субпопуляциями клеток (Lucey D.R. et al., 1996; Mosmann T.R., Sad S., 1996). Дополнительно могла быть выделена и подгруппа противовоспалительных цитокинов, куда с полным правом могли войти IL-10 и IL-ІЗ. В свою очередь, подгруппа провоспалительных цитокинов могла быть дополнена хемокинами, а также IL-6, который, как известно, вместе с IL-ip выступает в качестве индуктора острофазового ответа, но с другой стороны может проявлять и альтернативные (противовоспалительные и иммуно-супрессорные) свойства (Tilg Н., et al., 1997).
Из результатов табл. 16 видно, что в образцах СП, полученных от мужчин, включенных в программу ВРТ, идентифицируется широкий спектр цитокинов, включая Thl/провоспалительные (IFN-y, IL-2, TNF-a, IL-ip, IL-12) и Тп2/противовоспалительные (IL-4, IL-5, IL-10, IL-6) цитокины, хемокины (IL-8, МІР-lb, MCP-1) и ростовые факторы гемоиммунопоэза (G 125 CSF, GM-CSF, IL-7). При этом следует отметить, что хотя ТЫ/ провоспали-тельные и ТЬ2/противовоспалительные цитокины отчетливо детектируются в СП, тем не менее, их средние значения не превышают 10-20 пг/мл, тогда как хемокины и ростовые факторы обнаруживаются в эякуляте в достаточно высоких концентрациях.
