Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Аутоиммунные тиреопатии: причины и механизмы развития, клинико-иммунологические особенности
1.1.1. Этиология, патогенетические и клинико-иммунологические особенности аутоиммунного тиреоидита
1.1.2. Современные аспекты этиопатогенеза и клиникоиммунологические особенности диффузного токсического зоба
1.2. Роль окислительного стресса в развитии аутоиммунной патологии щитовидной железы
1.2.1. Механизмы, регуляция и продукты перекисного окисления липидов
1.3. Апоптоз и его роль в развитии аутоиммунных тиреопатии 43
1.3.1. Морфологические этапы апоптоза 45
1.3.2. Механизмы запуска и реализации апоптоза 47
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 58
2.1. Характеристика групп исследования 5 8
2.2. Материал и методы исследования 59
2.2.1. Выделение лимфоцитов из периферической крови 60
2.2.2. Определение показателей системы глутатиона 60
2.2.3. Определение активности супероксиддисмутазы 63
2.2.4. Определение активности каталазы 63
2.2.5. Определение содержания супероксидного анион-радикала 64
2.2.6. Определение концентрации нитритов 64
2.2.7. Определение содержания перекиси водорода 65
2.2.8. Определение содержания ТБК-активных продуктов (ТБК-а)
2.2.9. Определение диеновых конъюгатов 66
2.2.10. Определение количества белка в лизате клеток биуретовым методом
2.2.11. CD-типирование лимфоцитов периферической крови 66
2.2.12. Детекция апоптотических клеток с помощью набора ANNEXINVFITC
2.2.13. Определение аутоантител к тиреопероксидазе в сыворотке крови
2.2.14. Определение концентрации тиреотропного гормона (ТТГ) в сыворотке крови
2.2.15. Определение концентрации свободной фракции тироксина (свТ4) в сыворотке крови
2.2.16. Статистическая обработка результатов 69
ГЛАВА 3. Результаты исследования 71
3.1. Характеристика тиреоидного статуса пациентов с аутоиммунными тиреопатиями
3.2. Показатели активности свободнорадикального окисления в лимфоцитах периферической крови у больных аутоиммунными тиреопатиями
3.3. Показатели активности антиоксидантной системы в лимфоцитах периферической крови у больных аутоиммунными тиреопатиями
3.4. Содержание СБ95+-лимфоцитов в периферической крови у больных аутоиммунными тиреопатиями
3.5. Уровень апоптотических лимфоцитов в периферической крови у больных аутоиммунными тиреопатиями первой возрастной группы
3.6. Показатели субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у больных аутоиммунными тиреопатиями
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 91
Выводы 126
Список литературы
- Этиология, патогенетические и клинико-иммунологические особенности аутоиммунного тиреоидита
- Роль окислительного стресса в развитии аутоиммунной патологии щитовидной железы
- Определение активности супероксиддисмутазы
- Показатели активности антиоксидантной системы в лимфоцитах периферической крови у больных аутоиммунными тиреопатиями
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время аутоиммунные тиреопатии (АИТП) остаются одной из наиболее актуальных проблем современной эндокринологии, что во многом объясняется не только достаточно высоким уровнем заболеваемости лиц разного возраста, но и многочисленностью органов и систем, реагирующих на воздействие тиреоидных гормонов и вовлекаемых в патологический процесс при нарушении их продукции. Однако остаются нерешенными вопросы, касающиеся патогенетических механизмов, объективных и надежных методов диагностики, прогноза и профилактики заболеваний щитовидной железы [Аппельганс Т.В., Маклакова Т.П., 2006; Кияев А.В. и соавт., 2006; Фадеев В.В. и соавт., 2007].
Диффузный токсический зоб (болезнь Грейвса) и аутоиммунный тиреоидит являются наиболее распространенными аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы, имеющими сходную этиологию, но различный патогенез, специфичность которого на уровне организма проявляется, в том числе, различающимся уровнем продукции тиреоидных гормонов [Петунина Н.А., 2002; Петунина Н.А., 2003; Кияев А.В. и соавт., 2007; Кандрор В.И., 2008].
Исследованиями последних лет определен ряд специфических структурно-функциональных особенностей клеток щитовидной железы. Тиреоциты относятся к немногочисленным клеткам, метаболизм которых предполагает постоянное образование высоких концентраций активных форм кислорода (АФК) в ответ на физиологическое стимулирующее действие тиреотрошюго гомона. В этой связи поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза представляется чрезвычайно важным условием сохранения структурной целостности и жизнедеятельности тиреоцитов [Martiner-Cayuela М., 1995]. Существенную опасность в аспекте АИТП представляют также опосредованные свободными радикалами деструкция и преждевременная гибель иммунокомпетентных клеток, регулирующих силу иммунного ответа, что ведет к срыву процессов иммунологической толерантности с формированием антитиреоидного аутоиммунитета [Нагоев Б.С. и соавт., 2002; Петунина Н.А., 2003].
В условиях окислительного стресса судьба клетки определяется совокупностью различных адаптационных метаболических процессов, индуцированных как воздействием АФК, так и конституциональными, генетическими особенностями ее защитных биохимических систем. К числу механизмов активации прооксидантных реакций в организме относится функциональная недостаточность системы антиоксидантной защиты клеток, одного из первостепенных «охранных» эшелонов, обеспечивающих
у\р
поддержание свободнорадикального окисления на стационарном уровне. Механизмы антиоксидантной защиты универсальны и одинаковы для всех типов клеток независимо от их структурно-тканевой организации [Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006]. Это объясняет возросший интерес к поиску способов поддержки и стимуляции этих процессов с целью повышения жизнеспособности клеток при угрозе их повреждения. В последние годы в литературе появились сообщения об антиокислительных свойствах тиреоидных гормонов, их способности предотвращать свободно-радикальное окисление ДНК, белков хроматина и ферментов ДНК-репарации, препятствовать гибели клеток [Арутюнян А.В. и соавт., 2000].
Общеизвестно, что одной из форм ответной реакции клетки на стрессирующее воздействие, причиной которого могут быть повреждение ДНК и других структурных элементов клетки, отсутствие необходимых факторов роста, гормонов, цитокинов и др., является активация программированной суицидальной программы клетки - апоптоза [Москалева Е.Ю., Северин С.Е., 2006]. Актуальность проблемы апоптоза определяется сопряженностью нарушений его регуляции с широким спектром заболеваний, в том числе АИТП. Накопление в клетке АФК предшествует апоптозу, что свидетельствует о существенной значимости окислительных процессов в реализации этого феномена [Зенков Н.А. и соавт., 2001].
Вместе с тем, сведения, касающиеся механизмов гиперактивации реакций окисления и их роли в развитии иммунного дисбаланса при АИТП и в патогенезе заболеваний щитовидной железы в целом, являются немногочисленными и фрагментарными. Нет четких указаний на связь между активностью про- и антиоксидантной систем с апоптозом иммунокомпетентных клеток при аутоиммунном тиреоидите и диффузном токсическом зобе. Вскрытие же механизмов окислительного дисбаланса при АИТП, их взаимосвязи с активностью процессов апоптоза и дизрегуляцией продукции тиреоидных гормонов не только позволит получить новые фундаментальные знания о патогенезе аутоиммунного повреждения щитовидной железы, по и может оказаться основой для разработки новых подходов как в диагностике, прогнозировании течения и исходов, так и к терапии АИТП, направленной на медикаментозный контроль аутодеструктивных процессов.
Цель исследования: установить типовые проявления прооксидантно-антиоксидантного дисбаланса в лимфоцитах периферической крови и его роль в иммунопатогенезе аутоиммунных тиреопатий в подростковом и зрелом возрасте.
Задачи исследования: 1. Установить общие закономерности и особенности нарушений прооксидантно-антиоксидантного равновесия, апоптоза и CD-
субнопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у подростков 13-17 лет и взрослых пациентов 18-50 лет с аутоиммунным тиреоидитом и диффузным токсическим зобом.
Определить взаимосвязь показателей свободнорадикального окисления, антиоксидантной защиты, апоптоза и CD-фракционного состава лимфоцитов периферической крови при аутоиммунном тиреоидите с активностью аутоиммунного процесса.
Дать комплексную оценку значимости прооксидаитно-антиоксидантного дисбаланса в модуляции апоптоза и CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови у пациентов подросткового и зрелого возраста с аутоиммунным тиреоидитом и диффузным токсическим зобом.
Научная новизна. По итогам сравнительной оценки показателей
нрооксидаптію-аптиоксидаїгпіого состояния и апоптоза лимфоцитов
периферической крови у лиц зрелого и подросткового возраста при
аутоиммунном тиреоидите и диффузном токсическом зобе установлено, что
их изменения являются однонаправленными, но более выраженными при
эутиреозе и гииертиреозе у взрослых больных, чем у подростков. При этом у
взрослых больных при аутоиммунном тиреоидите в фазе эутиреоза и
диффузном токсическом зобе активация свободнорадикального окисления
(увеличение концентрации супероксидного анион-радикала, Н2Ог) и
липопероксидации в условиях дефицита оксида азота и активности
антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, каталазы,
глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы) в лимфоцитах крови имеет
более выраженный характер, чем при субклиническом гипотиреозе на фоне
заместительной терапии. У подростков течение аутоиммунных тиреонатий не
сопровождается активацией перекисного окисления липидов в связи с
компенсаторным увеличением в лимфоцитарных клетках активности
глутатионпероксидазы при эутиреозе (в сочетании с дефицитом каталазы и
глутатионтрансферазы) и глутатионредуктазы при гипертиреозс (при
снижении концентрации восстановленного глутатиона).
Продемонстрировано, что недостаточность активности антиоксидантных ферментов в лимфоцитах при тиреопатиях определяет сопряженную с активностью аутоиммунного процесса предрасположенность клеток к Fas-зависимому апоптозу (сопряженную с уровнем антитиреоидных антител при эутиреозе), о нарушении реализации которого у пациентов зрелого возраста свидетельствует уменьшение числа annexin У+-клеток в крови. При этом дефицит активности антиоксидантов в сочетании с профицитом активных метаболитов кислорода в лимфоцитах крови рассматривается в качестве одного из факторов апоптоза и CD-субпопуляционного (Т- и В-клеточного) дисбаланса, более выраженного при гипертиреозе, чем при аутоиммунном тиреоидите как у подростков, так и у взрослых больных.
Практическое и теоретическое значение работы. Получены новые фундаментальные знания о роли прооксидантно-антиоксидантного дисбаланса в иммунопатогенезе аутоиммунных тиреопатий в зависимости от функционального состояния щитовидной железы, активности гуморального антитиреоидного аутоиммунитега и возраста больных (подростки, взрослые). Установленные данные могут служить основой для коррекции программы лечебно-реабилитационных мероприятий у больных с аутоиммунной патологией щитовидной железы, а также обосновывают необходимость применения при эутиреозе антиоксидаптной терапии для профилактики дальнейшего прогрессирования аутоиммунного процесса и развития гипотиреоза.
Положения, выносимые на защиту:
Нарушения прооксидантно-антиоксидантного равновесия, апоптоза и CD-субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови при аутоиммунном тиреоидите и диффузном токсическом зобе носят однонаправленный характер, но более выраженный у взрослых больных с эу- и гипертиреозом, чем у подростков.
У больных зрелого возраста с аутоиммунным тиреоидитом в фазе эутиреоза и диффузным токсическим зобом уровень прокосидантно-антиоксидантного дисбаланса, проявляющийся увеличением концентрации 0{, Н2Ог, ТБК-активных продуктов на фоне дефицита оксида азота, активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы и глутагионтрансферазы в лимфоцитах периферической крови, выше, чем при аутоиммунном тиреоидите в фазе гипотиреоза.
У подростков с диффузным токсическом зобом дефицит антиоксидантов в лимфоцитах крови менее выражен, чем при аутоиммунном тиреоидите, что в совокупности с повышением активности глутатионпероксидазы при эутиреозе и глутатионредуктазы при гипертиреозе обусловливает нормальный уровень перекисного окисления липидов в клетках.
Снижение активности антиоксидантних ферментов и накопление продуктов свободнорадикального окисления в лимфоцитах периферической крови при аутоиммунных тиреопатиях определяют сопряженную с активностью антитиреоидного аутоиммунитета предрасположенность клеток к Fas-зависимому апоптозу, нарушение реализации которого опосредует повышение количества CD20+ В-лимфоцитов в крови.
Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2006, 2007), VII Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке»
(Томск, 2006), научно-практическом симпозиуме с международным участием «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2008), а также на научно-образовательных семинарах «Патофизиология системы крови и иммунитета» при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2008). Основные положения и выводы диссертации используются в учебном процессе в Сибирском государственном медицинском университете на кафедре патофизиологии в тематических разделах «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Патофизиология системы крови» и на кафедре эндокринологии и диабетологии в лекционных и практических курсах по теме «Аутоиммунные тиреопатии».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, 4 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 12 таблицами. Библиографический указатель включает 160 источников, из них 102 отечественных и 58 зарубежных авторов.
Этиология, патогенетические и клинико-иммунологические особенности аутоиммунного тиреоидита
К числу наиболее распространенных аутоиммунных заболеваний щитовидной железы относятся тиреоидит Хасимото (аутоиммунный тиреоидит, АИТ) и диффузный токсический зоб (болезнь Грейвса, ДТЗ). Оба заболевания характеризуются лимфоидной инфильтрацией щитовидной железы и наличием в сыворотке крови антитиреоидных антител. Аутоиммунные заболевания щитовидной железы являются классической моделью органоспецифической патологии [Mariotti S. et al., 2000].
Коренное различие между этими заболеваниями заключается в том, что при ДТЗ происходят активация и пролиферация тиреоцитов, а при АИТ - их гибель и замещение лимфоидными элементами [Савченко А.А. и соавт., 2003].
Щитовидная железа поражается аутоиммунным процессом чаще любого другого органа. Вероятно, это связано с особенностью ее эмбриогенеза. Согласно клонально-селекционной теории Бернета (1959), отсутствие реакции на собственные антигены объясняется устранением «запрещенных» клонов лимфоцитов в эмбриональном периоде. Однако не все ткани контактируют с иммунокомпетентными клетками в период эмбриогенеза. Исключение составляют ткани щитовидной железы, хрусталика, семенников, мозга. Следовательно, к ним появляются «запрещенные» клоны лимфоцитов, которые при нарушении целостности тканевых барьеров могут инициировать аутоиммунный процесс [Бернет Ф., 1971].
R. Volpe в 1977 г. была предложена гипотеза развития аутоиммунных заболеваний щитовидной железы, разработанная на основе клонально-селекционной теории Бернета (1959). Она состоит в следующем: заболевание обусловленно частичным дефектом иммунологического надзора, что связано со специфическим дефицитом Т-лимфоцитов-супрессоров (CD8+) и активацией Т-хелперов (CD4+). Этот дефект допускает выживание «запрещенного» клона органоспецифических Т-лимфоцитов, появляющихся в результате случайной мутации [Volpe R., 1986; Петунина Н.А., 2002]. «Запрещенным» называется клон лимфоцитов, способных к взаимодействию с собственными антигенами организма. «Запрещенный» клон Т-лимфоцитов взаимодействует с комплементарными органными антигенами (антигенами рецепторного аппарата фолликулярного эпителия), оказывая повреждающее действие на клетки-мишени и запуская тем самым локализованный иммунный процесс по типу гиперчувствительности замедленного типа [Volpe R., 1986; Петунина Н.А., 2002; Валдина Е.А., 2006].
Существует точка зрения, согласно которой, аутоиммунное поражение тимуса является основой всех аутоиммунных процессов гуморального типа. Практически при всех аутоиммунных заболеваниях с аутоиммунном компонентом в тимусе обнаруживаются проявления аутоиммунного тимита с накоплением В-лимфоцитов, иммунных комплексов, поражением лимфоцитов и эпителия. Вероятно, последовательность выглядит следующим образом: на первом этапе аутоиммунное поражение тимуса ведет к снижению продукции гормонов тимуса и далее - к ослаблению активности наиболее чувствительных к их дефициту Т-лимфоцитов-супрессоров, что определяет ослабление силы иммуносупрессорных влияний и является причиной дальнейшей генерализации аутоиммунного процесса.
В результате нарушения иммунологической толерантности аутореактивные лимфоциты (CD4+- и С08+-Т-лимфоциты) посредством адгезивных молекул (ICAM-1, ICAM-2, Е-селектина, VCAM-1, LFA-3, LFA 1, CD44) инфильтрируют паренхиму щитовидной железы, где распознают ряд антигенов, которые презентируются дендритными клетками, макрофагами, В-лимфоцитами, HLA-DR-экспремирующими фолликулярными клетками. В дальнейшем цитокины и сигнальные молекулы инициируют антигенспецифическую стимуляцию В-лимфоцитов, в результате чего начинается продукция специфических иммуноглобулинов против различных компонентов тиреоцитов [Weetman А.Р., 2000; Volpe R., 2000].
Соотношение провоспалительных и противовоспалительных цитокинов играет важную роль в поддержании иммунного гомеостаза, их дисбаланс вносит значительный вклад в патогенез аутоиммунных заболеваний [Ajjan R.A, Weetman А.Р., 2003]. Провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухолей альфа a (TNF - tumor necrosis factor), интерлейкины (IL) 1 и 6, активируют пролиферацию CD20+-B- и Т-лимфоцитов, повышают экспрессию рецептора IL-2 на цитотоксических лимфоцитах (CD8+), продукцию IL-2 Т-клетками и иммуноглобулинов В-клетками [Глазанова Т.В. и соавт., 2004]. IL-2 отводится важная роль в преодолении иммунологической аутотолерантности неактивных Т-лимфоцитов к собственным антигенам [Yoshikawa N. et al., 1995]. Существенный вклад в развитие заболевания вносит интерферон гамма (IFNy), который индуцирует экспрессию HLA класса II на мембранах тиреоцитов одновременно с презентацией на клетках тиреоцитарных антигенов, активацией внутритиреоидных С04+-Т-лимфоцитов, В-клеток и последующей выработкой антител к представленным антигенам [Matsubayashi S. et al., 1990; Благосклонная Я.В. и соавт., 1998].
В последнее время изучается взаимосвязь между аутоиммунными заболеваниями, антигенами главного комплекса гистосовместимости и специфическими генами иммунного ответа (1г-гены). Ir-гены могут быть разделены на два основных класса:
Первая группа Ir-генов представляет большой интерес с точки зрения объяснения предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям. Возможно существование Ir-генов, которые обуславливают образование Т-лимфоцитов с аномальной ответной реакцией на органоспецифический антиген, высвобождающийся под действием минимальной неспецифической травмы органа [Александрова Г.Ф., Внотченко С.Л., 2004].
Антитела к щитовидной железе, судя по всему, не играют ключевой роли в инициации её аутоиммунного повреждения при АИТ, а появляются в процессе аутоиммунной агрессии, когда происходит деструкция тиреоцитов Т-клетками [Weetman А.Р., Мс Gregor A.M., 1994]. Однако ДТЗ характеризуется появлением аутоантител к рецепторам плазматических мембран тиреоцитов, родственных к рецепторам тиреотропина. Они оказывают на щитовидную железу стимулирующее действие, аналогичное действию тиреотропина [Кандрор В.И., 2008].
Роль окислительного стресса в развитии аутоиммунной патологии щитовидной железы
Ионы железа играют важную роль в метаболизме. Они обеспечивают транспорт кислорода (гемоглобин), его использование (цитохромы, цитохромоксидаза), а также выполнение других важных функций (негемовые железосодержащие белки). Однако в реакциях ПОЛ железо играет двойную роль: с одной стороны, способствуют развитию процесса, с другой — ингибируют его. Конечный эффект зависит от концентрации ионов в системе. До концентрации 2-Ю"4 моль/л процесс ПОЛ ускоряется, при более высокой концентрации Fe2+ проявляется его антиоксидантное действие [Суханова Г.А., Серебров В.Ю., 2000].
В нормальных условиях подавляющая часть молекулярного кислорода (более 90%) потребляется митохондриальной цитохромоксидазой в ходе 4-электронного восстановления с образованием 2 молекул воды. Однако по своим свойствам молекула кислорода способна и к одно-электронному восстановлению, образуя при этом радикал, который несет неспаренный электрон, так называемый «супероксид-анион кислорода». Такая форма частично восстановленного кислорода может образовываться при взаимодействии кислорода с промежуточными компонентами дыхательной цепи - убихинонами, но величина «утечки» невелика: в нормальных условиях она составляет менее 5%.
Супероксидный радикал кислорода не несет существенной опасности для клетки: он обладает малой реакционной способностью, к тому же ткани обычно содержат супероксиддисмутазу (СОД), которая быстро дисмутирует его в пероксид водорода. Однако при недостатке СОД в присутствии металлов переменной валентности может протекать спонтанная дисмутация супероксида. Она сопровождается появлением синглетного кислорода в качестве побочного продукта [Dubey A., Forster M.J., Sohal R.S., 1996].
Таким образом, при нормальном течении метаболизма супероксид-анион в клетках не накапливается. Опасность может представлять то обстоятельство, что он плохо проникает через клеточную мембрану и его содержание может увеличиваться в условиях, когда повышенная скорость образования свободных радикалов или редуцированная способность антиоксидантной системы клетки приводит к увеличению стационарного уровня радикальных соединений.
Еще одной свободнорадикальной формой, ферментативно вырабатываемой в клетках, является оксид азота - NO. Окисление атомом кислорода аминокислоты L-аргинина в присутствии фермента - синтазы окиси азота (NO-синтазы) приводит к образованию NO. Данные последних лет показывают, что эндогенная окись азота — важнейший фактор неспецифической резистентности макроорганизма при внутриклеточных инфекциях. Дефицит окиси азота внутри фагоцитирующих клеток - одна из главных причин незавершенности фагоцитоза и размножения микробов внутри фагоцитов. Малые размеры молекулы N0 позволяют ей беспрепятственно проникать сквозь клеточные мембраны без участия рецепторов. Высокие концентрации NO оказывают цитотоксическое или цитостатическое действие на любую клетку, не дифференцируя, является ли она нормальной клеткой хозяина или микробом. Период ее полураспада исчисляется секундами, поэтому ее действие распространяется только на близлежащие клетки. Внутри клетки-мишени она метаболизируется до нитритов, нитратов и других промежуточных продуктов распада окиси азота. Они легко связываются с другими радикалами и белковыми молекулами, в состав которых входит железо. Взаимодействуя с низкомолекулярными тиолами, он образует моно- и динитрозильные комплексы, являющиеся токсическими для клетки. Мононитрозоглутатион может вызывать программированную смерть клеток — апоптоз, а динитрозильные комплексы повреждают SH-содержащие белки и вызывают гибель клетки [Болдырев и соавт., 1997].
Взаимодействуя с супероксид-анионом, оксид азота может образовывать нерадикальное соединение - пероксинитрит. Несмотря на свою нерадикальную природу, пероксинитрит не является нейтральным соединением. Он представляет собой один из факторов, приводящих клетку к апоптозу. Неясно, действует ли при этом он как таковой, или за счет гидроксидрадикала, который легко образуется из пероксинитрита, особенно в кислой среде. Токсичность пероксинитрита проявляется и в том, что в своей ионизированной форме он окисляет SH-группы, а его производное осуществляет нитрование тирозиновых группировок белков, тем самым, выводя их из-под контроля тирозиновых киназ.
Таким образом, целый ряд нарушений метаболизма на клеточном уровне приводит к повышенной генерации свободнорадикальных соединений. Кроме уже упомянутых ранее источников супероксида имеются также система цитохрома Р450 и циклоксигеназный путь окисления арахидоновой кислоты, и некоторые ферменты (в том числе моноаминооксидазы). Сходные процессы образования супероксид-аниона наблюдаются в ходе микросомального окисления, в котором принимают участие восстановленные формы цитохрома b и цитохрома Р450.
Для защиты от избыточной интенсивности ПОЛ в организме существует антиоксидантная система (АОС). Антиоксидантная система включает как низкомолекулярные антиоксиданты, так и антиоксидантные ферменты. Из них гидрофильные - восстановленный глутатион (GSH) и аскорбиновая кислота — находятся в водной фазе клетки и защищают вещества гиалоплазмы и матрикса митохондрий, а гидрофобные антиоксиданты защищают мембраны. Эти вещества перехватывают свободные радикалы, восстанавливают АФК и продукты окислительной модификации. Среди низкомолекулярных антиоксидантов важную роль играют пищевые вещества: витамины С, Е и каротины. Такими же свойствами обладают ураты и билирубин [Кулинский В.И., 1999; Зенков Н.К., 2001]. Обнаружено, что у больных в активной стадии ДТЗ происходит активация ПОЛ и снижение содержания одного из мощных антиоксидантов - а-токоферола в плазме, а в эритроцитах этот показатель оказывается сниженным как до лечения, так и на фоне тиреостатической терапии [Тишенина Р.С. и соавт., 2000].
Описаны антиоксидантные свойства тиреоидных гормонов, которые реализуются в защите от СРО ДНК, белков хроматина и ферментов репарации ДНК, влиянии на синтез прооксидантных и антиоксидантных ферментов и белков, подавлении индукции свободных радикалов [Арутюнян А.В. и соавт., 2000]. Антиоксидантный эффект может определяться не только гормональной активностью, но и химическим строением гормонов. Имея фенольную структуру, гормоны щитовидной железы, как и другие стероидные гормональные вещества, могут действовать как истинные антиоксиданты. В основе механизма действия таких антиоксидантов лежит реакция взаимодействия молекулы ингибитора непосредственно с радикалом, ведущим цепь окисления. Ингибирование заключается в образовании устойчивого радикала-ингибитора, неспособного вступать в новые свободнорадикальные реакции [Галкина О.В. и соавт., 2000]. В эксперименте показано, что небольшие дозы тиреоидных гормонов снижают интенсивность ПОЛ в миокарде за счет увеличения активности СОД и каталазы [Bozhko А.Р., Gorodetskaia I.V., 1998].
Антиоксидантные ферменты играют важную роль в защите организма от повреждающего воздействия продуктов СРО. Обычно выделяют три линии защиты: 1) супероксиддисмутаза; 2) селеновая глутатионпероксидаза (ГП) и каталаза; 3) ГП и глутатионтрансферазы, а также недавно обнаруженная фосфолипидгидропероксид-ГП [Кулинский В.И., 1999].
Определение активности супероксиддисмутазы
Для выделения лимфоцитов из крови в качестве градиента плотности использовали фиколл-урографин (1,077 г/см ). Взятую из локтевой вены кровь смешивали с гепарином (25 Ед/мл) и наслаивали на градиент в соотношении 1:1. Пробы центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин. Образовавшееся лимфоцитарное кольцо осторожно через верхний слой плазмы собирали, переносили в пробирку и дважды отмывали от градиента раствором Хенкса, каждый раз центрифугируя 10 мин при 1000 об/мин, с последующем приготовлением лизата
Принцип метода. Метод основан на способности кислоторастворимых тиоловых группировок при взаимодействии с 5,5-дитиобис-(-2-нитробензойной) кислотой (ДТНБ) образовывать окрашенное соединение — тио-2-нитробензойную кислоту, водный раствор которого имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм.
Ход определения. К 0,3 мл лизата клеток добавляли 0,1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Отбирали 0,3 мл супернатанта и переносили в пробирки, содержащие 2,45 мл 0,1М трис-НСЬ-буфера с 0,01% ЭДТА, рН=8,5. К полученной смеси добавляли 0,025 мл раствора ДТНБ. После перемешивания пробы фотоколориметрировали против дистиллированной воды при длине волны 412 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см.
Расчет концентрации восстановленного глутатиона осуществляли с использованием молярного коэффициента светопоглощения є=13б00 М- хсм" 1 и выражали в нмоль/мг белка.
Определение активности глутатионпероксидазы
Принцип метода основан на способности глутатионпероксидазы катализировать реакцию взаимодействия восстановленного глутатиона с гидроперекисью трет-бутила (ГПТБ). Активность при этом может быть оценена по изменению содержания восстановленного глутатиона в пробах до и после инкубации с модельным субстратом с помощью цветной реакции с дитиобис-нитробензойной кислотой (ДТНБ).
Ход определения. 0,3 мл лизата клеток смешивали с 0,73 мл 0,1М трис-НС1 -буфера (рН=8,5; в 1 мл буфера содержалось 0,1 мг ЭДТА, 0,78 мг NaN3 и 1 мг TSH) и инкубировали в термостате при 37С в течение 10 мин. Реакцию запускали внесением 70 мкл 0,14% раствора ГПТБ. После инкубации в течение 5 мин при при 37 С реакцию останавливали внесением в пробирки по 0,2 мл 20% раствора ТХУ. Пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин, супернатант использовали для определения количества восстановленного глутатиона. Для этого 0,5 мл супернатанта переносили в пробирки, содержащие 2,25 мл 0,1 М трис-НСЬ-буфера с 0,01% ЭДТА, рН=8,5. К полученной смеси добавляли 0,025 мл раствора ДТНБ. После перемешивания пробы фотоколориметрировали против дистиллированной воды при длине волны 412 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. В контрольные пробы вместо лизата клеток вносили эквивалентное количество НгО. Активность фермента выражали в мкмоль / (мин-мг белка).
Определение активности глутатионредуктазы Принцип метода основан на каталитическом НАДФ-Н-зависимом преобразовании глутатинредуктазой окисленной формы глутатиона в восстановленную, интенсивность которого может быть оценена по скорости снижения экстинкции проб при длине волны 340 нм, на который раствор НАДФ-Н имеет максимум светопоглощения (тест Варбурга).
Ход определения. 0,3 мл лизата клеток вносили в кювету спектрофотометра с длиной оптического пути 10 мм, содержащую 1,8 мл 0,1М калий-фосфатного буфера (рН=7,0), с 1мМ ЭДТА и 0,1 мл раствора окисленного глутатиона. Инициировали реакцию добавлением 0,1 мл раствора НАДФ-Н. Измерение оптической плотности исследуемых растворов проводили при длине волны 340 нм против воды сразу же после перемешивания содержимого кюветы и через 30 мин инкубации в термостате при 37С. Активность фермента выражали в мкмоль / (мин-мг белка).
Определение активности глутатион-8-трансферазы Принцип метода основан на определении скорости ферментативного образования 08-2,4-динитробелзена в катализируемой ферментом реакции восстановленного глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензеном, поскольку водный раствор образующегося продукта имеет максимум светопоглощения при длине волны 340 нм.
Ход определения. В кювету спектрофотометра вносили 1,2 мл 2 мМ раствора TSH на 0,1М калий-фосфатном буфере рН 6,5 и 0,3 мл лизата клеток. Реакцию запускали внесением 1,2 мл 2 мМ раствора 1-хлор-2,4-динитробензена. Параллельно опытным путем исследовали контрольную пробу, в которую вместо биологического материала вносили 0,3 мл дистиллированной воды. Измерение оптической плотности исследуемых растворов проводили при длине волны 340 нм против воды сразу же после перемешивания содержимого кюветы и через 20 мин. Активность фермента выражали в мкмоль / (мин-мг белка).
Показатели активности антиоксидантной системы в лимфоцитах периферической крови у больных аутоиммунными тиреопатиями
Несмотря на значительные успехи современной эндокринологии, заболевания щитовидной железы, наряду с сахарным диабетом, занимают лидирующее положение в структуре эндокринной патологии. В последние годы отмечается неуклонный рост заболеваемости тиреопатиями, одной из распространенных клинических форм которых являются аутоиммунные заболевания щитовидной железы [Eguchi К., 2000; ПетунинаН.А. 2002].
Анализ структуры болезней щитовидной железы за последние десятилетия свидетельствует об устойчивой тенденции к увеличению доли аутоиммунного тиреоидита (АИТ) и диффузного токсического зоба (ДТЗ) среди тиреопатий, ведущим патогенетическим звеном которых является дисбаланс иммунной системы, связанный с нарушением структуры, метаболизма и функций ее основного клеточного звена - лимфоцитов. В свою очередь доказано, что функциональные свойства лимфоцитарных клеток зависят (главным образом) от интенсивности их внутриклеточного метаболизма. Именно на уровне метаболической системы формируются ответные реакции клетки на различного рода воздействия [Савченко А.А. и соавт., 2003].
В последние годы одной из актуальных проблем экспериментальной и клинической медицины является изучение патогенетической роли нарушений молекулярных механизмов апоптоза в развитии целого ряда заболеваний. Исследования некоторых авторов выявили новые механизмы подавления иммунологического надзора, связанные с апоптозом, реализуемым посредством Fas-рецептора (FasR, АРО-1, CD95) [Adrens M.J., WylleA.H., 1991].
Показано существование взаимосвязи между нарушениями регуляции процесса апоптоза и развитием заболеваний, сопровождающихся снижением эффективности иммунологического надзора, а именно развитием аутоиммунной патологии [Krammer Р., 2000]. Нарушения процессов инициации и реализации летальной программы клеток часто становятся основополагающими в определении характера и тяжести течения заболевания [Кандрор В.И., 2001; Болотская Л.А. и соавт., 2002; Виноградова Ю.Е.,2003].
Дисбаланс провоспалительных и противовоспалительных цитокинов вносит значительных вклад в патогенез аутоиммунных заболеваний, в том числе аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. При аутоиммунных тиреопатиях отмечается значительное усиление способности к спонтанной продукции провоспалительных цитокинов клетками периферической крови. Провоспалительные цитокины, в первую очередь фактор некроза опухоли а (ФНОа), играют немаловажную роль в индукции апоптоза. ФНОа способствует развитию аутоиммунного процесса, поскольку принимает непосредственное участие в регуляции пролиферации антигенспецифических клонов Т- и В-лимфоцитов и продукции аутоантител [Глазанова Т.В. и соавт., 2004].
Известно, что судьба любой клетки зависит от ее генетических особенностей и факторов окружения, которые на нее действуют. Именно баланс внеклеточных и внутриклеточных факторов определяет участь клетки. Чрезмерное накопление апоптотических клеток вследствие нарушения их утилизации фагоцитами ведет к тому, что собственные антигены клеток распознаются как чужеродные, изменяется спектр доминирующих гуморальных факторов с увеличением доли противовоспалительных цитокинов, обладающих способностью к длительному поддержанию иммунного ответа по Тп2-пути [Giordano С. et al., 2001;BarashJ., 2003].
Дефекты Fas-зависимого апоптоза лимфоцитов выявлены при многих аутоиммунных заболеваниях, в том числе при аутоиммунной патологии щитовидной железы [Капулер О.М. и соавт., 2006]. Сама железа, а точнее ее продукты - гормоны, также могут влиять на процессы программированной гибели клеток и апоптоз-опосредованной регуляции клеточного гомеостаза [ПотапневМ.П.,2002]. Установлено, что одной из наиболее чувствительных к повреждающему воздействию клеточных структур является цитоплазматическая мембрана. Биологическая мембрана играет важную роль в жизнедеятельности как отдельной клетки, так и макроорганизма в целом. Важным структурным звеном клеточной мембраны являются липиды и их производные [Нагоев Б.С. и соавт., 2002].
В настоящее время состоянию процессов свободнорадикального окисления (СРО) отводится основополагающая роль в развитии цитодеструктивных процессов в патогенезе огромного числа заболеваний, в том числе аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. Повышение концентрации активных форм кислорода (АФК) становится причиной повреждения белков, нуклеиновых кислот, запуска процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), что, в свою очередь, может служить фактором повреждения клеток, аллергизации и развития аутоиммунных состояний [Нагоев Б.С. и соавт., 2002]. Вредным является не только повышение уровня СРО, но и нарушение физиологического баланса между его интенсивностью и функциональной активностью антиоксидантной системы организма [Арутюнян А.В. и соавт., 2000]. При этом тиреоциты относятся к немногочисленным клеткам, специализированный метаболизм которых предполагает постоянное образование высоких концентраций АФК в ответ на стимулирующее действие тиреотропного гормона [Надольник Л.И., 2005].
В норме в системе «оксиданты-антиоксиданты» сохраняется равновесие. Нарушение этого баланса в пользу оксидантов приводит к развитию так называемого оксидативного стресса. Он выражается в избыточной продукции АФК и недостаточности антиоксидантной защиты. Неконтролируемая генерация АФК и их производных вызывает повреждение белков, нуклеиновых кислот, ферментов, биомембран и в конечном итоге приводит к развитию патологических состояний. Недостаток радикалов также влияет на жизненно важные функции организма. Нарушение стационарности СРО рассматривается в настоящее время как универсальный, неспецифический
