Введение к работе
з
Актуальность исследования. К ключевым системам, обеспечивающим стратегию адаптации макроорганизма к постоянно изменяющимся условиям внутренней и внешней среды, относится система иммунитета. Одним из фундаментальных механизмов регулирования иммунных реакций является апопто-тическая гибель иммунокомпетентных клеток [Потапнев М.П., 2002], необходимая для установления баланса между их эффективным функционированием, с одной стороны, и своевременным и безопасным удалением - с другой.
Регуляция выживания и гибели иммунокомпетентных клеток осуществляется через цитокиновую сеть, представляющую собой систему клеточных медиаторов и их рецепторов, к числу которых относят интерфероны, колоние-стимулирующие факторы, трансформирующие ростовые факторы, хемокины и интерлейкины [Симбирцев А.С., 2004; Prasad T.S. et al, 2009].
Одним из ведущих цитокинов, определяющих жизнедеятельность иммунокомпетентных клеток, является интерлейкин-2 (IL-2), в течение долгого времени известный как ростовой фактор для Т-, В-лимфоцитов, NK-клеток и фагоцитов, обеспечивающий их функциональную активацию [Сенников СВ. и со-авт., 2004; Лебедев Л.Р. и соавт., 2007]. К настоящему времени установлено, что модулирующее влияние данного клеточного медиатора на танатогенную программу носит двойственный характер. Для объяснения выбора про- или антиапоптотического пути воздействия IL-2 была предложена теория обратной связи в контроле апоптоза Т-лимфоцитов, согласно которой указанный цитокин вызывает повышение чувствительности Т-лимфоцитов к апоптозу [Потапнев М.П., 2002]. Исход жизни клетки зависит от уровня антигенного и костимули-рующего воздействия. В случае его отсутствия экспрессия IL-2 и его клеточного рецептора угнетается. В результате этого клетки подвергаются апоптозу, связанному с нехваткой цитокина. Данный механизм ограничивает иммунный ответ после устранения патогена. При избытке антигенного воздействия может наступить антигениндуцированный апоптоз Т-клеток, обусловленный связыванием антигена с рецептором и опосредованный воздействием на активированный Т-лимфоцит Fas-лиганда и фактора некроза опухоли a [Walczak Н. et al., 1997].
Изменение продукции IL-2 и связанное с этим нарушение реализации та-натогенной программы является причиной многих патологических процессов. Так, избыточная экспрессия IL-2 и IL-2R обнаруживается у большинства опухолевых клеток, потерявших способность к апоптозу, что дает основания рас-
сматривать данный цитокин в качестве одного из факторов, способствующих малигнизации [Reichert Т.Е. et al., 1998; Eriksen К. et al., 2001]. Высокая интенсивность программированной гибели лимфоцитов, сопровождаемая угнетением продукции IL-2, выявлена при инфекционной патологии. Так, при гепатите С происходит изменение содержания цитозольного Са , определяющего активность транскрипционного фактора NFAT и, соответственно, промотора гена IL-2 [Bergqvist A., Rice СМ., 2001; Jerome K.R., 2008]. При коровьей оспе отмечается блокирование TcR-индуцированной активации NFAT/АР 1 элемента промотора гена IL-2 [Alonso A.S. et al, 2003].
Для моделирования дисбаланса системы IL-2-IL-2R используются различные приемы, к числу которых относятся нокаутирование гена IL-2 и его рецептора, конструирование генов (3- и у-субъединиц IL-2R и др. [Fanzo J.C. et al., 2006]. Доступным методом, позволяющим изучать молекулярные механизмы проведения сигнала от данного рецепторного комплекса, является культивирование лимфоцитарных клеток в присутствии рекомбинантного IL-2.
Следует признать, что в настоящее время молекулярные механизмы диз-регуляции системы IL-2-IL-2R изучены недостаточно, а имеющиеся в литературе данные в рамках обсуждаемой проблемы носят весьма неоднозначный характер. В связи с этим важным становится исследование молекулярных механизмов IL-2-опосредованных нарушений апоптоза лимфоцитов для поиска новых патогенетически обоснованных технологий управления гибелью клеток.
Цель исследования: выявить роль и молекулярные механизмы участия интерлейкина-2 в регуляции апоптоза лимфоцитов крови.
Задачи исследования:
Установить особенности реализации апоптоза лимфоцитов крови при действии рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека in vitro в концентрациях от 0,1 до 1,0 нг/мл.
Оценить внутриклеточный уровень активных форм кислорода и состояние трансмембранного потенциала митохондрий при интерлейкин-2-зависимой гибели лимфоцитов крови.
Определить роль белков семейства Вс1-2, транскрипционных факторов NFkB, Р53 и ингибитора циклинзависимых киназ Р21 в регуляции апоптоза, опосредованного интерлейкином-2.
Провести сравнительную оценку состояния молекулярных механизмов интерлейкин-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов при добавлении рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека in vitro и при патологическом про-
цессе, сопровождающемся нарушениями в системе интерлейкина-2 (у пациентов с клещевым энцефалитом).
Научная новизна. Получены новые данные фундаментального характера о влиянии интерлейкина-2 на реализацию апоптоза лимфоцитов крови в зависимости от концентрации цитокина и условий культивирования. Впервые определены молекулярные мишени интерлейкин-2-опосредованной регуляции апоптотической гибели. Установлено, что рекомбинантный интерлейкин-2 в конечных концентрациях от 0,1 до 1,0 нг/мл дозозависимо оказывает проапоп-тотическое действие на лимфоциты крови и проявляет протективный эффект в отношении дексаметазониндуцированного апоптоза данных клеток. Показано, что в культуре лимфоцитов у здоровых доноров, инкубированных с 0,1 нг/мл рекомбинантного интерлейкина-2, повышено количество клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий на фоне накопления в них активных форм кислорода, снижения уровня антиапоптотических белков-регуляторов Вс1-2 и Всі-Xl, активации транскрипционных факторов NFkB и Р53.
Впервые выявлено, что индукция апоптоза иммунокомпетентных клеток крови при остром клещевом энцефалите, сопровождающемся повышенной продукцией и сниженной рецепцией лимфоцитами интерлейкина-2, обусловлена участием NFkB, Р53 и митохондриальных факторов (увеличение числа клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, повышение внутриклеточного уровня активных форм кислорода, дисбаланс белков семейства Bcl-2).
Показана унификация молекулярных механизмов апоптоза иммунокомпетентных клеток как при дисбалансе системы интерлейкина-2 в условиях in vitro, так и при инфекционном процессе (клещевой энцефалит).
Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования расширяют фундаментальные знания о характере изменения программированной гибели клеток под действием рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека в зависимости от его концентрации и состояния клеточного микроокружения. Полученные фактические данные раскрывают молекулярные механизмы интерлейкин-2-опосредованной регуляции апоптотической гибели лимфоцитов, связанные с активацией митохондриального пути и обусловленные участием транскрипционных факторов (NFkB и Р53) и белков семейства Вс1-2. Основные положения исследования могут служить основой для создания
молекулярных технологий управления функциями иммунокомпетентных клеток с использованием цитокинов.
Положения, выносимые на защиту:
Рекомбинантный интерлейкин-2 человека оказывает дозозависимые эффекты на реализацию апоптоза иммунокомпетентных клеток: количество апопто-тических клеток в культуре лимфоцитов изменяется однонаправленно с концентрацией цитокина в диапазоне 0,1-1,0 нг/мл и обратнопропорционально его дозе на фоне действия дексаметазона.
Дисбаланс системы интерлейкина-2 при культивировании лимфоцитов крови здоровых доноров с рекомбинантной формой данного цитокина и при клещевом энцефалите сопровождается модуляцией апоптотической гибели лимфоцитов крови, реализующейся при участии митохондриальных факторов, активных форм кислорода, NFkB, Р53 и обусловленной смещением баланса Вс1-2-белков в сторону проапоптотических.
Апробация материалов диссертации. Результаты исследования были доложены и обсуждены на VIII и X Конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007, 2009), XIII и XV Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2007, 2009), IV Объединенном иммунофоруме (Санкт-Петербург, 2008), X Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), XIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009).
Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунной системы», «Воспаление»), фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Патофизиология клетки», «Типовые патологические процессы», «Роль апоптоза клетки в патологии»), кафедры морфологии и общей патологии (раздел «Инфекция и иммунитет») ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.
Работа выполнена в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по темам «Работа по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем с участием научных организаций Японии» (ГК № 02.512.11.2285), «Проведение научных исследований коллективами на-
учно-образовательных центров в области фундаментальной медицины и физиологии» (ГК № 02.740.11.0311), а также при финансировании РФФИ «Разработка способов направленной коррекции дизрегуляции пролиферации и апоптоза нормальных и патологически измененных клеток с помощью регуляторных молекул» (№ 09.04.99025) и Совета по грантам при Президенте РФ по государственной поддержке научных исследований молодых российских ученых-докторов наук по теме «Молекулярные механизмы цитокинопосредованной дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при поляризации иммунного ответа по ТЫ- или Т1і2-пути» (МД-3842.2009.7) и ведущих научных школ РФ по теме «Роль генетически детерминированной реакции системы крови в патоморфозе инфекционных заболеваний» (НШ-2334.2008.7).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 6 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 280 источников, из которых 226 - иностранных авторов. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 24 рисунками.
Личный вклад автора. Анализ литературных данных по теме диссертации, планирование исследования, выделение и культивировпние лимфоцитов крови, оценка продукции лимфоцитов крови и его рецепторов, апоптоза лимфоцитов крови, количества клеток со сниженным уровнем потенциала мито-хондриальной мембраны, содержания активных форм кислорода, факторов транскрипции и белков регуляторов апоптоза в лимфоцитах крови, статистический анализ результатов, написание диссертации выполнены лично автором.
