Введение к работе
Актуальность проблемы
Иммуновоспалительные заболевания представляют собой группу заболеваний, характеризующихся глубокими нарушениями иммунного гомеостаза, выражающимися в развитии иммунорегуляторного дисбаланса, угнетении супрессорной и увеличении хелперной активности Т-лимфоцитов, активации В-лимфоцитов, гиперпродукции антител самой различной специфичности и образовании иммунных комплексов. Все заболевания, входящие в эту группу, имеют ряд общих черт, таких как неизвестность этиологии, общность патогенеза, сходство морфологических проявлений, многосистемный характер поражения, хроническое течение с периодами обострения и ремиссии, обострение под влиянием неспецифических воздействий (инфекция, инсоляция, вакцинация и др.), лечебный эффект иммуносупрессивных средств (глюкокортикостероиды, цитостатические иммунодепрессанты). Прогноз при заболеваниях данной группы всегда серьезный, а известные варианты терапии не всегда эффективны. В связи с этим продолжаются поиски наиболее оптимальных схем диагностики и лечения заболеваний, а также уточнение факторов риска неблагоприятного течения заболеваний и возможности их коррекции [Быковская С.Н., 2005; Караулов А.В., 1999; Короткова И.Ю., 2007; Мазуров В.И., 2001, 2005; Тареева И.ЕП., 2000].
С этой точки зрения большой интерес представляет изучение активности апоптоза иммунокомпетентных клеток - механизма, который организм использует для освобождения от чужеродных клеток, клеток с дефектным генетическим аппаратом, аутоагрессивных лимфоцитов, “отработавших” клеток иммунной системы - и возможности использования для оптимизации диагностики, лечения и оценки прогноза при иммуновоспалительных заболеваниях [Белушкина Н.Н., 1998; Бережков Н.В., 1990; Григорьев М.Ю., 2003; Залесский В.Н. и др., 2001; Коршунов А.М. и др., 1998; Кухта В.Е. и др., 2004].
Внимание к апоптозу как возможному механизму развития и поддержания патологического процесса при ревматоидном артрите обусловлено современными представлениями о патофизиологии и патоморфологии заболевания. При данном заболевании выявлена более низкая апоптотическая активность синовиальных фибробластов и макрофагов, с чем связана характерная пролиферация синовиальной ткани и развитие паннуса [Богданов А.Н. и др., 2005, 2006; Duffy T. et al., 2001; Emery. P. et al., 1997; Itoh K. et al., 2004; Panayi, G.S. et al., 2001; Ponchel F. et al., 2002; Slot O. et al., 2002].
Гораздо меньшее количество работ посвящено изучению активности апоптоза иммунокомпетентных клеток, в том числе, лимфоцитов, как синовиальных, так и циркулирующих, и факторов, модулирующих их апоптотическую активность (Багринцева К.М. и др., 1998: Веникова М.С., 1984; Волкова Т.О. и др., 2004]. Имеющиеся данные отражают главным образом иммунологические характеристики программированной клеточной гибели in vitro без учета активности, течения заболевания и проводимой терапии.
В настоящее время фактор некроза опухоли , являющийся одним из основных участников патогенеза иммуновоспалительных заболеваний, в частности, ревматоидного артрита, рассматривается и как регулятор апоптоза с разнонаправленными эффектами от апоптотической гибели до стимуляции клеточной пролиферации и дифференцировки, при этом результат воздействия фактора некроза опухоли на клетку зависит от типа рецептора и внутриклеточных механизмов реализации сигнала. Также выявлено отрицательное влияние интерлейкина 6 на активность апоптоза синовиальных фибробластов [Ярилин А.А., 1996: Duffy T. et al., 2001; Panayi G.S. et al., 2001].
Данные об активности апоптоза при системной красной волчанке противоречивы [Григорьев М.Ю., 2003; Гусева Н.Г., 2004; Graninger W.B. et al., 2000; Rosen A. et al., 1999; Salmon M. et al., 1999]. С одной стороны, системная красная волчанка отнесена к заболеваниям с угнетенным апоптозом, так как при данном заболевании усилена выработка растворимого Fas-рецептора, а также выявлено, что для включения активационного апоптоза необходимо на 2 порядка больше клеток-индукторов. Однако, прямые нарушения экспрессии Fas-рецептора и Bcl-2 не обнаруживаются и in vitrо регистрируется усиление апоптоза лимфоцитов.
Большой интерес представляют данные о роли апоптоза в развитии различного рода нефропатий, прогрессирование которых характеризуется клеточной пролиферацией с накоплением внеклеточного матрикса и последующим сморщиванием ткани [Белушкина Н.Н. и др., 1998; Бережков Н.В., 1990; Григорьев М.Ю. и др., 2003; Коршунов А.М. и др., 1998; Кухта В.Е. и др., 2004; Перевезенцева Ю.Б., 2001; Цаликова Ф.Д. 1999; Ярилин А.А. 1996, 1998; Thompson C.B, 1995]. Известно также, что циклоспорин и глюкокортикостероиды вызывают апоптоз так называемых митоген-активируемых мононуклеаров, причем, эта способность коррелирует с их иммунодепрессивной активностью [Перевезенцева Ю.Б., 2001; Цаликова Ф.Д. 1999].
Изучение механизмов регуляции различных этапов апоптоза позволяет определенным образом воздействовать на его отдельные этапы с целью их регуляции или коррекции. Через индукцию апоптоза осуществляется действие большинства цитотоксических химиопрепаратов, антиметаболитов нуклеиновых кислот, ингибиторов топоизомераз, и результатом воздействия этих препаратов является включение в клетках опухоли программы апоптоза. Дальнейшее повышение эффективности терапии заболеваний, в частности иммуносупрессивной терапии, связано с более детальным изучением ее биологических основ [Астрелина, Т.А. и др., 2002; Владимирская Е.Б., 2001, 2002; Волкова Т.О. и др., 2004, 2006].
В связи с этим представляет интерес вопрос влияния иммуносупрессивной терапии на активность апоптоза лимфоцитов и зависимость эффективности иммуносупрессивной терапии от исходной активности апоптоза лимфоцитов. Не исключается возможность прогнозирования эффективности цитостатических средств на основании результатов изучения программированной клеточной гибели. Более активное исследование влияния иммуносупрессивных препаратов на апоптоз поможет объяснить различную чувствительность пациентов к имеющимся лекарственным средствам [Каратеев Д.Е., 2003; Тареева И.Е., 2000; Робинсон М.В. и др., 1991].
Цель исследования
Изучить активность апоптоза периферических лимфоцитов и его влияние на течение, эффективность терапии с клинико-экспериментальной оценкой и прогноз при заболеваниях иммуновоспалительного генеза - ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.
Задачи исследования
-
Изучить активность апоптоза периферических лимфоцитов при различных иммуновоспалительных заболеваниях - ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.
-
Провести сравнительный анализ активности апоптоза периферических лимфоцитов при различных иммуновоспалительных заболеваниях.
-
Выявить корреляционные связи между активностью апоптоза лимфоцитов и активностью основных цитокинов (интерлейкина 2, интерлейкина 6, фактора некроза опухоли ) при иммуновоспалительных заболеваниях.
-
Изучить in vitro влияние иммуносупрессивных препаратов (метилпреднизолона, метотрексата, циклофосфамида) на активность апоптоза циркулирующих лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.
-
Изучить динамику активности апоптоза периферических лимфоцитов на фоне иммуносупрессивной терапии ревматоидного артрита, системной красной волчанки, хронического гломерулонефрита.
-
Определить прогностическую значимость исходной активности апоптоза циркулирующих лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.
-
Определить факторы риска неэффективности иммуносупрессивной терапии при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите, а также факторы риска развития люпус-нефрита у больных системной красной волчанкой.
-
Разработать принципы выбора варианта иммуносупрессивной терапии в зависимости от исходной активности апоптоза циркулирующих лимфоцитов.
Научная новизна исследования
В ходе исследования изучена активность апоптоза лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке и хроническом гломерулонефрите. Проведен сравнительный анализ активности апоптоза лимфоцитов при данных заболеваниях, различающихся патогенетическими механизмами, распространенностью и преимущественной локализацией патологического процесса, выявлены различия в интенсивности апоптоза при этих заболеваниях.
Впервые методом флуоресценции определена активность каспаз и степень реализации программированной клеточной гибели в виде разрывов ДНК при иммуновоспалительных заболеваниях со сравнительной оценкой показателей при различных стадиях, длительности течения и активности заболевания, наличия функциональной недостаточности. Обнаружена связь нарушений апоптоза периферических лимфоцитов с активностью и длительностью течения заболеваний.
Изучена связь между активностью апоптоза лимфоцитов и активностью фактора некроза опухоли , интерлейкина 2, интерлейкина 6, которые имеют важное значение как в развитии и течении заболеваний, так и в осуществлении процессов программированной клеточной гибели.
Выявлена связь между активностью медь/цинк-зависимой супероксидидсмутазы, отражающей активность хронических воспалительных заболеваний и являющейся средством ранней диагностики нефропатии, и активностью апоптоза периферических лимфоцитов.
Изучено влияние наиболее широко используемых иммуносупрессивных препаратов – метилпреднизолона, метотрексата и циклофосфана – на активность апоптоза лимфоцитов in vitro, выявлено стимулирующее влияние этих иммуносупрессивных препаратов на процессы апоптоза лимфоцитов.
В работе впервые исследована динамика интенсивности программированной гибели периферических лимфоцитов на фоне проводимого лечения иммуносупрессивными препаратами в течение 2-5 лет, а при ревматоидном артрите и на фоне терапии современным биологическим агентом – инфликсимабом. Выявлено коррегирующее влияние эффективной базисной терапии в отношении ассоциированного с воспалительной активностью изменения активности реализации апоптоза.
Впервые оценена возможность использования показателей активности апоптоза периферических лимфоцитов в качестве прогностических факторов течения иммуновоспалительных заболеваний и эффективности лечения иммуносупрессивными препаратами.
Теоретическая и научно-практическая значимость работы
Полученные результаты позволяют оценить характер изменений активности апоптоза при заболеваниях иммуновоспалительного генеза - ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите. В ходе исследования выявлено, что количество разрывов ДНК и активность каспаз 8, 6, 4, определяемые в динамике методом флуоресценции как показатели интенсивности апоптоза, могут быть использованы в комплексе с традиционными клинико-лабораторными данными для оценки активности заболеваний и прогноза.
В работе показана способность базисных иммуносупрессивных препаратов индуцировать программированную гибель периферических лимфоцитов. Знание исходной активности апоптоза лимфоцитов позволяет решить вопрос о варианте иммуносупрессивной терапии, ее интенсивности, а исследование активности апоптоза периферических лимфоцитов в динамике может указать на необходимость коррекции проводимой терапии.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в практическую деятельность ГУЗ «Республиканская больница им. В.А. Баранова» (Республика Карелия, г. Петрозаводск). Материалы диссертации используются в учебном процессе для студентов и клинических ординаторов на кафедре госпитальной терапии медицинского факультета Петрозаводского государственного университета, а также при повышении квалификации врачей терапевтов и ревматологов Республики Карелия на факультете повышения квалификации медицинских работников Петрозаводского государственного университета.
Апробация результатов исследования
Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на Конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003), IV съезде ревматологов России (Казань 2005), второй, третьей, четвертой, пятой, шестой, седьмой Северо-западных конференциях по ревматологии (Петрозаводск, 2002; Псков, 2003; Великий Новгород, 2004; Санкт-Петербург, 2005; Петрозаводск, 2006; Вологда, 2007), Республиканских научно-практических конференциях терапевтов (Петрозаводск 2002, 2004, 2006, 2007).
Положения, выносимые на защиту
-
Активность апоптоза периферических лимфоцитов повышена при заболеваниях иммуновоспалительного генеза – ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.
-
Интенсивность апоптоза периферических лимфоцитов зависит от активности, давности, системности иммуновоспалительных заболеваний.
-
Интенсивность апоптоза периферических лимфоцитов коррелирует с активностью фактора некроза опухоли , интерлейкина 2, интерлейкина 6, медь/цинк-зависимой супероксиддисмутазы и отражает активность иммуновоспалительных заболеваний.
-
Метилпреднизолон, метотрексат и циклофосфан in vitro оказывают стимулирующее влияние на активность апоптоза периферических лимфоцитов.
-
Эффективная иммуносупрессивная терапия достоверно усиливает апоптоз периферических лимфоцитов при иммуновоспалительных заболеваниях.
-
Исходная активность апоптоза лимфоцитов может быть использована при выборе варианта терапии.
-
Исходная активность апоптоза лимфоцитов наряду с признаками высокой активности заболеваний может быть использована как прогностический фактор течения иммуновоспалительных заболеваний.
Публикации и поддержка исследований
По теме диссертации опубликована 41 печатная работа (из них 8 – в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК).
Диссертационная работа была выполнена в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы по мероприятию 1.9 «Проведение молодыми учеными научных исследований по приоритетным направлениям науки, высоких технологий и образования» («Развитие инфраструктуры» IV очередь – Молодые ученые), гос. контракт № 02.442.11.7392, шифр 2006-РИ-19.0/001/585 «Изучение активности апоптоза лимфоцитов при иммуновоспалительных заболеваниях на модели ревматоидного артрита, системной красной волчанки и хронического гломерулонефрита», поддержана грантом Президента Российской Федерации для молодых российских ученых и ведущих научных школ Российской Федерации на выполнение научных исследований № МК-1814.2004.7 «Изучение активности программированной клеточной гибели лимфоцитов в дебюте ревматоидного артрита, системной красной волчанки и хронического гломерулонефрита», Программой Росбразования «Университеты России» УР.11.01.009 «Роль программированной клеточной гибели лимфоцитов в патогенезе и лечении ревматоидного артрита».
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 343 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, шести глав собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 374 источника, из них 158 отечественных и 216 иностранных работ. Диссертация иллюстрирована 184 рисунками и 75 таблицами.
