Содержание к диссертации
Введение
CLASS ГЛАВА 1. Обзор литературы 1 CLASS 1
1.1. Радиочувствительность как показатель адаптированности организма к условиям среды 11
1.2. Феномен адаптивного ответа как клеточный ответ на действие малых доз облучения 17
1.3. Внеклеточная ДНК как фактор в реализации действия малых доз облучения 25
1.4. Цитологические методы исследования физиологического состояния организма человека 30
1.5. Метод лазерной корреляционной спектрометрии в исследовании физиологического состояния организма человека 35
CLASS ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 3 CLASS 8
2.1. Оценка цитогенетического статуса буккального эпителия с помощью теста ядерных аномалий 38
2.2. Постановка схемы адаптивного ответа на ФГА - стимулированных лимфоцитах периферической крови человека 41
2.2.1. Группа исследования 41
2.2.2. Постановка эксперимента по определению адаптивного ответа в исследуемой группе 43
2.3. Исследование субфракционного состава биологических жидкостей методом лазерной корреляционной спектроскопии 46
2.3.1. Исследование субфракционного состава рото-глоточных смывов методом лазерной корреляционной спектроскопии 51
2.3.2. Исследование субфракционного состава сыворотки крови методом лазерной корреляционной спектроскопии 52
2.3.3. Исследование субфракционного состава жидкостей полученных в результате культивирования клеток методом лазерной корреляционной спектроскопии 53
2.3.4. Исследование методом лазерной корреляционной спектроскопии влияния ферментов на изменение субфракционного состава жидкостей, полученных в результате культивирования клеток 53
2.4. Выделение фрагментов внДНК, определение их состава и размеров.. 54
2.4.1. Выделение внДНК фенольным методом 54
2.4.2. Определение концентрации внДНК 55
2.4.3. Выделение ДНК на колонках OMNIX 55
2.4.4. Электрофорез в 1% агарозном геле 56
2.5. Количественное определение у-интерферона,с помощью иммуноферментного набора Bender MedSystems 57
Глава 3. Определение клеточно-метаболических адаптивных реакций в группах детей при действии экологических факторов среды 59
Глава 4. Определение клеточно-метаболических адаптивных реакций группах условно здоровых, взрослых людей при действии экологических и техногенных факторов среды 68
4.1.. Изменения в частоте встречаемости и соотношении отдельных видов аномалий ядра буккального эпителия 68
4.2. Изменения в направлении метаболических процессов при массовых скрининговых обследованиях в условиях действия производственных факторов 69
ГЛАВА 5. Оценка клеточно-метаболических адаптивных реакций у военных летчиков при воздействии факторов полета 76
5.1. Проявление адаптивного ответа у летчиков в зависимости от факторов-полета 76
5.2. Влияние факторов полета на изменение в частоте встречаемости и соотношении отдельных видов аномалий ядра буккального эпителия 81
5.3. Изменения в субфракционном составе сыворотки крови при действии факторов полета 85
5.4. Изменения содержания гамма - интерферона в надосадочной жидкости, полученной при культивировании лимфоцитов крови летчиков, при постановке схемы радиоадаптивного ответа 91
ГЛАВА 6. Выделение и характеристика нуклеопротеинов, выделяющихся из лимфоцитов при постановке схемы радиоадаптивного ответа 97
6.1. Исследование содержания внеклеточной ДНК в культуральной жидкости лимфоцитов периферической крови человека с использованием фенольного способа выделения 100
6.2. Исследование формы внеклеточной ДНК в культуральной жидкости лимфоцитов периферической крови человека 102
Заключение
Выводы 116
Список литературы 117
- Радиочувствительность как показатель адаптированности организма к условиям среды
- Постановка схемы адаптивного ответа на ФГА - стимулированных лимфоцитах периферической крови человека
- Изменения в частоте встречаемости и соотношении отдельных видов аномалий ядра буккального эпителия
- Исследование содержания внеклеточной ДНК в культуральной жидкости лимфоцитов периферической крови человека с использованием фенольного способа выделения
Введение к работе
Актуальность темы. Здоровье организма обеспечивается разнообразными механизмами, которые реализуются на всех структурно - функциональных уровнях. В своей совокупности они определяются как саногенетиче-ские механизмы. Патологический процесс возникает и развивается лишь в том случае, если первичные саногенетические механизмы оказываются нарушенными и недостаточными для противостояния действию патогенных агентов. Но и сам патологический процесс вызывает активацию подавленных и возникновение новых саногенетических механизмов, обеспечивающих его ликвидацию (Т.Н. Крыжановский, 2003-2006). Активация адаптационных ресурсов является неотъемлемой частью развития состояния стресса, степень выраженности и скорость протекания которого засвистит от индивидуальных особенностей организма.
По существу, адаптация зависит от того, «каким образом потенциальные генетически детерминированные возможности организма в ответ на требования среды преобразуются в его реальные возможности» (Ф.З. Меерсон, 1984).
Оценка качества адаптации производится в основном на физиологическом уровне, при этом прогноз состояния функционального резерва организма дается на небольшой период времени. Дать долгосрочную картину последствий воздействия в большинстве случаев невозможно. И, несмотря на то, что реакции организма, меняющиеся под действием факторов среды, исследуют в основном на системном уровне, современный этап развития науки предполагает поиск причин развития і патологии на тканевом, клеточном, биохимическом уровнях. Для определения качества механизмов адаптации на уровне клетки используют традиционные цитогенетические методы. Частота аберраций хромосом, микроядер являются достоверными критериями для оценки как популяционных эффектов влияния факторов внешней среды, так и индивидуальной реакции организма на воздействие.
7 Удобным инструментом для моделирования таких клеточных ответов является радиация. При использовании ионизирующего излучения возможно достаточно точно рассчитать дозу воздействия, можно избирательно действовать на различные компоненты клетки, контролируя их роль в развитии патологических состояний. В тоже время, известно, что малые дозы радиации запускают неспецифические механизмы защиты, то есть результаты, исследований могут быть с известными допущениями экстраполированы на действие любых других повреждающих агентов.
Целью, исследования являлось изучение цитогенетических аномалий и метаболических сдвигов в биологических жидкостях организма для определения индивидуальной чувствительности в условиях действия экологических и техногенных факторов.
Исходя из поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:
1. Исследовать особенности клеточных реакций и метаболических
сдвигов в различных экологических условиях и определить критерии оценки
степени экологического неблагополучия-.
Изучить влияние факторов полета на адаптивные возможности организма на клеточном и метаболическом уровне.
Выявить закономерности в характере обнаруженных индивидуальных реакций и на их основе сформулировать критерии для формирования, групп риска и повышенной устойчивости.
Изучить механизмы наблюдаемых эффектов при действии, ионизирующей радиации и реализации адаптивного ответа.
Научная новизна работы.
Сопоставление данных, полученных с помощью лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) биологических жидкостей, с результатами цитологического обследования детей, проживающих и обучающихся в разных условиях, обнаружило высокую корреляцию между показателями, полученными различными методами, и продемонстрировало значительную информа-
I \
8 тивность разработанного подхода. В работе данные, полученные с помощью этих методов, рассматриваются с позиции качества функционирования адаптивных механизмов. При обработке результатов учета аномалий ядра (АЯ) в буккальных эпителиоцитах предложено использовать два коэффициента (число аномалий на клетку и отношение клеток с кариолизисом к общему числу АЯ). Первый коэффициент отражает состояние репаративных механизмов, второй - скорость устранения клеток с повреждениями.
Получены экспериментальные данные по выявлению адаптивного'ответа (АО) на лимфоцитах периферической крови военных летчиков, в которой учитывалось число аберраций хромосом. Впервые показано, что частота встречаемости пилотов с АО уменьшается с увеличением часов налета. Кроме того, с использованием, ряда методов проанализированы адаптивные возможности организма летчиков в зависимости от различных факторов (возраста, высоты полетов, часов налета, наличия либо отсутствия АО). Обнаружены изменения частоты встречаемости и соотношений отдельных типов АЯ" буккальных эпителиоцитов и различия в,характере метаболических сдвигов в зависимости от часов налета и высоты.
Показано, что при облучении лимфоцитов периферической крови в культуральную жидкость высвобождаются вещества, возможно, принимающие участие в реализации долгосрочных эффектов техногенных факторов. Они были выделены и предварительно охарактеризованы как нуклеопротеи-ды, в упакованной форме соответствующие размеру 1500 п.н., а форме свободной ДНК - 20000 п.н.
Кроме того, действие повреждающих доз облучения вызывает у лиц* с наличием либо отсутствием АО разнонаправленные сдвиги в продукции у-интерферона.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Основные трудности в выявлении эффектов воздействия экологических и антропогенных факторов окружающей среды связаны со слабой выраженностью проявлений и ограниченной чувствительностью методов исследова-
9 ния. Использованный в работе методический подход показал свою перспективность для профотбора и мониторинга состояния здоровья, военнослужащих и работников потенциально опасных отраслей промышленного производства, населения экологически неблагополучных территорий. Сопоставление и обобщение данных, полученных при обследовании больших выборок людей, позволяет определить точный критерий для оценки адаптированности организма к среде.
Кроме того, популяционные данные не позволяют осуществлять индивидуальные прогнозы:. Впервые обнаруженные в работе различиям частоте встречаемости и соотношениях отдельных типов АЯ буккальных эпителио-цитов и различия в характере метаболических сдвигов в группах людей с наличием либо отсутствием-АО являются теоретической основой для дальнейшей разработки комплекса тестов, позволяющих выявлять лиц с повышенной устойчивостью или чувствительностью к действию экологических и техногенных факторов.
Разработанные критерии оценки адаптивных возможностей организма были применены-для массовых обследований работников предприятия ядерно-топливного цикла. Это позволило оценить изменения, возникающие в.ме-таболизме индивидуумов в результате действия различных производственных факторов.
Использование облучения как фактора, запускающего неспецифический ответ in vitro, возможно, позволит осуществлять прогноз клеточно-метаболических реакций in vivo, и, в конечном итоге, проводить оценку риска срыва систем адаптации. Раннее выявление особенностей АО, изменений» в. метаболизме и уровне цитогенетических,повреждений.для,конкретного человека позволит своевременно проводить, индивидуальные профилактические-мероприятия.
10 Положения, выносимые на защиту:
Характер клеточно-метаболических реакций организма при воздействии различных экологических факторов различается в зависимости от наличия или отсутствия адаптивного ответа.
Сочетанное применение методов выявления адаптивного ответа на лимфоцитах периферической крови, цитогенетического исследования клеток буккального эпителия и лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека информативно для оценки адаптивных возможностей организма в условиях действия неблагоприятных факторов окружающей среды.
Внедрение в практику. Метод лазерной корреляционной спектроскопии биологических жидкостей человека для выявления групп риска при массовых обследованиях работников предприятий ядерно-топливного цикла внедрен в практику Федерального медико-биологического агентства РФ (акт от 5.10.07).
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Природные факторы и социальные условия успешности обучения», Санкт-Петербург, 2005; Пленуме «Экологически обусловленные ущербы здоровью: методология, значение и перспективы оценки», Москва, 2005; Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт — Петербургские научные чтения», СПб, 2005; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», Суздаль, 2005; V съезде по радиационным исследованиям «Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность», Москва, 2006; 6-м симпозиуме Международного общества по изучению деформаций позвоночника (IRSSD), Belgium, Ghent, 2006, III Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», Москва - Дубна, 2007, XX съезде физиологического общества им. И.П.Павлова, Москва, 2007.
Радиочувствительность как показатель адаптированности организма к условиям среды
Способность к адаптации многими исследователями рассматривается? как основное свойство организма, позволяющее выживать в условиях меняющихся факторов среды. «Большая способность к приспособлению, или адаптация,- вот что делает возможным жизнь на всех уровнях сложности. Приспособляемость - это, вероятно, главная отличительная черта жизни» (Г.Селье, 1982). Жизнеспособность и степень приспособляемости складываются из множества, возникших в ходе эволюции специфических и неспецифических процессов; потеря способности к адаптации означала бы гибель организма.
Под общепринятым термином «адаптация» чаще всего рассматривается физиологическая адаптация, которая представляет собой совокупность об щих защитных реакций, возникающих в организме животных и человека при действии значительных по силе и продолжительности внешних и внутренних раздражителей; эти реакции способствуют восстановлению нарушенного равновесия и направлены на поддержание гомеостаза. ч
Широкий диапазон адаптивных возможностей включает приспособительные и компенсаторные реакции. Понятие о приспособительных реакциях шире понятия о реакциях компенсаторных; под первыми принято подразумевать проявление адаптации организма к среде, тогда как под вторыми только те из них, которые обуславливают восстановление гомеостаза после гибели части того или иного органа. Любая приспособительная реакция организма представляет собой сложное явление, складывающееся из ряда более простых элементов. Какими бы сложными функциональном отношении ни,казались компенсаторно-приспособительные реакции организма, они всегда могут быть разложены на свои, простейшие элементы и этими элементами во всех случаях окажутся те или иные нормальные физиологические проявления активности органов и тканей. Уравновешивание организма с окружающей средой, как в нормальных условиях жизнедеятельности, так и при различных болезнях обеспечивается в конечном итоге всегда на основе одного и того же стандартного феномена - усиления или ослабления функции, изменение интенсивности (скорости) процессов жизнедеятельности (Б.М. Федоров, 1978).
С физиологической позиции адаптация трактуется как целостнаяреак-ция функциональных систем, органов и тканей организма, а также механизмов управления, способствующая не только поддержанию динамического равновесия со средой, но и обеспечивающая возможность эволюции при ее изменении. Вследствие динамизма окружающей среды адаптацию следует рассматривать как непрерывный процесс, цель которого состоит в сохранении биологического гомеостаза.
Развитие компенсаторно-приспособительных реакций происходит под двойным контролем ослабляющих и усиливающих систем, соотношение которых определяет уровень функциональной активности той или иной ткани, органа, клетки.
Приспособительные реакции организма подразделяются на два связанных между собой класса, а именно на реализующиеся «с места» реакции срочного приспособления и на постепенно формирующиеся реакции долговременного приспособления.
Быстро возникающие срочные адаптационные реакции - это реакции, для осуществления которых в организме имеются готовые, вполне сформировавшиеся механизмы. Срочная адаптация подразумевает активацию резервных структур. Обеспечение приспособительных колебаний функциональной активности органов, заключается в «перемежающейся активности функционирующих структур» (Г.Н. Крыжановский, 1974), в варьировании количества активно работающих структур из числа имеющихся в норме.
Однако, функциональная нагрузка на системы, например на клетку, может возрастать или быть длительной, и тогда для сохранения ее гомеостаза одного только включения в работу имеющихся ультраструктур недостаточно. Такой дефицит вызывает включение механизмов долговременной адаптации.
В клетке увеличивается число ультраструктур, а также размеры каждой из них. Появление новых структур (органелл в клетках и самих клеток) соответственно уровню требуемого от органа функционального напряжения.
При обеспечении приспособительного усиления функций происходит не простое увеличение числа активно функционирующих структур, а.такое, интенсивность которого непрерывно колеблется в строгом соответствии с изменениями частоты и силы раздражителя.
Долговременная адаптация охватывает реакции, для осуществления которых в организме нет вполне готовых сформировавшихся структур, а имеются лишь генетически детерминированные предпосылки, обеспечивающие постепенное формирование таких механизмов» при многократном или длительном использовании наличных механизмов срочной адаптации. (Ф.З. Ме-ерсон, 1986).
Несомненным является тот факт, что адаптивные возможности организма варьируют у разных людей, и емкость их зависит от множества факторов, отследить которые достаточно сложно, тем не менее, одной из главных основ-адаптации организма является наследственность. «Холод, мышечные усилия, кровотечения и другие стрессоры могут быть переносимьг в течение ограниченного срока. После первоначальной реакции тревоги организм, адаптируется и оказывает сопротивление, причем продолжительность периода сопротивления зависит от врожденной приспособляемости организма и от силы стрессора» (Г.Селье, 1982).
Функционирование организма определяется работой генома, в .зависимости от комплекса факторов внутренней и внешней среды меняютсятруппьг активных генов, изменяется интенсивность их работы. В настоящее время 90% заболеваний относятся к мультифакториальным, в развитии которых значительную роль играют факторы среды, но основным началом патологии является наследуемая предрасположенность (Г.Р. Мутовин, 2001).
Постановка схемы адаптивного ответа на ФГА - стимулированных лимфоцитах периферической крови человека
Вредные последствия действия на клетки высоких концентраций мутагена могут в ряде случаев быть снижены, если клетки предварительно подвергнуть действию низкой концентрации этого же мутагена. В стимулированных к делению лимфоцитах периферической крови человека, подвергнутых in vitro острому облучению в дозе нескольких Гр редкоионизирующей радиации, наблюдаемый выход повреждений ДНК оказывается меньше ожидаемого, если лимфоциты предварительно облучить дозой порядка десятков1 мГр. Этот эффект малых доз получил название индукции адаптивного ответа (АО). В литературе принято называть малую, «предварительную дозу» адаптирующей (АД), а вторую - основной, повреждающей (ПД) (И.В. Филиппович, 1991; А.Ф. Цыб, 2005). АО связывается со способностью клетки репари-ровать повреждения ДНК. АО меняется с изменением состава среды культивирования. Он тесно связан с клеточным метаболизмом с теми изменениями клетки, которые принято называть ответом на генотоксическии стресс (стрессовым ответом).
Материалом для работы послужили ФГА-стимулированные лимфоциты периферической крови человека. Взятие крови осуществляли в стерильные флаконы с гепарином. Для культивирования клеток использовались: эмбриональная телячья сыворотка стерильная, тестированная на цитотоксич-ность и отсутствие микоплазм («Perbio- HyClone», США) (1,6 мл на флакон), питательная среда RPMI- 1640 с 25 мМ HEPES и бикарбонатом натрия.1 (6,2 мл на флакон) и ФГА (фитогемагглютинин-П из Phaseolus vulgarios, «Sigma», США) (0,15 мл на флакон). В среду были внесены глютамин (нестойкая, незаменимая аминокислота, которая первая разрушается в среде) и антибиотики пенициллин - стрептомицин (в растворе 5000 ед/мл пенициллина и 5000 мкл/мл стрептомицина). Посев производился в стеклянные флаконы для культивирования клеток. В каждый флакон вносили по 1 мл цельной гепари-низированной крови. Для оценки индивидуальной чувствительности к облу чению была выбрана одна из схем выявления адаптивного ответа: использовали две дозы - 0,05 Гр как адаптирующую и 0,5 Гр как повреждающую (Рис.2).
Облучение проводили на у-установке лучом мощностью 25 рад/мин на расстоянии 65 см (ГУ «Медицинский радиологический научный центр РАМН», г. Обнинск).
При посеве на стадии GO митотического цикла облучали дозой 0,05 Гр (адаптирующая доза) два флакона: один для оценки действия самой адаптирующей дозы, второй для последующего облучения повреждающей дозой, которое проводили через 48 часов, кроме того, параллельно повреждающей дозой облучался интактный флакон с кровью для оценки влияния дозы 0,5 Гр. Контрольный флакон с кровью не подвергался облучению. От посева до фиксации клетки инкубировали в термостате при 37С.
Фиксация. Фиксация клеток проводилась через 52 часа. За два часа до фиксации вводился демекольцин (0,17 мл на флакон) для остановки деления клеток на стадии метафазы и получения метафазных пластинок. После инкубации клетки центрифугировали в течение 15 мин. при 1000 об/мин. Надоса-дочную жидкость удаляют, оставляя 0,5 мл осадка. К осадку добавляли 10 мл гипотонического раствора (0,1М КС1), тщательно перемешивая, и инкубировали в термостате при 37С 15 мин. Суспензию клеток снова центрифугировали при 1000 об/мин. и удаляли надосадочную жидкость. Осадок перемешивают на магнитной мешалке и добавляли по каплям фиксатор (смесь метанола и ледяной уксусной кислоты 3:1). Обычно проводят несколько перемен фиксатора.
Приготовление препаратов. Препараты готовили раскапыванием 0,5 мл суспензии клеток в фиксаторе на влажные холодные стекла и высушивали на воздухе в течение нескольких часов. Препараты для рутинного анализа окрашивали краской Giemsa и микроскопировали в проходящем свете под масляной иммерсией при увеличении хЮОО. Учитывали следующие аберраций хромосом: хроматидные фрагменты, изохроматидные фрагменты, симметричные и ассиметричные хроматидные обмены (Рис.3).
Изменения в частоте встречаемости и соотношении отдельных видов аномалий ядра буккального эпителия
Рото-глоточный смыв представляет собой многокомпонентную водную среду, содержащую клеточные элементы (эпителий, лейкоциты), часть из которых частично или полностью разрушена, а также различные ферментные и неферментные молекулы, входящие в состав слюны. Слюна обладает высокой ферментативной активностью, поэтому большинство ее структурных ингредиентов (глико-, липопротеиновые комплексы, иммуноглобклины и др. молекулы) находятся в деградированном состоянии (Т.И: Бонашевская, 1989; Е.В. Боровский, 2001). Быстрое и значительное разведение этой высокоактивной в ферментном отношении жидкости приводит к резкому снижению протеолитической активности. Одновременно структурные компоненты слюны разводятся до той степени, когда обычными биохимическими и физико-химическими методами их выявление затруднено. ЛКС же обладает высокой чувствительностью детекции в отношении многокомпонентных молекулярных комплексов. Кроме того, забор рото-глоточных смывов относится к абсолютно неинвазивным методам, достаточно просто проводится без соблюдения тех мер предосторожности, которые требуются при заборе крови.
Обследование проводили натощак. Человеку предлагали прополоскать полость рта и глотки дистиллированной водой комнатной температуры на протяжении 30 с. Затем обследуемый должен прополоскать полость глотки 10-15мл физ. раствора в течение 20 с. Полученный смыв собирали в одноразовый стакан. Затем отбирали 1,0-1,5 мл смыва в пробирку «эппендорф». Центрифугировали на протяжении 10 мин при 3000 об/мин. В стерильную пластиковую пробирку отбирали надосадочную жидкость смыва. Образец замораживали в морозильной камере при температуре -24-30С. Не рекомендовано даже однократное размораживание биологического материала до момента его исследования и хранение препаратов более 3-х месяцев. Транспортировка производилась в замороженном виде.
Изучение субфракционного состава рото-глоточных смывов повышает информативность в комплексе с ЛКС плазмы/сыворотки крови. Исследование субфракционного состава сыворотки крови методом лазерной корреляционной спектроскопии.
Взятие крови осуществляли натощак в утренние часы (последний приём пищи не менее 9 часов назад). Кровь получали путем пункции одной из периферических вен с помощью инъекционных игл, помещали в коническую центрифужную пробирку самотеком во избежание повреждения эритроцитов. Для получения достаточного количества сыворотки необходимо не менее 3 мл крови. Для приготовления сыворотки образцы в пробирках экспонировали при комнатной температуре от 40 мин до 2 часов (для образования сгустка). После этого сгусток в пробирке обводили вдоль стенок стерильной стеклянной палочкой и центрифугировали в течение 15 мин при 3 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость, после центрифугирования отбирали с помощью дозатора в стерильную герметически упаковывающуюся пробирку в объёме 1мл.
Если этап исследования отсрочен, сразу же после приготовления образцов производили их консервацию путём замораживания. Сохранение образцов в замороженном состоянии является непременным условием при транспортировке и длительном хранении полученного биологического материала. Оптимальным является замораживание и хранение проб при температуре -25 С и ниже. Допускается и быстрое замораживание образцов до -10 -15С в морозильной камере обычного бытового холодильника, однако при такой температуре допускается хранение не более 3-х месяцев. При этом не допускается даже однократное размораживание биологического материала до момента его исследования.
Исследование субфракционного состава жидкостей получен ных в результате культивирования клеток методом лазерной корреляци онной спектроскопии.
При выполнении работы использовались методики культивирования клеток, при этом жидкость, в которой росли клетки, содержала продукты их жизнедеятельности и являлась информативным материалом.
При постановке схемы адаптивного ответа была получена надосадоч-ная жидкость, в которой клетки крови человека росли в течение 52 часов без воздействия или были облучены разными дозами- у-облучения. Культураль-ная жидкость в объеме 1,5 мл была отобрана в пробирки типа «эппендорф» и заморожена для транспортировки.
Перед непосредственным измерением образцы каждой биологической жидкости (РГС, сыворотки, культуральной жидкости) размораживали в термостате при температуре 36,7-37,0С на протяжении 30 мин. Образцы центрифугировали в течение 15мин при 5000 об/мин при комнатной температуре. Помещали 0,2 мл образца в кювету спектрометра для проведения измерения , с получением индивидуальных спектров.
Исследование содержания внеклеточной ДНК в культуральной жидкости лимфоцитов периферической крови человека с использованием фенольного способа выделения
Попытки выявлять действие потенциально опасных факторов окружающей среды на организм (в особенности детский) на донозологической стадии предпринимались неоднократно (Т.Д. Юдина, 1997; Ю.А. Рахманин, 2001; А.А. Афонин и др., 2000; Д.И. Масюта и др., 2002; P.M. Тахауов, 2003; В.В. Худолей, 2006), однако, до окончательного решения проблемы еще далеко. Одним из обстоятельств, осложняющих процесс раннего обнаружения негативных последствий действия антропогенных факторов на здоровье человека, является сравнительно узкий диапазон методов, пригодных для этой цели. В1 нашей работе мы использовали комплекс методов для оценки качества адаптации детей, проживающих в разных экологических условиях. Здоровье детей оценивали с помощью неинвазивных методик: учета АЯ в клетках буккального эпителия1 и метода лазерной корреляционной спектроскопии ро-то-глоточных смывов.
В основе учета АЯ в буккальном эпителии лежит доступность и простота получения клеток. Слизистая оболочка ротовой полости выстлана многослойным плоским неороговевающим эпителием, обновление которого происходит за счет деления базальных клеток. По мере созревания клетки переходят в промежуточный, а затем - в поверхностный слой, в котором и подвергаются слущиванию. Цитогенетические повреждения, в частности, микроядра, возникающие в базальном слое, сохраняются и могут быть зарегистрированы в поверхностных слоях. Современный протокол микроядерного теста включает учет МЯ как основного показателя генотоксичности, а также других АЯ и цитоплазмы, из которых одни можно использовать как дополнительные индикаторы генотоксичности, а другие — цитотоксичности.
Исследование буккального эпителия проводится с использованием стандартных методик оценки состояния хроматина (окраска по Фельгену) и включает просчет большого числа клеток. В. образцах определяют частоту встречаемости клеток с АЯ, такими как двуядерные клетки, кариорексис, ка-риолизис, «битое яйцо», МЯ.
Для оценки действия экологических факторов большинство авторов использует подсчет микроядер в клетках буккального эпителия, при этом оценка остальных АЯ не проводится. В норме существует фоновый уровень АЯ, но встречаемость патологий и их соотношение в разных группах не является постоянной величиной. Не существует также данных о частоте встречаемости этих аномалий для групп условно здоровых людей. Однако, наши данные показывают, что возможно использовать АЯ буккального эпителия для оценки адаптированности исследуемой группы к факторам среды.
Для этого были предложены два. коэффициента: среднее количество аномалий ядра на клетку (коэффициент АЯ) и отношение числа клеток с лизисом к общему числу клеток с аномалиями ядра (коэффициент лизиса).
Первый коэффициент является принятым в цитогенетических исследованиях, но он не применялся в отношении буккального эпителия. Мы рассматриваем его как параметр, который характеризует качество репаративных механизмов. Если принять во внимание, что кариолизис является завершающей стадией нормальной гибели клетки, то можно предположить, что клетки с любым из вариантов АЯ (двуядерные клетки, клетки с кариорексисом и пикнозом) переходят в стадию лизиса. При этом отношение должно быть приблизительно равно 1, то есть, чем больше будет число АЯ превышать долю клеток с лизисом, тем больше коэффициент будет стремиться к 0. Низкий процент лизиса при этом можно рассматривать как, недостаточность механизмов устранения поврежденных клеток.
Как наиболее экологически чистый район мы рассматриваем с. Нагово Новгородской области, и соотношение коэффициентов, полученных при-анализе буккального эпителия, считаем отражением адекватной работы систем адаптации организма (0,040 / 0,241). Низкое значение коэффициента АЯ и высокое значение коэффициента лизиса показывают, что возникающие АЯ походят весь жизненный цикл и устраняются в процессе лизиса. Для сравнения, в школе №735 г. Москвы высоко значение повреждений на клетку, которые не устраняются в процессе лизиса (0,187 / 0,018), что говорит о недостаточности механизмов устранения поврежденных клеток (Рис.6).
Анализ данных в различных выборках школьников показывает, что экологические условия влияют на частоту встречаемости клеток с АЯ, но возникает вопрос о качественном составе этих аномалий. У детей обследованных школ встречались все аномалии ядра. Сравнивая группы г. Москвы, с. Нагово и г. Майкоп и с. Джеракай, можно отметить, что наиболее динамичными являются показатели частоты встречаемости клеток с кариорекси-сом и пикнозом. Если в московской выборке была значительна частота ка-риорексиса (170 на 1000 клеток), то в выборках г. Майкоп - с. Джеракай отмечается повышенная частота клеток с пикнозом (по сравнению с г. Москвой и с. Нагово). В зависимости от роста антропогенной нагрузки увеличивается вклад клеток с кариорексисом в общее число АЯ (Рис.7).
Средние частоты встречаемости различных аномалий ядра в обследованных группах. По оси ординат среднее число аномалий. - по сравнению с с.Нагово, # - по сравнению с с.Джерокай, - по сравнению с г.Майкоп р 0,05 критерий Mann- Whitney.
Эти же группы детей были обследованы методом ЛКС. Материалом для работы служили рото-глоточные смывы (РГС), субфракционный состав которых регистрировали с помощью лазерного корреляционного спектрометра 1ЖС-03-«ИНТОКС» (Санкт-Петербург). Отбор проб и измерение проводили по методике, описанной в главе 2.
Похожие диссертации на Оценка клеточно-метаболических адаптивных реакций организма при действии экологических и техногенных факторов
