Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные взгляды на патогенетические механизмы, методы исследования и лечения мужского бесплодия (обзор литературы) 15
1.1. Медико-социальные аспекты бесплодного брака 15
1.2. Этиологические факторы мужского бесплодия 22
1.3. Классические методы исследования эякулята 30
1.4. Генетическая природа нарушений фертильности 35
1.5.Оксидативный стресс как причина дефектной функции сперматозоидов 38
1.6. Методы исследования свободнорадикального окисления 45
1.7. Возможности медикаментозной терапии при патозооспермии 48
1.8. Актуальность криоконсервации спермы (развитие криобиологии) 55
1.9. Заключение 60
Глава 2. Материалы и методы исследования 64
2.1. Объекты исследования 65
2.2. Методы обследования пациентов 67
2.3. Экспериментальная модель интоксикации 77
2.4. Исследование процессов свободнорадикального окисления до и после криоконсервации спермы 83
2.5. Статистическая обработка полученных результатов 87
Глава 3. Анализ параметров семенной жидкости у мужчин с бесплодием 88
3.1. Характеристика обследованных лиц 88
3.2. Изменения параметров спермограммы за период наблюдения 91
3.3. Распределение патозооспермии по районам Башкирии 97
3.4. Сопоставление полученных данных с уровнем загрязненности территорий 102
3.5. Содержание диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме мужчин, жителей индустриальных городов 107
Глава 4. Влияние репротоксических факторов на процессы свободнорадикального окисления в сперме мужчин с идиопатическим бесплодием 116
Глава 5. Экспериментальные модели повреждающего действия экзогенных факторов на сперматогенез 129
5.1. Оценка влияния хронической интоксикации на сперматогенез и процессы свободнорадикального окисления 129
5.2. Влияние криоконсервации на процессы свободнорадикального окисления 152
Заключение 156
Выводы 192
Практические рекомендации 194
Список литературы 195
Приложения 244
- Медико-социальные аспекты бесплодного брака
- Исследование процессов свободнорадикального окисления до и после криоконсервации спермы
- Сопоставление полученных данных с уровнем загрязненности территорий
- Оценка влияния хронической интоксикации на сперматогенез и процессы свободнорадикального окисления
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Около 15% супружеских пар во всем мире имеют проблемы с естественным наступлением беременности (Тиктинский О.Л., Михайличенко В.В., 1999; Экстракорпоральное оплодотворение и его новые направления в лечении женского и мужского бесплодия (теоретические и практические подходы), 2000). Роль мужского фактора в бесплодном браке составляет не менее 40% (Кирпатовский И.Д., 1995; Урология, 2005; Healy D.L., Trounson А.О., Andersen A.N., 1994). В последние десятилетия снижается активность сперматогенеза у мужчин в различных странах (Purvis К., 1992; Farrow S., 1994; Irvine S., 1996; De Kretser D.M., 1998).
Решение проблемы мужского бесплодия (МБ) является одним из нереализованных резервов повышения рождаемости, что имеет большое социально-экономическое значение для современной России с ее крайне неблагоприятными демографическими показателями. Гипотетически, при условии ликвидации бесплодия и реализации бесплодными парами желаемого числа детей в семье, можно ожидать увеличения рождаемости на 10% (Коновалов О.Е., 1990). Как известно, в России вопросы здоровья будущих поколений традиционно рассматриваются в аспекте охраны здоровья матери и ребенка. Репродуктивное здоровье мужчины часто остается вне поля зрения врачей и организаторов здравоохранения.
Принципиальной биологической особенностью мужского организма являются более низкие компенсаторные возможности, нежели у женщин. Мужчина по сравнению с женщиной характеризуется в настоящее время более высокой заболеваемостью и смертностью и, соответственно, меньшей продолжительностью жизни. В экстремальных ситуациях организм мужчин менее приспособлен к резким колебаниям состояния внешней среды в целом, кроме того, для большинства ксенобиотиков было показано, что индуцируемая
реактивность ферментативных систем их детоксикации у мужчин выражена значительно слабее, чем у женщин (Sierra-Santoyo A., Hernandez М., Albores А., Cebrian М.Е., 2000). Иными словами, адаптивные возможности мужского организма сравнительно невелики и истощаются быстрее. Большинство авторов связывают ухудшение показателей репродуктивного здоровья мужчин с антропогенным загрязнением окружающей среды (Никитин А.И., 2005).
Ряд исследований свидетельствует о том, что распространенность нарушений детородной функции среди мужского и женского населения в 1,5 раза выше в населенных пунктах с высокой техногенной нагрузкой (Бурденко Л.Г., 1996). Факты вмешательства ксенобиотиков в деятельность жизненно важных систем, включая репродуктивную, хорошо известны. Например, низкое качество семени в штате Миссури по сравнению с другими штатами США связывают с загрязнением пестицидами, широко применявшимися в этом сельскохозяйственном регионе (Swan S., Kruse R., Liu F. et al., 2003). Были* продемонстрированы также тесные ассоциации между уровнем контаминации другими экотоксикантами и репродуктивным статусом мужчин (Tas S., Lauwerys R., Lison D., 1996; Figa-Talamanca I., Traina M., Urbani E., 2001).
Нарушение гаметогенеза у мужчин, состоящих в бесплодном браке, несмотря на многообразие этиологических факторов, является звеном в патогенезе ограниченного числа типовых патологических процессов, которые клинически могут проявляться в виде различных заболеваний, что затрудняет выбор патогенетически обоснованной терапии и является причиной необоснованной полипрагмазии (Шупегин В.В., 2003). В современном мире довольно высок удельный вес категорий мужской инфертильности, отнесенных к идиопатическим формам. Это отражает реальную структуру бесплодия в современных условиях. Примерно у 25% бесплодных мужчин причину патологии не находят. Во многом это объясняется отсутствием стандартизованных методов исследования мужской половой сферы. Следует заметить, что при идиопатическом бесплодии ни один из препаратов априори
7 не может доказать свою эффективность, поскольку группа пациентов с
идиопатическим бесплодием заведомо-неоднородна. Именно поэтому главной
задачей в андрологии является не поиск новых фармакологических препаратов,
а углубленный анализ- патогенеза формирования инфертильности у мужчин в
каждом конкретном случае в целях подбора патогенетически оправданной'
терапии (Артифексов СБ., Артифексова А.А., Седышева И.В., Овчинникова
Е.В., 2006).
Выбор конкретных методов лечения МБ затруднителен на сегодняшний
день по нескольким причинам (Артифексов СБ., Артифексова А.А., Сергеев
М.Ю., Седышева И.В., 2006):
Наличие большого числа фармакологических средств, рекомендуемых для коррекции мужской инфертильности,-
Отсутствие патогенетических показаний к применению того-или», иного метода лечения* или препарата, поскольку основанием- для применения фармакологических средств является патоспермия, но не вызвавшие её* причины.
Недостаточная изученность особенностей этиологии и патогенеза. мужской инфертильности и наличие' нескольких возможных причин патоспермии у одного мужчины.
В настоящий момент назрела необходимость разработки принципов этиотропной и патогенетической терапии, обеспечивающей возможность существенно облегчить оценку эффективности уже существующих и вновь предлагаемых препаратов за счет формирования однородных групп пациентов (Артифексов СБ., Артифексова А.А., Сергеев М.Ю., Седышева И.В., 2006).
В последние годы особое внимание уделяется влиянию свободных радикалов (СР) на мужскую половую функцию. Хотя окислительный стресс может отрицательно влиять на сперматогенез, нормальное функционирование сперматозоидов, требует присутствия физиологических количеств активных форм кислорода (АФК) (Aitken R.J., Fisher Н., 1994; Aitken RJ:, 1995). Многие
8 авторы отмечают, что АФК играет основную роль в процессах гиперактивации
сперматозоидов, ведущей к капацитации и развитию акросомальной реакции
(De Lamirande Е., Gagnon С, 1993; Aitken R.J., Harkiss, Knox W. et al., 1998; De
Lamirande E., Harakat A., Gagnon C, 1998).
Наибольшей способностью к генерации АФК обладают незрелые сперматозоиды с неполноценной морфологической структурой (Gagnon С., Iwasaki A., Lamirande E.D., 1991; Zalata A., Hafez Т., Comhaire F. et al., 1995; Ollero M., Gil-Guzman E., Lopez M.C. et al., 2001). АФК в избыточном количестве могут инициировать нарушения в сперматозоидах путем индукции оксидативного повреждения клеточных липидов, протеинов и ДНК, что является одним из механизмов патогенеза МБ (Griveau J.F., Le LannouD", 1997; Kemal DuruN., Morshedi Ml, Oehninger S., 2000). Образование реактивных форм-кислорода в эякулятах мужчин с олигозооспермией было значительно выше, чем при нормозооспермииі(Непке1 R., Ichikawa Т., Sanchez R., 1997; Gil-Guzmans E., Ollero M., Lopez M.C., et al., 2001; Wang X., Sharma R.K., Sikka S.C. et al., 2003). Содержание кислородных радикалов в сперме значительно выше у мужчин с варикоцеле, идиопатическим бесплодием, простатитом (Mazzilli F., Rossi Т., Marchesini М. et al., 1994; Sharma R.K., Pasqualotto F.F., Nelson D.R. et al., 1999).
В норме сперматозоиды защищены от окислительного стресса ферментами антиоксидантной системы, регулирующей концентрацию АФК. Эта система включает в себя такие ферменты, как супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, а также ряд эндогенных антиоксидантов (альбумин, глутатион, пируват, витамины Е и С) (Donnelly Е.Т., Mcclure N., Lewis Sh. E. M., 2000). Защитные способности семенной плазмы имеют значительные индивидуальные колебания (Kovalski N., de Lamirande Е., Gagnon С., 1992; Zalata A., Hafez Т., Mahmoud A. et al., 1995).
Наблюдается корреляция между производством АФК и антиоксидантной способностью спермоплазмы и сочетанием данных показателей с МБ (Sharma
9 R.K., Pasqualbtto F.F., Nelson;DR. et ah, 1999). Можно предположить, что; для;
нормального функционирования сперматозоидов необходимо соблюдение
тонкого равновесия между продукцией АФК и системой, обеспечивающей их
разрушение (De Lamirande Е., Jiang Н;, Zihi-A. et al.,1997; Park N.C., Park H:J;,
Lee K.M^, Shin D.G., 2003).
При идиопатическом бесплодии применялосьи продолжает применяться
множество способов медикаментозного лечения,, не имеющих рациональных
патофизиологических предпосылок. Фармакотерапия идиопатического;
бесплодия у мужчин^ к сожалению; не; дает обнадеживающих результатов
(Андрология, 2005); Несмотря на успехи искусственного оплодотворения,
большинство шациентов заинтересовано вэтиотропной терапии своего недуга;
Потребность в; медикаментозном лечении связана» и с тем, что? оно обходится
гораздо дешевле, чем; искусственное оплодотворение. Расшифровка
соответствующих патогенетических механизмов; МБ: и- в конечном: итоге;
выработка; рациональной;, терапии1 - одна из; наиболее актуальных задач
современной медицины.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ\ .
Определить особенности патогенеза идиопатической патозооспермии и их взаимосвязь с процессами свободнорадикального окисления в условиях экзогенных воздействий токсических факторов.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Определить частоту встречаемости патоспермии в структуре бесплодного брака на территории Республики Башкортостан;
С учетом особенностей1 экологической обстановки в регионе оценить влияние техногенной нагрузки и уровня репротоксикантов в биологических жидкостях на развитие патоспермии.
3. Изучить процессы свободнорадикального окисления в сперме мужчин,
состоящих в бесплодном браке.
Сравнить активность процессов свободнорадикального окисления и содержание репротоксикантов класса диоксинов и диоксиноподобных соединений в сперме инфертильных мужчин.
Изучить связи между развитием патоспермии и уровнем свободнорадикального окисления в гонадах и сперме лабораторных животных при хроническом воздействии репротоксикантов класса полихлорированных бифенилов (совтол).
В эксперименте на животных оценить возможность использования природных антиоксидантов для предупреждения развития патоспермии, вызванной" нарушением свободнорадикального окисления в репродуктивных органах.
Определить влияние криоконсервации, применяемой для создания банка половых клеток, на процессы свободнорадикального окисления в сперме животных.
На основе полученных данных разработать комплекс диагностических и организационно-профилактических мероприятий для внедрения в практическое здравоохранение с целью охраны мужского репродуктивного здоровья.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Выявлены особенности этиологии и патогенеза мужской инфертильности при идиопатических формах бесплодия. Установлено, что при мужской инфертильности, развившейся на фоне действия стойких органических загрязнителей, происходит снижение антиокислительной активности спермоплазмы при незначительном увеличении генерации активных форм кислорода морфологически или функционально неполноценными сперматозоидами.
Определено содержание диоксинов и диоксиноподобных соединений' в^ пересчете на токсические эквиваленты (ТЭ/TEQ ВОЗ) в суммарных пробах спермы мужчин, проживающих в индустриальных городах Республики Башкортостан. Выявлена прямая зависимость между содержанием диоксинов и диоксиноподобных соединений' В' сперме и развитием патозооспермии. На экспериментальных моделях выявлено-влияние репротоксикантов класса ПХБ на, сперматогенез и предложена схема развития патологического процесса. Впервые* изучены процессы свободнорадикального- окисления при криоконсервации* спермы. Определены новые подходы к патогенетическому лечению-мужского бесплодия-с учетом роли свободнорадикального окисления, заключающиеся в> проведении рациональной- антиоксидантной терапии; коррекции интенсивности генерации* активных форм* кислорода. В*' эксперименте на животныхобосновано применение лечебных мероприятий, при* нарушении фертильности-в условиях хронического оксидантного стресса.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Разработаны критерии для выделения групп повышенного риска по-развитию мужской инфертильности. В результате проведенных исследований внедрен в практику экспресс-метод оценки состояния свободнорадикального окисления в эякуляте, заключающийся в определении интегральных показателей суммарной антиокислительной активности спермоплазмы в модельной системе, генерирующей активные формы кислорода, и спонтанного люминолзависимого свечения эякулята.
Разработаны, патогенетически обоснованные показания к применению антиоксидантной терапии мужского бесплодиях учетом причин, приведших к развитию і патоспермии. Результаты проведенных исследований по уровню патоспермии в регионах Республики Башкортостан способны оказать содействие практическому здравоохранению в планировании медицинской' помощи по охране репродуктивного здоровья мужчин.
12 АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Материалы диссертации доложены на всероссийской конференции «Научные аспекты экологических проблем России» (Санкт-Петербург, 2001r.),VII и VIII конференциях Российской ассоциации репродукции человека (Саратов, 2001г.; Екатеринбург, 2002г.), международном к конгрессе «Новые медицинские технологии», г. Санкт-Петербург, 2001г., секционном заседании «Репродуктивное здоровье мужского населения РБ» съезда врачей акушеров-гинекологов и педиатров Республики Башкортостан, г.Уфа, 2001г., I Всероссийской научной конференции с международным участием «Влияние загрязнения окружающей среды на здоровье человека» (Новосибирск, 2002г.), XII Международной конференции «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Санкт-Петербург, 2003г.), I, II, III и IV Российских научных форумах «Мужское здоровье и долголетие» (Москва, 2003-2006гг.), заседании общества урологов Республики Башкортостан (Уфа, 2004-2005гг.), научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», г. Смоленск, 2005г., II конгрессе Профессиональной Ассоциации андрологов России (Сочи, 2006г.).
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ Экспресс-метод оценки состояния свободнорадикального окисления в эякуляте внедрен в практику Республиканской клинической больницы им. Г.Г.Куватова. Разработанный метод используется для диагностики и определения тактики лечения мужского бесплодия в Республиканской клинической больнице им. Г.Г.Куватова и Республиканском перинатальном центре. Материалы, полученные в диссертации, введены в учебную программу и включены в курс лекций для студентов и курсантов института последипломного образования Башкирского государственного медицинского университета. Результаты исследования послужили основой экспертных материалов для разработки Закона Республики Башкортостан «О внесении
13 изменений Bi Закон Республики Башкортостан «Об охране семьи, материнства,
отцовства и-детства в Республике Башкортостан».
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
Частота патоспермии в структуре бесплодного- брака на территории Республики Башкортостан составляет 70,25%.
В структуре мужского бесплодия идиопатические формы встречаются с частотой- 45,3%.
Хемилюминесцентные методьь исследования позволяют выявить нарушения равновесия между продукцией активных форм кислорода и системой антиокислительной!защиты в сперме мужчин.
При идиопатической форме1 патозооспермии в регионах с повышенным риском- экзогенного воздействия токсических факторов наблюдается уменьшение защитных свойств спермоплазмы, в виде снижения уровня суммарной антиокислительнойї активности наряду с повышением образования < АФК морфологически-или .функционально неполноценными сперматозоидами:
5..Содержание диоксинов и диоксиноподобных соединений В'пересчете на токсические эквиваленты (ТЭ/TEQ ВОЗ) в суммарных пробах спермы мужчин, проживающих в индустриальных* городах Республики Башкортостан; превышает соответствующие уровни в крови у тех же мужчин.
Одним из механизмов, приводящих к развитию патоспермии при действии стойких органических загрязнителей, является нарушение процессов свободнорадикального окисления. Данные изменения проявляются в виде снижения уровня суммарной антиокислительной активности в тестикулярной ткани, что приводит к ранней активации и незрелости сперматозоидов, и, как следствие, морфологическим изменениям половых клеток и снижению их функциональных характеристик.
Выявление патогенетических' механизмов бесплодия, связанных с нарушением равновесия процессов свободнорадикального окисления, в сперме и приведших к развитию идиопатической- патозооспермии, позволяет
14 обосновать тактику лечения, направленную на коррекцию патологического
процесса.
ПУБЛИКАЦИИ
По теме диссертации опубликовано 45 печатных работ, получено 2 Патента РФ на изобретения.
ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ
Работа изложена на 247 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами, 42 рисунками. В библиографический указатель включено 499 источников литературы, из которых 178 - отечественных и 321 - зарубежных.
Медико-социальные аспекты бесплодного брака
Репродукция является одной из важнейших жизненно важных функций живых существ, в том числе и человека. В жизненные планы большинства людей входит намерение иметь детей. Наиболее высокая фертильность у мужчин отмечается в 35 лет, затем она быстро снижается, хотя отцовство остается возможным и после 70 лет. Половые клетки у мужчин, также как у женщин, подвергаются старению, но происходит это медленнее (Bedford J.M., 1970; Stene J., Stene E., Stengel-Rutkowski S., Murken J .D.,1977). В норме у здоровой пары (мужчина до 30 лет, женщина до 27 лет) беременность наступает в течение первых 3 месяцев незащищенной регулярной половой жизни (Spira, 1986; Hull M.G., 1992). В последующих циклах вероятность спонтанной беременности постепенно, уменьшается и после 12 месяцев колеблется между 0,75% и 3,97% для каждого цикла (Crosignani P.G., Walters Р.Е., Soliani А., 1991). Когда усилия тех, кто мечтает о детях, оказываются безуспешными, ими овладевает разочарование, отчаяние и чувство беспомощности (Jones H.W., Toner J.P., 1993).
Из всех болезней в Библии первым упомянуто бесплодие. Бесплодным называется брак, в котором отсутствует беременность в течение 12 месяцев половой жизни без предохранения (определение ВОЗ). Бесплодный брак остается одной из актуальных проблем в андрологической и акушерско-гинекологической практике с высокой частотой нарушений репродуктивной функции для обоих супругов. Бесплодием страдают мужчины и женщины во всем мире. Сведения о распространенности бесплодия крайне противоречивы, и лишь немногие из них заслуживают полного доверия (Templeton А., 1992; Schmidt L., Munster К., 1995). Оценка распространенности данного состояния в настоящее время неточна, установление истинного числа бесплодных браков встречает серьезные методические трудности (Коновалов О.Е., 1990). Считается, что от 8 до 15% супружеских пар в течение репродуктивного периода сталкиваются с данной проблемой (Джарбусынов Б.У., 1983; Селезнева И.Ю., 1999; Тиктинский О.Л., Михайличенко В.В., 1999; Экстракорпоральное оплодотворение и его новые направления в лечении женского и мужского бесплодия (теоретические и практические подходы), 2000; Практическая гинекология (клинические лекции), 2001). При расчете на общую популяцию это значит, что в мире насчитывается более 100 млн. супружеских пар, для которых проблема бесплодия является причиной личных страданий и влечет за собой распад семьи (Felberbaum R., Diedrich К., 1998). В Европе этот показатель различен и обнаруживает значительные региональные колебания (Comhaire F.H ., Dhooge W., Mahmoud A., Depuydt С, 1999; Juul S., Karmaus W., Olsen J., 1999). Так, примерная распространенность бесплодия в Германии превышает 15% всех пар репродуктивного возраста (Bruckert, 1991; Juul S ., Karmaus W., Olsen J., 1999), а уровень,бесплодияш Швеции составляет до 9%. (Hoegberg W., Akerman Sane, 1990).
Проблема бесплодия с каждым годом приобретает все большую не только медицинскую, но и социальную значимость, особенно в демографическом плане. Бесплодие оказывает негативное влияние на воспроизводство населения. По некоторым прогнозам к 2050 году россиян останется- 90 млн. вместо 143 млн. сегодня (Рыжаков Д.И., 2003). Гипотетически, при условии ликвидации бесплодия и реализации бесплодными парами желаемого числа детей в семье, можно ожидать увеличения рождаемости на 10% (Коновалов О.Е., 1990). Бесплодие является уникальным заболеванием, поскольку касается не одного человека, а пары, и, несмотря на отсутствие физических страданий, способно сделать мужчину и женщину глубоко несчастными людьми. Социальное значение проблемы, связанной с отсутствием детей в браке, трудно переоценить ввиду ее многообразия, включающего в себя неустойчивость семейных отношений, возникновение комплексов неполноценности у супругов, снижение их социальной активности (Пшеничникова Т.Я., 1988; Леонов Б.В., 1991; Прибыш И.А., 2001). Психологический аспект данной проблемы выражается и в личных душевных переживаниях, и семейных конфликтах, внебрачных связях и алкоголизме среди супругов, состоящих в бесплодном браке (Николов Н., Папазов Бр.,1971; Кон И.С. 1988; Колчин А.В., 1995). По-видимому, существует повышенная супружеская мобильность, связанная с бесплодием в браке, которая приводит к распаду брачных союзов до истечения 2-х лет супружеской жизни. (Коновалов О.Е., 1987; WHO Scientific Group., 1976). Среди бездетных пар показатели разводимости на 2-4 годах брака в 2,1-4,2 раза выше, чем среди супругов, имеющих детей (Коновалов О.Е., 1990). По некоторым данным до 70% бесплодных браков расторгаются, тогда как в семьях с детьми число разводов составляет 8% (Николов Н., Папазов Бр., 1971). Реализация репродуктивной функции способствует психогенной и социальной адаптации ранее бездетной супружеской пары, укреплению семейных отношений (Назаренко Т.А., 1998).
МБ стало беспокоить человечество с момента становления моногамного брака. Особую актуальность этот вопрос приобрел в 20 веке. В первую очередь, из-за увеличения доли мужского фактора в бесплодии на фоне достигнутых успехов в лечении женской инфертильности. Как известно, в России вопросы здоровья будущих поколений традиционно рассматриваются в аспекте «охраны здоровья матери и ребенка». Репродуктивное здоровье мужчины часто остается вне поля зрения врачей и организаторов здравоохранения. А мужчина по сравнению с женщиной характеризуется в настоящее время более высокой заболеваемостью и смертностью. В среднем в мире продолжительность их жизни на 7 лет меньше, по сравнению с женщинами (Mathers С, Sadana R., Salomon J. et al., 2001). В России эта разница составляет более 10 лет. Уже во внутриутробном периоде мальчиков погибает больше, чем девочек. Хотя мальчиков рождается все-таки больше (104 - 108% в разных странах), к 50 годам соотношение мужчин и женщин равно 92:100, к 80 годам - 58:100 (Рыжаков Д.И., 2003).Смертность в работоспособном возрасте в России выше у мужчин, чем у женщин, почти в 5 раз (Государственный доклад "О состоянии здоровья населения в Российской Федерации в 2002 году", 2003).
Принципиальной биологической особенностью мужского организма являются более низкие компенсаторные возможности, нежели у женщин. В экстремальных ситуациях организм мужчин менее приспособлен к резким колебаниям состояния внешней среды в целом, кроме того, для большинства ксенобиотиков было показано, что индуцируемая реактивность ферментативных систем их детоксикации у мужчин выражена значительно слабее, чем у женщин (Sierra-Santoyo A ., Hernandez М ., Albores A ., Cebrian М.Е., 2000). Иными словами, адаптивные возможности мужского организма сравнительно невелики и истощаются быстрее. Большинство авторов связывают ухудшение показателей репродуктивного здоровья мужчин с антропогенным загрязнением окружающей среды (Никитин А.И., 2005).
Прослеживается отчетливая тенденция к снижению концентрации сперматозоидов (Carlsen Е., Giwermann A., Keiding N. et al., 1992; Carlsen E., Giwermann A., Skakkabaek N.E. et al., 1993; Keiding N., Giwermann A., Carlsen E. et al., 1994; Comhaire F., Van Waeleghem K., De Clercq N. et al., 1996; Glockner D., Gaevert K., Kleinstein J., 1998). Это явление, по всей вероятности, служит отражением возрастающего воздействия на организм человека повреждающих факторов, встречающихся в окружающей среде, на производстве и в быту (Быков В.Л., 2000). Авторами высказывается предположение, что параметры семенной жидкости человека являются ценными показателями токсического влияния профессиональных и экологических факторов (Purvis К., Christiansen Е., 1992; Lamb J.C., Chapin R.E., 1993; Lahdetie J., 1995).
Исследование процессов свободнорадикального окисления до и после криоконсервации спермы
Исследование процессов СРО до и после криоконсервации спермы было проведено на материале, полученном от 8 племенных быков производителей
Уфимского племенного хозяйства. С целью изучения интенсивности свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности проводился хемилюминесцентный анализ сперматозоидов быков до и после криоконсервации. Исследовали люминолзависимую и Ре2+-индуцированную хемилюминесценцию по Владимирову (1989). Для регистрации ЛЗХЛ в светоизолированную камеру прибора помещали сосуд с 2 мл физиологического раствора, содержащего люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) в конечной концентрации 10 "7 М. Далее добавляли образцы сперматозоидов до и после заморозки в объеме 0,1 мл, тщательно перемешивали и вели запись ХЛ при 37С в течение 10 мин. Fe индуцированную- ХЛ оценивали в системе, содержащей 20 мл К-фосфатного буфера, рН 7,45 и 0,1 мл взвеси сперматозоидов. После 5-минутной стабилизации температуры до 20С при постоянном перемешивании инициировали свечение впрыскиванием раствора сульфата железа, конечная концентрация которого составляла 2,5 мМ и вели запись ХЛ в течение 5 мин: Криоконсервирование эякулята племенных быков включало в себя подготовку к замораживанию, собственно замораживание и хранение материала. Успешным результатом замораживания и размораживания является сохранение как структурной целостности клетки, так и ее функциональных характеристик. Поддержание осмолярности является решающим звеном для успешного процесса и очень важно избежать повреждения клеток, которое возможно при формировании льдинок во внутриклеточной жидкости. Поэтому, клетки перед охлаждением и во время процедуры охлаждения дегидратируют. Криоконсервация требует охлаждения спермы до - 198С (температура испарения азота). Для защиты клеток от повреждающего действия кристаллов воды, перед замораживанием в образцы эякулята добавляется криопротектор. Все методики замораживания развиваются сегодня в сторону присутствия одного или большего количества криопротекторов. Основной механизм действия криопротекторов - образование комплексов. Они связывают воду и уменьшают токсические эффекты от высоких концентраций других компонентов. К тому же, они защищают клетки в течение медленного охлаждения, когда клетки сильно дегидрированы и окружены концентрированными солями. При высоких концентрациях криопротекторы минимизируют риск, вызываемый формированием внутриклеточного льда, поскольку они мешают воде образовывать кристаллы льда. Криопротектор проникает в клетку с помощью осмоса. Клетки в растворе криопротектора становятся сморщенными, так как вода быстро выходит из клеток, чтобы разбавить высокие концентрации веществ во внеклеточной жидкости. Поскольку равновесие может быстро восстановиться, клетки могут возвратиться к первоначальным размерам. В качестве криопротектора-использовался состав, содержащий: лактозу рафинированную - 11,5 г.; желток куриных яиц - 20,0 мл; глицерин - 5,0 мл; полиген 25,0 тыс.ед. ; воду бидистиллированную - 100,0 мл. - «полиген» - комплексный санирующий препарат, в состав которого входят антибиотики: полимиксина М сульфат и гентамицина сульфат. Препарат применяется для санации спермы и эмбрионов сельскохозяйственных животных. Подготовка к замораживанию состояла из следующих этапов: 1. семенная жидкость для разжижения оставлялась на 30 минут при комнатной температуре; 2. смешивание спермы с криопротектором для получения стандартной концентрации, половых клеток проводилось после предварительной оценки-семенной жидкости с учетом параметров, рекомендованных в табл. 5. Криопротектор добавлялся по каплям при осторожном помешивании. 3. полученная смесь на 10 мин. оставлялась при комнатной температуре для установления равномерного распределения клеток; 4. сперма засасывалась в соломинки по 0,25мл., при этом в конце соломинки оставалось приблизительно 1,5 см воздуха для последующего замораживания; 5. соломинки помещались открытым концом в банку с герметизирующим порошком и сильно прижимались в области открытого конца несколько раз; 6. герметично закрытые соломинки держали за конец, покрытый порошком, под проточной водой; 7. пузырек воздуха передвигался к середине соломинки. Методика замораживания спермы: охлаждение производилось 10 мин при температуре +20С; затем 15 мин. при температуре +4С; в последующем 15 мин. при температуре -20С; далее соломинки погружались в жидкий азот. Замораживание проводилось в вертикальном состоянии в течение 15 минут, чуть выше уровня жидкого азота. Хранились соломинки в жидком азоте в течение месяца. Размораживание производилось непосредственно перед проведением исследования по следующей методике: 1. вынимали необходимое количество соломинок из жидкого азота; 2. помещали соломинки под проточную воду (t 23 С) на 5 минут.
Сопоставление полученных данных с уровнем загрязненности территорий
Из множества действующих факторов очень нелегко количественно выделить влияние техногенного загрязнения. По данным экспертов ВОЗ, здоровье населения, или популяционное здоровье, в среднем на 50-52 % зависит от экономической обеспеченности и образа жизни людей, на 20-22 % от наследственных факторов, на 7-12 % - от уровня медицинского обслуживания и на 18-20 % от состояния окружающей среды. Существуют и другие оценки, в которых влиянию качества среды отводится уже 40-50 % причин заболеваний. На основании обработки большого статистического материала о потерях рабочего времени по болезням сделан вывод, что техногенное загрязнение воздуха на 43-45 % виновно в ухудшении здоровья населения (Государственный доклад «О состоянии окружающей природной среды Республики Башкортостан в 2004 году», 2005).
В отличие от острых отравлений техногенные патологии развиваются в результате хронического воздействия малых, субкритических и обычно несущественных доз техногенных загрязнителей. В большинстве случаев это так называемое «досимптомное» отравление. Сегодня еще неясно, существует ли и насколько велик его вклад во многие дефекты здоровья современных человеческих популяций.
Однако все чаще возникают ситуации, когда более или менее ясны симптомы специфических патологий, обусловленных хроническим действием малых концентраций техногенных поллютантов. Это действие тесно связано с переносом вредных веществ из внешней среды во внутреннюю среду организма с последующей более или менее длительной задержкой части этих веществ и их постепенным накоплением. В биосфере циркулирует огромное число ксенобиотиков техногенного происхождения, многие из которых имеют исключительно высокую токсичность. Условно они объединены общим названием суперэкотоксиканты. Из органических соединений это, прежде всего, полихлорированные диоксины, дибензофураны и бифенилы, хлор- и фосфорсодержащие пестициды, полиароматические углеводороды, нитрозамины и др., а из неорганических - ртуть, свинец, кадмий, радионуклиды. Суперэкотоксиканты могут накапливаться в живых организмах, передаваясь по трофическим цепочкам. Необходимо отметить также их природную стойкость и отсутствие предела токсичности. Суперэкотоксиканты в тех или иных концентрациях присутствуют во всех средах. Для них характерно еще одно свойство - высочайшая подвижность в биосфере. Как правило, суперэкотоксиканты присутствуют в окружающей среде в ничтожно малых количествах, на уровне следов. Суперэкотоксиканты могут оказывать мутагенные, тератогенные, канцерогенные действия, а также приводить к подавлению клеточного иммунитета, поражению внутренних органов и истощению организма (Юфит С.С, 2001). В конце 80-х годов прошлого века Башкортостан входил в пятерку регионов России, лидирующих по выбросам загрязняющих веществ в атмосферу и в десятку - по сбросам загрязненных стоков. Сегодня республика по выбросам в атмосферу и сбросам загрязняющих веществ находится во втором десятке среди субъектов Федерации. Все районы РБ были условно разделены на относительно «благополучные» (с удельным выбросом загрязняющих веществ, приходящимся на единицу площади от 0 до 2000 кг/га (удовлет.), 2000-4000 (напряжен.)), и на относительно «неблагополучные» (где аналогичный показатель колеблется в диапазоне 4000-8000 кг/га (критич.), 6000-8000 кг/га (экологич. чрезвычайная ситуация), 8000 и более кг/га (эколог, бедствие)): Параметры приведены из Государственного доклада «О состоянии окружающей природной среды Республики Башкортостан в 2000 году», в последующих ежегодных докладах (2001-2004гг.) эти данные не анализировались. На рис. 8 приведена административная карта РБ с распределением всех районов на 5 вышеуказанных групп. В табл. 13 представлены данные об удельном выбросе загрязняющих веществ, приходящемся на единицу площади, по районам РБ наряду с уровнем патозооспермии. Большинство районов РБ относится к относительно «благополучной» зоне - 35 районов (64,8%). По данным многих авторов обследование различных групп населения в регионах, подверженных и не подверженных воздействию токсинов и веществ, загрязняющих окружающую среду, выявило стойкую тенденцию к снижению концентрации сперматозоидов (Aitken R., Sawyer D., 2003). Результаты настоящего исследования не подтверждают этой тенденции, причем ни по уровню отдельных параметров спермограммы (данные представлены в табл. 11), ни по уровню суммарной патозооспермии (параметрическая корреляция Пирсона). Масса загрязняющих веществ, приходящаяся на единицу площади, в районах РБ не связана обратной зависимостью ни с уровнем патозооспермии (R = - 0,0283, р = 0,84), ни с уровнем астенозооспермии (R = - 0,0559, р = 0,69), ни с уровнем олигозооспермии (R = 0,2699, р = 0,05), ни с уровнем тератозооспермии (R = 0,0329, р = 0,81). Парадоксально, но самые высокие показатели патологии отмечены в относительно «благополучных» районах (по суммарной патоспермии «лидирует» Илишевский район.
Оценка влияния хронической интоксикации на сперматогенез и процессы свободнорадикального окисления
В настоящее время общепринятой является гипотеза5 об экологической обусловленности нарушения репродуктивных; возможностей: мужчин (Фёдоров Л.А., Яблоков А.В:, 1999; Dougherty R.C., Whitaker-MiJ:, Tang S,Y. et al . 1980). В пользу этой точки зрения; свидетельствуют, в частности, данные о том, что падение концентрации сперматозоидов = имеет место преимущественно у мужчин; промышл енно развитых стран Европы, и Америки и: менее характерно для мужчин Азии и, Африкиї 06 ЗТОМІ же свидетельствует анализ результатов-исследования» сперматогеннош функции по разным регионам. Наиболее: выраженными они; были? у мужчищ проживавших ві промышленно развитых: районах. Вітоще времяш регионах,.где отсутствовала-крупная промышленность и химическое: производство; ухудшений, показателей спермограммы; не выявлялось или:они; были выражены, в.слабош степени. Последнее, однако; не касается- сельскохозяйственных районов; с интенсивным использованием пестицидов. Здесь прослежена-связь между содержанием пестицидов в почве и биологических жидкостях человека, с одной стороны, и ухудшением показателей спермограммы - с другой. Однако в равной мере остается недоказанным как влияние этого фактора на частоту мужского? бесплодия, так и его непосредственная связь с состоянием окружающей среды;
В конце 80-х годов прошлого века Башкортостан входил в пятерку регионов России, лидирующих по выбросам загрязняющих веществ в атмосферу и в десятку - по сбросам загрязненных стоков; Сегодня республика по выбросам в» атмосферу и сбросам; загрязняющих веществ находится во втором десятке среди субъектов федерации.
Изложенные соображения легли в основу настоящего исследования, целью которого явилось изучить, влияние процессов- свободнорадикального окисления? на формирование: мужской. инфертильности в условиях экзогенных воздействий Для решения поставленных.задач на первом; этапе исследованияв-течение 4 лет проводилось, изучение; параметров семенной-, жидкости жителей Башкортостана, состоящих в бесплодном: браке.
В- проведенном: исследовании, при анализе семенной; жидкости 4000; мужчину состоящих, в- бесплодном браке, во-первых, отмечается; достоверное: возрастание числа сперматозоидов к 2004 году (по сравнению: с 2002-2003гг.);. а, во-вторых, средние; значения количества половых клеток, у наблюдавшихся» пациентов не ниже нормативных данных, по= В031. Доля морфологически полноценныхформ была.либо/на нижней границе нормы по ВОЗj либо ниже; этой границы. Возрастание концентрации»: клеток; у обследованных пациентов;; предположительно, можно; объяснить, проведением лечебных- мероприятий; направленных на повышение: фертильностш.Вї то же время; увеличение , концентрации может быть просто артефактом; либо данное явление произошло! . за; счет изменения структуры обращаемости? по» поводу бесплодия:.Хочется» подчеркнуть факт неизменной? морфологии клеток, то есть, увеличение концентрации; сперматозоидов не приводит к повышению- числа морфологически шолноценныхклеток.
Параметры подвижности сперматозоидов; претерпевали статистически достоверные изменения по всем категориям, но определенной тенденции к. улучшению или ухудшению, мобильных свойств сперматозоидовіпожакрй-либо конкретной категории подвижности отмечено не было. Проанализировав, же суммарные данные по категориям «А» и «В»,, было отмечено значимое уменьшением обильных свойств сперматозоидов, начиная с 2003 года, хотя, среднее значение подвижности «А»+«В» даже за 2002 год. заметно; ниже нормативных значений (42,1%) Это, произошло- за счет уменьшения фракции «В» (сперматозоиды; с медленной? линейной и нелинейной; прогрессивной; подвижностью): Таким образом;, анализ параметров» семенной- жидкости- у мужчин с бесплодием за 4 года в районах РБ показал значимое увеличение концентрации сперматозоидов при ухудшении подвижности.
В последние годы отмечается снижение качества репродуктивного здоровья мужчин. Это проявляется уменьшением объема эякулята, концентрации сперматозоидов, доли подвижных сперматозоидов. Снижение сперматогенной функции, по всей вероятности, служит отражением возрастающего воздействия на организм человека повреждающих факторов, встречающихся в окружающей среде, на производстве и в быту. Теоретически химические вещества могут повреждать сперматогенез на любой стадии от пролиферирующих сперматогониев до зрелых сперматозоидов. В общем-то, токсические эффекты, могут приводить к летальному и сублетальному повреждению клеток или к изменению их генетического аппарата (что не обязательно исключает друг друга). Летально поврежденные клетки погибают внутри эпителиального" слоя, либо в просвете семенных канальцев. Гибель, клеток на» месте происходит путем некроза (неконтролируемого лизиса и неспецифического выхода клеточного содержимого наружу) или апоптоза (физиологического процесса 1 запрограммированной клеточной смерти с распадом обреченной клетки на мелкие апоптотические тельца, которые затем фагоцитируются клетками Сертоли).
По данным, представленным в итоговых документах Встречи на высшем уровне в рамках Конференции ООН по окружающей среде и развитию глав государств и правительств 179 стран мира в Рио-де-Жанейро (1992), в период с 1960 по 1990 гг. величина коэффициента фертильности снизилась примерно в 1,5 раза, причем это явление оказалось в равной мере характерным и для промышленного Севера, и для менее развитого Юга (Программа действий. Встреча на высшем уровне «Планета Земля», 1993).
Наиболее впечатляют результаты исследований, посвященных изучению мужской генеративной функции. Сводный анализ спермограмм 14947 пациентов по данным 61 публикации с 1938 по 1991 гг. выявил уменьшение объема эякулята с 3,4 мл в 1940 г. до 2,75 мл в 1990 г. и концентрации гамет со млн/мл до 66 млн/мл (Carlsen Е., Giwercman A., Keiding N. et al., 1992). Обзор обследований качества спермы 1351 здорового донора, выполненных во Франции по единой методике, показал прогрессирующее снижение содержания сперматозоидов с 89 млн/мл в 1973 г. до 60 млн/мл в 1992 г. (в среднем на 2 % в год) (Auger J., Kunstmann J., Czyglik F. et al., 1995). У 5149 мужчин из бездетных пар в Германии за период 1974-1994 гг. концентрация сперматозоидов снизилась с 48 млн до 25 млн/мл, а количество подвижных клеток упало с 38 до 21 % (Glockner D., Gaevert К., 1998). Другой важнейший параметр, отражающий детородную способность мужчин - содержание андрогенов. По литературным сведениям и этот показатель за последние годы обнаруживает отчетливую тенденцию к снижению (Тер-Аванесов Г.В., Овсянникова Т.В., Кулаков В.И., 1997).
