Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1. Общая характеристика, биосинтез, метаболизм и функции L карнитина у млекопитающих 17
1.1.1. Биосинтез и метаболизм L-карнитина 17
1.1.2. Потребность человека в L-карнитине. кишечное всасывание. фармакокинетика и реабсорбция в почках 20
1.1.3. Транспорт L-карнитина а ткани и органеллы 25
1.1.4. Функции L-карнитина в организме млекопитающих 27
1.1.5. Карнитинацил-трансферазы 28
1.1.6. Роль L-карнитина и карнитинацил-трансфераз в регуляции внутриклеточного пула КоА и КоА-зависимых процессов
1.2. Экспериментальная и клиническая фармакология L-карнитина 33
1.3. Нарушения обмена L-карнитина у человека и животных
1.3.1. Клинические аспекты недостаточности L-карнитина 40
1.3.2. Нарушения обмена L-карнитина при экспериментальном и клиническом алкоголизме 46
1.3.3. Нарушения обмена L-карнитина при введении вальпроевой кислоты 49
1.3.4. Нарушения обмена L-карнитина при нарушениях питания и недостаточности витаминов 51
1.4. Патофизиологические механизмы токсичности этанола. вальпроевой кислоты, недостаточности рибофлавина и биоти на 52
1.4.1. Молекулярные механизмы алкогольного поражения печени з
1.4.2. Молекулярные механизмы токсичности вальпроевой кислоты 57
1.4.3. Биохимические нарушения при недостаточности рибофлавина 61
1.4.4. Биохимические нарушения при недостаточности биотина 63
ГЛАВА II. Материал и методы исследования 66
2.1. Экспериментальные модели 66
2.1.1. Моделирование алкогольного поражения печени у крыс и мышей 66
2.1.2. Моделирование острой алкогольной интоксикации у крыс 67
2.1.3. Введение вальпроевой кислоты крысам 67
2.1.4. Моделирование недостаточности рибофлавина у крыс 68
2.1.5. Моделирование недостаточности биотина у крыс 69
2.2. Методы исследования 69
2.2.1. Выделение гепатоцитов и непаренхиматозных клеток (клетки Купфера) из печени крыс 69
2.2.2. Выделение лимфоцитов из крови крыс 70
2.2.3. Определение концентрации креатинина в моче 71
2.2.4. Определение уровня рибофлавина и флавинмононуклеотида в печени методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 71
2.2.5. Определение концентрации биотина в плазме крови 72
2.2.6. Определение содержания летучих жирных кислот (С2 - Сй) в физиологических жидкостях и тканях методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) 72
2.2.7. Определение концентрации жирных кислот в фосфолипидах лимфоцитов крови 73
2.2.8. Определение концентрации органических кислот в физиологических жидкостях и тканях методом капиллярной газовой хроматографии 73
.9. Определение концентрации общего и свободного L-карнитина в плазме крови, тканях и моче 76
.10. Определения концентрации ацшжарнитинов в тканях и физиологических жидкостях методом тандемной хроматомасс спектрометрии (FAB-MS/MS) 77
.11. Определение концентрации свободных аминокислот в тканях и плазме крови 79
.12. Определение концентрации тригли церидов. общих липидов. общих фосфолипидов. холестерина, фракций фосфолипидов в тканях 80
.13. Микроскопия и оценка гистологических параметров печени 81
.14. Определение показателей перекисного окисления липидов 81
. 15. Определние активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) в плазме крови и цитохрома Р450 (CYP2E1) в гепатоцитах 83
.16. Определение концентрации этанола в крови 83
.17. Определение концентрации цитокинов. простагландина Е2 и N0 в плазме крови и культуральных средах 84
.18. Выделения общей РНК. синтез кДНК и определение экспрес сии генов цитокинов 85
.19. Анализ экспрессии генов ферментов биосинтеза карнитина и карнитин-ассоциированных белков в печени методом микро чип-экспрессионной технологии 86
Методы статистической обработки результатов 87
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований патофизиологические механизмы алкоголь ного поражения печени; роль l карнитина 88
1. Влияние L-карнитина на выраженность поражения печени и биохимических нарушений при алкогольной интоксикации 88
2. Влияние алкогольной интоксикации на экспрессию генов ферментов биосинтеза карнитина и карнитин-ассоциированных белков в печени 93
.3. Роль L-карнитина в модуляции функциональной активности клеток Купфера при алкогольной интоксикации 95
Патофизиологические механизмы гепатоток сичности валытроевой кислоты; роль l карнитина 98
-1. Влияние L-карнитина на обмен липидов у крыс при введении вальпроата 98
-2. Влияние L-карнитина на активность перекисного окисления липидов у крыс при введении вальпроата 103
.3. Влияние L-карнитина на формирование пула свободных аминокислоту крыс при введении вальпроата 107
Молекулярные механизмы нарушений обмена l-карнитина при недостаточности рибофлави на у крыс 118
1. Влияние недостаточности рибофлавина на экскрецию органических кислот и глициновых конъюгатов 118
2. Влияние недостаточности рибофлавина на концентрацию ко роткоцепочечных и дикарбоновых органических кислот в
тканях и плазме крови 123
3. Влияние недостаточности рибофлавина на уровень фракций L-карнитина в тканях и плазме крови 126
.4. Влияние недостаточности рибофлавина на концентрацию ацилкарнитинов в тканях и биологических жидкостях 129
3.4. Молекулярные механизмы нарушений обмена l-карнитина при недостаточности биотина у крыс 137
3.4.1. Влияние недостаточности биотина на обмен органических кислот и короткоцепочечных жирных кислот 137
3.4.2. Влияние недостаточности биотина на композицию жирных кислот фосфолипидов лимфоцитов 141
3.4.3. Влияние недостаточности биотина на содержание фракций L-карнитнна в тканях и биологических жидкостях 147
3.4.4. Влияние недостаточности биотина на концентрацию ацил карнитинов в тканях и биологических жидкостях 150
Обсуждение полученных результатов 155
Заключение 178
Выводы 180
Практические рекомендации 182
Список литературы
- Потребность человека в L-карнитине. кишечное всасывание. фармакокинетика и реабсорбция в почках
- Моделирование алкогольного поражения печени у крыс и мышей
- Влияние алкогольной интоксикации на экспрессию генов ферментов биосинтеза карнитина и карнитин-ассоциированных белков в печени
- Влияние недостаточности биотина на содержание фракций L-карнитнна в тканях и биологических жидкостях
Потребность человека в L-карнитине. кишечное всасывание. фармакокинетика и реабсорбция в почках
Положения, выносимые на зашиту:
1. Активация системы карнитина при его экзогенном введении снижает выраженность алкогольной патологии печени за счет модуляции системы антиоксидантной защиты и продукции провоспалительных цитокинов. Снижение при алкогольной интоксикации экспрессии генов, ответственных за биосинтез карнитина и функционирование карнитин-зависимых процессов, свидетельствует об участии системы карнитина в патогенезе алкогольного поражения печени.
2. Карнитин снижает интенсивность активированных при введении вальпроата процессов перекисного окисления липидов, повышая активность антиокислительной системы. Вальпроат вызывает изменения количественного состава липидных фракций в печени и мозге животных, в печени изменения касаются в основном холестерина, общих липидов и фосфолипидов, а в мозге, главным образом - фосфолипидов, карнитин нормализует показатели обмена липидов в исследованных тканях. Изменения пула свободных аминокислот и их производных в тканях и плазме крови крыс на фоне введения вальпроата нормализуется под действием карнитина.
3. Недостаточность рибофлавина у крыс приводит к снижению концентрации свободного карнитина в плазме крови и тканях и развитию дикарбоновой органической ацидурии. Нарушения обмена карнитина модулирует карнитин-зависимые реакции, приводя к активации биосинтеза. накоплению в тканях и повышенной экскреции эфиров карнитина. Введение карнитина при В2-гиповитаминозе нормализует обмен карнитина и снижает выраженность органической ацидурии за счет снижения экскреции глициновых конъюгатов и этилмалоновой кислоты. 4. Недостаточность биотина у крыс вызывает нарушения обмена карнитина и органических кислот, характеризующиеся развитием недостаточности карнитина, повышенной экскрецией и накоплением в тканях специфических органических кислот и эфиров карнитина. Изменения жирнокислотного состава фосфолипидов лимфоцитов крыс при биотиновой недостаточности выражаются в увеличении содержания жирных кислот с нечетным числом атомов углерода и очень длинной углеводородной цепью, а также снижением относительного содержания ненасыщенных жирных кислот. Повышение активности системы карнитина при его экзогенном введении на фоне биотинового гиповитаминоза эффективно в поддержании уровня свободного карнитина и снижении накопления пропионовой и 3-ОН-изовалериановой кислот.
Апробация работы. Результаты диссертационного исследования были доложены и обсуждены на: Международном симпозиуме "Витамины и здоровье населения Беларуси и смежных регионов" (Гродно, 1995), Международном симпозиуме "Аминокислоты и их производные" (Гродно, 1996), 17 Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Санфранциско, США, 1997), III Всемирном конгрессе врачей-поляков (Краков, Польша, 1997), Гепатологических симпозиумах (Фрайбург, Германия, 1997, 1999), на научных конференциях Института биохимии НАН Беларуси (1994, 1995, 1999), 5-Республиканском съезде специалистов клинической лабораторной диагностики (Минск, 1997), Международном симпозиуме "Пантенол и другие производные пантотеновой кислоты" (Гродно, 1998), Международной конференции "Экология человека в постчернобыльский период" (Минск, 1998), Международном конгрессе по токсикологии (Норвегия, 1999), Международных симпозиумах Европейского общества по изучению алкоголизма (Франция, 2002; Чехия, 2004). Публикации. Соискатель имеет 87 публикаций в журналах и материалах конференций. Основные положения диссертации изложены в 32 печатных работах, включая 19 статей, из них 7 - в журналах. рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ; 7 статей в зарубежных журналах, остальные - статьи и тезисы докладов в сборниках материалов международных съездов и конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 247 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы. главы "Материал и методы исследования", четырех глав, содержащих результаты собственных исследований, общего обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка цитируемой литературы. Список литературы включает 565 источников, из них 23 отечественных и 542 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 41 таблицей и 8 рисунками.
Моделирование алкогольного поражения печени у крыс и мышей
Данные о влиянии алкогольной интоксикации на обмен карнитина и состояние карнитин-зависимых процессов у человека и животных достаточно разнородны, что связано с различными методическими подходами к моделированию экспериментов на животных (дозы, длительность) и подбору репрезентативных групп в клинических исследованиях. Отсутствие различий в концентрации общего и свободного карнитина, а также ацил-карнитина обнаружено в плазме крови алкоголиков с алкогольным циррозом печени и больных криптогенным циррозом (Amodio P. et al., 1990). De Sousa выявил отсутствие различий в содержании свободного, общего, ацил-карнитииа и суточной экскреции свободного карнитина и его метаболитов у хронических алкоголиков и здоровых волонтеров (De Sousa С. et al., 1988). Однако в биоптатах мышечной ткани алкоголиков, уровень свободного и общего карнитина был выше, чем у здоровых испытуемых. Выявленные различия, по-видимому, обусловлены более высокой концентрацией карнитина в мышечных волокнах I типа, преобладающих в мышцах алкоголиков, чем в волокнах II типа, характерных для здоровых людей. При сравнении концентраций карнитина в плазме крови мужчин-алкоголиков без выраженной патологии печени и больных, с подтвержденным результатами клинического и лабораторного обследования, алкогольным циррозом, обнаружен более высокий уровень свободного карнитина и длинноцепочечных ацнлкарнитинов у алкоголиков без цирроза (Fuller R.K.. и Hoppel C.L., 1988). В тоже время концентрация свободного и общего карнитина в крови алкоголиков при поступлении и на 9 - 11 день дезинтоксикационной терапии не отличалась от значений в контрольной группе (Harper P. et al., 1993). Однако концентрация короткоцепочечных и длинноцепочечных ацнлкарнитинов в крови была ниже в период абстиненции, чем при поступлении, а в печени уровень общего карнитина при поступлении не отличался от значений после отмены этанола, но был выше, чем у здоровых волонтеров. Это может свидетельствовать об активации биосинтеза карнитина de novo и/или повышении мобилизации карнитина и его предшественников из периферических тканей. У мужчин-алкоголиков с циррозом печени концентрация свободного и общего карнитина, короткоцепочечных, длинноцепочечных ацилкарнитинов в плазме крови выше, чем у здоровых, тогда как у 61% больных алкогольным циррозом печени, сочетавшемся с алиментарной дистрофией, отмечено снижение уровня свободного и общего карнитина в плазме крови и печени (Fuller R. и Hoppel C.L.. 1983; Rudman D. et al., 1977).
В одном из первых исследований, посвященных нарушениям обмена карнитина при алкогольной интоксикации у животных, было обнаружено повышение концентрации свободного карнитина, ацетил- и ацилкарнитина в плазме крови крыс на фоне однократного введения этанола (5 г/кг, в/ж) (Bode С.Н. et al., 1970). Эти изменении сопровождались увеличением уровня свободного KoASH, ацетил-КоА и ацил-КоА, ободного, общего и аце-тилкарнитина и снижением уровня ацилкарнитина в печени (Kondrup J. и Grunnet N., 1973; Sachan D.S. et al., 2002). В тоже время при хронической алкогольной интоксикации (14 недель, жидкая алкогольная диета, 36% калорий в виде этанола) у крыс отмечалось снижение концентрации свободного карнитина, короткоцепочечных ацилкарнитинов и увеличение уровня ацетил карнитина и триглицеридов в печени (Bode С.Н. et al., 1988). В исследовании Sachana, изучавшего влияние алкоголя (жидкая алкогольная диета, 57 дней) на обмен карнитина, обнаружено повышение концентрации свободного карнитина, снижение уровня ацил- и увеличение общего карнитина, а также отношения ацилкарнитин/свободный карнитин в печени крыс (Sachan D. и Rhew Т.Н., 1982). У крыс Sprague-Dawley, находившихся в течение 56 дней на жидкой алкогольной диете (36% калорий в виде этанола) наблюдалось значительное снижение уровня общего и свободного карнитина в плазме крови по сравнению с контролем (Reddi A.S. et al., 1990; Sachan D.S. et al., 1984). Снижение уровня карнитина в плазме крови и среднем мозге отмечалось у крыс, получавших жидкий алкогольный рацион (32 дня, повышающаяся концентрация этанола от 2,5 до 10%), причем экзогенное введение карнитина в дозе 300 мг/кг в сутки предотвращало эти изменения (Corbetl R. и Leonard В.Е., 1984).
Изучение влияния алкогольной интоксикации (в/ж введения этанола (2 г/кг, 7 дней)) на обмен карнитина выявило повышение экскреции общего, а также короткоцепочечных ацилкарнитинов (ацетил-, пропионил-, бутирил-карнитин) и снижение свободного карнитина у крыс (Calabrese V. и Rizza V., 1999). Отмечено и увеличение экскреции короткоцепочечных жирных кислот (ацетат, пропионат. бутират), а также органических кислот (метил-малонат, лактат, пируват, (3-ОН-бутират) и короткоцепочечных ацилкарнитинов, что является одним из патогенетических факторов развития недостаточности карнитина (Calabrese V. et al-, 2004). К тому же, хроническая алкогольная интоксикация вызывает развитие недостаточности предшественников биосинтеза карнитина лизина и метионина, снижая их биодоступность, за счет увеличения потребности организма в липофильных факторах, содержащих метальные группы.
Важно отметить, что алкогольная интоксикация индуцирует не только нарушения обмена карнитина, но влияет и на состояние карнитин-зависимых ферментативных процессов. При хронической алкогольной интоксикации снижается интенсивность окисления жирных кислот в результате угнетения активности карнитинпальмитоил-трансферазы І (КПТ-1). У крыс длительное время получавших жидкую алкогольную диету (35 дней, 36% калорий в виде этанола) снижалась активность КПТ-1 и скорость окисления 1- С пальмитата в изолированных митохондриях печени и повышалась чувствительность фермента к физиологическим концентрациям мало-нил-КоА (Guzman М. и Castro J., 1990). Снижение активности КПТ-1 с пальмитоил-КоА и арахидонил-КоА в качестве субстратов выявлено в митохондриях, изолированных из сердца крыс, получавших в течение 42 дней
Влияние алкогольной интоксикации на экспрессию генов ферментов биосинтеза карнитина и карнитин-ассоциированных белков в печени
Содержание жирных кислот измеряли методом газо-жидкостной хроматографии с пламенно-ионизационным детекторованием на хроматографе Model 5890GC (Hewlett Packard, Palo Alto, CA, США) оборудованным капиллярной колонкой Supelcowax 10 (30 м х 0,25 мм. толщина жидкой фазы 0,25 мкм). В качестве газа-носителя использовали Не- Начальная температура термостата колонок - 50"С, линейный градиент температуры до 140С, со скоростью 5"С/мин, затем до 260 при 1,5"С/мин. Идентификацию пиков осуществляли на масс спектрометре Model DX-300 (JEOL, Tokyo, Япония).
Органические кислоты из образцов мочи крыс экстрагировали и идентифицировали в виде триметилсилиловых производных по методу Chalmers R.A. (1980). Для исключения погрешностей, связанных с изменением относительной плотности мочи, концентрации органических кислот соотносили с концентрацией референтного метаболита мочи - креатинина. К объему мочи, содержавшему 0,1 мг креатинина, добавляли 20 мкл (20 мкг) З-ОН-2-фенилпропановой кислоты (внутренний стандарт), равный объему мочи объем насыщенного раствора NaCl и доводили 4,0 N раствором НС1 до рН 1,0. Органические кислоты экстрагировали дважды этилацетатом, объединенную органическую фазу фильтровали через безводный Na2S04 и концентрировали в токе азота при 37"С. Сухой остаток дериватизировали N.O-бис(триметилсилил)-трифторацетамидом (BSTFA, Pierce, USA) (80 мкл) в пиридине в течение 60 мин при 80"С. Раствор запаивали в стеклянные капилляры (30 мкл), 1,0 - 2,0 мкл пробы использовали для анализа. Хромато-грацию триметилсилиловых эфиров органических кислот проводили на газовом хроматографе Hewlett Packard 5890 (Palo Alto, CA, США), с паменно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой Ultra-1 (25 м х 0,25 мм). В качестве газа-носителя использовали Не, температура инжектора - 280С, детектора - 300С. Начальная температура термостата колонок - 50С, линейный градиент температуры до 280С, со скоростью 4,8С/мин, затем до 320" при 8,0С/мин. Запись хроматограмм осуществляли на интеграторе-самописце HP 3392, данные обработывали на IBM PC AT486DX. Качественную идентификацию органических кислот анализируемого образца и статистическую обработку результатов анализа проводили используя специализированный пакет программ (GCSTAT, США). Идентификацию соединений в образцах осуществляли на основании времени удерживания стандартов органических кислот, используя компьютерный банк данных времен удерживания свыше 200 органических соединений, обнаруживаемых в моче и идентифицированных методом хроматомасс-спектрометрии. Количественное содержание каждого компонента пробы определяли соотношением площадей соответствующих органических кислот и внутреннего стандарта и выражали в мкг/мг креатинина. При ГЖХ анализе в моче крыс обнаружены алифатические кето-карбоновые, гидро-ксикарбоновые, дикарбоновые и ароматические кислоты и конъюгаты гли 75 цинового ряда: 1. молочная (время удерживания,12,25), 2. гидроксиизомас-ляная (12,49), 3. 2-гидроксимасляная (14,42), 4. 3-гидроксипропионовая (14.77), 6. 2-гидрокси-2-метил масляная (14,88). 7. 3-гидроксимасляная (15,43), 3-гидроксиизомасляная (15,71), 8. 2-гидроксиизовалериановая (16,48), 9. малоновая (16,67), 10- 3-гидроксимасляная, ацетоуксусная (16,92), 11. метил малоновая (17,02), 12. мочевина (17,38), 13. 3-гидроксивалериановая (17,83), 14. ацетоуксусная (17,91), (5. 2-гидрокси-З-мети л валериановая (17.94), Іб. 2-гидроксиизокапроновая (18,11), 17. 4-гидроксиизовалериановая (18,48), 18. 3-кето-н-валериановая (18,76), 19. 2-метил-3-гидроксивалериановая 18,96), 20. этилмалоновая (18,98), 21. глице-рол (19,42), 22. янтарная 19,81), 23. 3-гидроксиизокапроновая (19,97), 24. 2-метил-3-кетовалериановая (20,13), 25. метилянтарная (20,28), 27. глицериновая (20,84), 28. фумаровая (20,62), 29. глутаровая (22,42), 31. 3-метилглутаровая (23,07), 32. 3-метилглутаконовая (І) (23,78), 33. изовале-рилглицин (І) (24,20), 34. 3-метилглутаконовая (П) (24,27), 35. 2-метоксифенилуксусная (24,51), 36. адипиновая (25,20), 37. 4-фенилмасляная (25,44), 39. 3-метиладипи новая (25,50), 40. З-метил кротон ил глицин (26,06), 41. 3-гидроксибензойная (26,22), 42. 2-гидроксифенилуксусная (26,74), 43. 2-гидроксиглутаровая (26,89), 44. З-гидрокси-2-фенилпропановая (внутренний стандарт) (27,42), 45. пимелиновая (27,53), 46. 3-гидроксифенилуксусная (27,77), 47- 2-кето глутаровая (27,88), 48- 3-гидрокси-3-метилглутаровая (28,15), 49. 4-гидроксибензойная (28,22), 50. 4-гидроксифенилуксусная (28,46), 51. субериновая (28,62), 52. цисаконитовая (30,12), 53. ванилиновая (31,54), 54. гомованилиновая (31,64), 55. азелаино-вая (31,71), 56. гиппуровая (31,77), 57. 3,4-дигидрофенилуксусная (32,45). 58. лимонная (32,84), 59. метиллимонная (33,44), 60. ванилилминдальная (33,65), 61. ванилилпропионовая (34,14), 62. себациновая (34,55), 63. 4-гидроксифенил мол очная (34,61), 64. пальмитиновая (34,67), 65. 4-гидроксифенилпировиноградная (35,18).
Влияние недостаточности биотина на содержание фракций L-карнитнна в тканях и биологических жидкостях
Одним из значимых эффектов вальпроата в отношение фонда аминокислот являлось значительное увеличение концентрации в печени и мозге а-АВА, что может быть связано с активацией синтеза его основного предшественника — сс-кетобутирата из Thr, уровень которого в печени также заметно возрастал, а не из Met и Ser, поскольку коэффициент корреляции между концентрациями а-АВА и Thr был высокодостоверным (г = - 0,74). Введение карнитина нормализовало уровень а-АВА и снизило концентрации аминокислот-предшественников (Thr, Met и Ser).
Эффекты вальпроата в отношении пула серусодержащих аминокислот и их дериватов в печени выражались в увеличении уровня Таи и более чем 2-кратном снижении концентрации Cys, тогда как у крыс, получавших карнитин, нормализация уровня Cys сопровождалась значительным снижением содержания Таи и СА. Анализ корреляционных взаимоотношений Таи/СА, Tau/Cys, Tau/Ctn свидетельствует об активации биосинтеза Таи из Cys в печени крыс на фоне введения вальпроата (Таи/СА, г = - 0,81).
Структурная схожесть метаболитов вальпроата и а-кетокислот, по-видимому, лежит в основе его эффектов на обмен АРУЦ. Действительно, больные, получающие вальпроат экскретируют значительные количества дезаминированных метаболитов Val, Не и leu, а также производных Неметилбутирата и 2-метил-З-ОН-бутирата, что свидетельствует об ингибиро-вании вальпроатом ацил-КоА-дегидрогеназ, вовлеченных в катаболизм АРУЦ, а также коротко- и среднецепочечных жирных кислот (Anderson G.D. et а]., 1994). К тому же. карнитин играет существенную роль в обмене АРУЦ, что подтверждается наличием в тканях и физиологических жидкостях человека и животных промежуточных продуктов катаболизма этих аминокислот, идентифицированных в виде эфиров карнитина (Choi Y.R. et al., 1979; Veerkamp J.H. et al., 1985).
Окислительное декарбоксилирование а-кетокислот, являющихся продуктами дезаминирования АРУЦ катализируется дегидрогеназой разветвленных а-кетокислот, локализованной на внутренней митохондрнальной мембране. Реакция протекает с образованием соответствующих ацил-КоА, НАДН, С02 и утилизацией KoASH и НАД+. В свою очередь образование вальпроил-КоА из вальпроата, сопровождающееся секвестрацией свободного KoASH и изменением соотношения ацил-KoA/KoASH, предполагает вмешательство вальпроата в катаболизм АРУЦ на этапе декарбоксилирова-ния, что проявляется снижением катаболизма соответствующих а-кетокислот и накоплением аминокислот-предшественников (Thurston J.H. et а!., 1985). К тому же, снижение концентрации свободного карнитина и KoASH в тканях и увеличение отношения ацил-KoA/KoASH в печени при введении вальпроата, может потенцировать его эффекты в отношение обмена АРУЦ (Kesterson J.W. et al., 1984). Значительное снижение суммарного содержания АРУЦ в печени, мозге и сердце крыс, получавших карнитин на фоне введения вальпроата, предполагает и наличие низких концентраций соответствующих им а-кетокислот в митохондриях, что позволяет считать изменения содержании АРУЦ в печени карнитин-зависимыми. Можно предположить несколько механизмов участия карнитина в катаболизме АРУЦ: I) внутримитохондриальный биосинтез ацилкарнитинов из ацил-КоА и свободного карнитина ведет к регенерации свободного KoASH, не обходимого на этапе окислительного декарбоксилирования а-кетокислот; 2) карнитин может активизировать биосинтез ацилкарнитинов из ацил-КоА, увеличивая их транспорт из митохондрий, тем самым снижая внутримито-хондриальные концентрации соответствующих ацил-КоА и а-кетокислот -их предшественников; 3) не исключена активация дегидрогеназы разветвленных а-кетокислот путем ковалентной модификации ферментного комплекса карнитином. Действительно, изучение роли карнитина в обмене аминокислот с разветвленной углеводородной цепью (в частности Leu) в митохондриях, изолированных из различных тканей млекопитающих, выявило стимулирование окисления 2-кето-изокапроновой кислоты карнитином, сопровождавшееся аккумуляцией изовалерилкарнитина. Так как 2-кето-изокапроновая кислота является продуктом дезаминирования Leu, логично предположить, что карнитин стимулирует ее окисление, выводя аз мышечной ткани изовалериановую кислоту, образующуюся в этой реакции (Bremer J. и Davis J., \978; Hinsberg V.W. et. al., 1978). Характерно, что при сепсисе, индуцированном лигированием слепой кишки у крыс, карнитин препятствовал снижению концентрации в плазме крови аминокислот с разветвленной углеродной цепью (Val, Не, Leu) и Glu, интенсифицируя окисление жирных кислот, что подтверждалось увеличением уровня кетоновых тел, и соответствующим снижением использования аминокислот в качестве источников энергии (Hayashi N. et al., 1996).
В головном мозге крыс ряд изменений пула аминокислот также носил карнитин-зависимый характер. Известно, что для биосинтеза Glu в мозге необходимы доноры аминогрупп, в качестве которых выступают АРУЦ (главным образом Leu), легко проникающие через гематоэнцефалический барьер из системной циркуляции (Yudkoff М., 1997). Это подтверждается использованием N-меченных АРУЦ, обеспечивающих свыше 1/3 аминогрупп для синтеза Glu. Трансаминирование АРУЦ происходит в основном в астроцитах, где синтезируется G!u, а сс-кетокислоты, включая а кетоизокапроат, поступают в экстроцеллюлярную жидкость и захватываются нейроглией, в которой происходит ресинтез Leu. Этот процесс является основным механизмом, регулирующим концентрацию Glu в мозге. В настоящем эксперименте уровень Glu в мозге крыс, получавших вальпроат практически не менялся, однако концентрации Val и Не значительно повышались. Содержание Leu 8 мозге на фоне введения карнитина значительно возрастало, что свидетельствует о влиянии препарата на трансаминирова-ние АРУЦ, но не на их транспорт через гематоэнцефалический барьер, так как концентрация АРУЦ в плазме крови не менялась, что также свидетельствует о карнитин-зависимом характере изменения катаболизма Glu и АРУЦ в мозге.
Резюме Таким образом, вальпроат вызывает существенные изменения пула свободных аминокислот и их производных в тканях и плазме крови крыс, увеличивая концентрацию ароматических аминокислот и аминокислот с разветвленной углеводородной цепью в печени и мозге. Карнитин нормализует эти изменения, причем снижение аминокислот с разветвленной углеводородной цепью в ткани печени, мозга и сердца свидетельствует об активации их катаболизма.
![Роль ранней диагностики и терапии нарушений углеводного обмена у лиц с артериальной гипертензией и избыточным весом [Электронный ресурс]](/i/i/4273/189091.png "Роль ранней диагностики и терапии нарушений углеводного обмена у лиц с артериальной гипертензией и избыточным весом [Электронный ресурс] Ханова Алла Фаридовна")