Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Атеросклероз как системное воспаление 12
1.2. Роль иммуных механизмов в развитии атеросклероза 18
1.3.Ацетилсалициловая кислота - основное антитромбоцитарное средство в лечении атеротромбозов 35
Глава 2. Материалы и методы исследований 41
2.1. Методы определения количества лейкоцитов 42
2.2 Определение показателя лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии 42
2.3. Определение агрегационных свойств тромбоцитов 43
2.4. Определение уровня цитокинов 44
2.5. Иммуноферментный анализ количественного определения растворимого человеческого sP-селектина 44
2.6.Стастическая обработка материала 44
Глава 3.Результаты собственных исследований 46
3.1. Число лейкоцитов и лимфоцитов у больных ИБС 47
3.2. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия 50
3.3. Агрегация тромбоцитов и лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия 55
3.3.1. Агрегации тромбоцитов при стабильной и прогрессирующей стенокардии 55
3.3.2.Изменение агрегации тромбоцитов при инфаркте миокарда 62
3.3.3. Корреляционная связь между числом ЛТА и агрегацией тромбоцитов при ИБС 67
3.4 Продукция про- и противовоспалительных цитокинов при ИБС 73
3.4.1. Краткие сведения о системе цитокинов 73
3.4.2. Содержание ИЛ 1-РА 74
3.4.3. Содержание ИЛ-4 76
3.4.4. Содержание ИЛ-8 78
3.4.5 Содержание ИЛ-18 80
3.4.6 Корреляционная связь между числом ЛТА и концентрацией цитокинов 81
3.5 Содержание sP-селектина 84
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 87
Выводы 105
Практические рекомендации 107
Список литературы 108
- Атеросклероз как системное воспаление
- Методы определения количества лейкоцитов
- Иммуноферментный анализ количественного определения растворимого человеческого sP-селектина
- Число лейкоцитов и лимфоцитов у больных ИБС
Введение к работе
Ишемическая болезнь сердца (ИБС) - группа заболеваний, обусловленных абсолютной или относительной недостаточностью коронарного обращения. Она выделена как самостоятельное заболевание Всемирной организацией здравоохранения в 1965 г. в связи с большой социальной значимостью. В настоящее время в мире, особенно в экономически развитых странах, отмечается неуклонный рост заболеваемости ИБС [WHO, 2001].
Главной, по сути, единственной причиной ИБС является атеросклероз венечных артерий, выявляемый у 90-97% больных [Новиков В.П., 2000]. Формирование атеросклеротической бляшки имеет много сходства с реакцией развития иммунного воспаления: образование неоантигена, очаговое скопление незернистых лейкоцитов, разрастание соединительной ткани. При этом усиливается миграция макрофагов и Т-клеток в артериальной стенке. Активированные лейкоциты выделяют протеазы, пептидные ростковые факторы и цитокины, которые разрушают белки матрикса и стимулируют гладкомышечные клетки, эндотелиоциты и другие клетки [Пальцев М.А., 2005; Fuster V., 2005]. Поскольку в атеросклеротической бляшке одновременно присутствует большое количество Т-лимфоцитов и макрофагов моноцитарного происхождения, повышена продукция ИЛ-2 и экспрессия эндотелием HLA-II класса подтверждает то, что атерогенез является результатом развития иммунного ответа [Мазуров В.И., 2005].
В настоящее время широко изучаются межклеточные взаимодействия, в основе которых лежат механизмы сигнализации, опосредуемые цитокинами. Установлено, что адгезивные взаимодействия между тромбоцитами и лейкоцитами являются важными звеньями
механизмов, обеспечивающих миграцию лейкоцитов в зону повреждения,
а следовательно воспаления и развития там иммунных и репаративных
реакций [Витковский Ю.А. и соавт., 1999-2008; Солпов А.В. и соавт.
2001-2008]. Тромбоциты способны вступать в контакт с нейтрофилами и
моноцитами в процессе остановки кровотечения и развития
воспалительной реакции. Установлена взаимосвязь между гемостатическими и воспалительными реакциями при повреждении тканей, в которой ключевым звеном выступает взаимодействие лейкоцитов, тромбоцитов и эндотелиальных клеток [Кузник Б.И. и соавт., 1988-2008].
Предыдущими работами изучены механизмы лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в условиях нормы. Выявлено, что феномен лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии представляет собой одну из физиологических функций, присущую различным субпопуляциям лимфоцитов, и реализуемую посредством адгезивных молекул. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия регулируется цитокинами и индукторами агрегации тромбоцитов [Витковский Ю.А., Кузник Б.И., Солпов А.В., 1999]. Сами тромбоциты стимулируют адгезию лимфоцитов к экстрацеллюлярному матриксу в условиях тока жидкости, что позволяет им противостоять силе сдвига, способствуют миграции лимфоцитов [Солпов А.В., 2005, 2006].
Данный феномен может иметь определенное патофизиологическое значение, так как активация тромбоцитов на поврежденной поверхности сосудистой стенки может служить важным фактором в миграции лейкоцитов в толщу сосуда и дальнейшему формированию тромба. Известно, что одним из патогенетических звеньев начальной стадии развития атеросклероза является скопление и последующая миграция моноцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и тромбоцитов в область
повреждения сосудистого эндотелия. Установлено, что взаимодействие
моноцитов и лимфоцитов имеет первостепенное значение в инициации
процессов повреждения и последующего тромбообразования на
поверхности атеросклеротической бляшки [Климов А.Н., 1995;
Пальцев М.А., 2005; Nityanand S., 1995].Учитывая, что лимфоцитарно-тромбоцитарные взаимодействия практически не изучались при ишемической болезни сердца, исследования в этом направлении могут оказаться перспективными для более глубокого понимания патогенеза и терапии этих заболеваний.
Цель и задачи исследования
Целью исследования явилось изучить лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию при ИБС и ее взаимосвязи с агрегационной активностью тромбоцитов и продукцией цитокинов.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.
1. Изучить у больных со стабильной и прогрессирующей
стенокардией принимающих и не принимающих аспирин и инфарктом
миокарда функцию лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии.
2. Исследовать у пациентов ИБС спонтанную и индуцированную
агрегацию тромбоцитов и оценить корреляционные взаимосвязи с функцией
лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии.
3. Определить у больных со стабильной и прогрессирующей
стенокардией принимающих и не принимающих аспирин и инфарктом
миокарда концентрацию ИЛ-1РА, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-18, растворимого Р-
селектина и оценить характер корреляционных связей с лимфоцитарно-
тромбоцитарной адгезией.
Научная новизна
Впервые установлено, что у больных со стабильной и прогрессирующей стенокардии, не принимающих аспирин, снижается количество лимфоцитарно-тромбоцитарных агрегатов по сравнению со здоровыми. При этом уменьшается абсолютное число лимфоцитов, участвующих в клеточно-пластиночной адгезии. Использование аспирина при лечении пациентов со стабильной и прогрессирующей стенокардией восстанавливает у них функцию лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии.
Впервые выявлено, что после развития инфаркта миокарда у больных функция лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии неоднозначна: у одних - она находится ниже, у других - выше уровня здоровых, у третьих -соответствует норме. К 20-22 суткам у больных с исходно низкими значениями увеличивается, а с высокими - снижается процент лимфоцитов, способных адгезировать на своей поверхности тромбоциты приближаясь к уровню здоровых. У таких пациентов в первые 12 суток после развития инфаркта уменьшается абсолютное число лимфоцитов, присоединяющих к себе кровяные пластинки.
Впервые обнаружено, что изменения лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии у больных с различными проявлениями ИБС связаны с агрегационной функцией тромбоцитов и содержанием ИЛ-4, ИЛ-8,ИЛ-1РА.
Теоретическая и практическая значимость работы
В результате исследования получены новые сведения о роли лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии в патогенезе ишемической болезни сердца и установлены ее взаимосвязи с агрегационной функцией тромбоцитов, продукцией ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-18, ИЛ-1РА и sP-селектина,
также выявлены новые факты о влиянии аспирина на клеточно-пластиночные взаимодействия при стабильной и прогрессирующей стенокардии.
Ссылаясь на материалы исследований, использование теста лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии у пациентов с ИБС позволяет косвенно судить об агрегационных свойствах тромбоцитов и применять для оценки влияния аспирина на межклеточные взаимодействия.
Внедрение в практику
Результаты исследований внедрены учебный процесс кафедр нормальной физиологии, патологической физиологии, факультетской терапии, в работу диагностической поликлиники ЧГМА, НИИ медицинской экологии ЧГМА и городской больницы № 1 г. Читы.
Апробация основных положений работы
Основные результаты работы были представлены на Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2006, 2007), XX съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 2007), Конгрессе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2007), XXI Конгрессе международного общества по тромбозу и гемостазу (ISTH) (Женева, Швейцария, 2007), международном симпозиуме по тромбоцитам (Израиль, 2006), заседании Читинского отделения Физиологического общества им. И.П. Павлова (2007).
Положения, выносимые на защиту
1. У больных со стабильной и прогрессирующей стенокардией, не принимающих аспирин, снижается количество лимфоцитарно-
тромбоцитарных агрегатов по сравнению со здоровыми. При этом уменьшается абсолютное число лимфоцитов, участвующих в клеточно-пластиночной адгезии. Использование аспирина при лечении пациентов со стабильной и прогрессирующей стенокардией восстанавливает у них функцию лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии.
У пациентов, перенесших инфаркт миокарда, количество ЛТА в первые сутки наблюдения варьирует независимо от объема некроза и предпринимаемого лечения: у одних больных этот показатель находится ниже, у других - выше уровня здоровых, у третьих - соответствует норме. К 20-22 суткам у больных с исходно низкими значениями увеличивается, а с высокими - снижается процент лимфоцитов, способных адгезировать на своей поверхности тромбоциты приближаясь к уровню здоровых. У таких пациентов в первые 12 суток после развития инфаркта уменьшается абсолютное число лимфоцитов, присоединяющих к себе кровяные пластинки.
Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия у пациентов с ИБС коррелирует с изменением агрегационной функции тромбоцитов и приемом аспирина.
У больных со стабильной и прогрессирующей стенокардией концентрация ИЛ1-РА повышена и не зависит от приема аспирина. У этих пациентов содержание ИЛ-4 выше, чем у здоровых лиц, однако применение аспирина снижает его уровень только при прогрессирующей стенокардии. Концентрация ИЛ-8 увеличена у больных со стабильной и прогрессирующей стенокардией и прием аспирина не сказывается на ее изменении. У пациентов с ИМ содержание ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-1РА повышается в первые сутки после развития болезни и снижается к 22 суткам наблюдения, не достигая значений здоровых лиц. Концентрация ИЛ-18 во всех клинических группах не отличается от нормы.
Концентрация Р-селектина увеличивается только в первые 12 суток после развития инфаркта миокарда и снижается к 22-суткам.
Г л а в a 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Атеросклероз как системное воспаление.
В настоящее время ишемическая болезнь сердца лидирует в структуре смертности в экономически развитых странах [WHO, 2001]. Среди наиболее вероятных причин развития ИБС могут быть патология обмена липопротеидов, дисфункция сосудистого эндотелия изменение метаболизма сосудистой стенки, нарушение толерантности к тканевым антигенам с развитием хронического иммунного воспаления, изменение агрегационпых и коагуляционных свойств крови, генетические нарушения и инфекционные факторы [Яковлев В.М.; 2000, Demuth К.; 1995, Ross R., 1999].
Все факторы риска ишемических сосудистых событий (ИСС) делятся на модифицируемые (подтвержденные и потенциальные) и немодифицируемые. На возраст, пол, этническую принадлежность и семейный анамнез, являющимися немодифицированными факторами, повлиять невозможно. К модифицированным факторам риска, роль которых в этиологии ИБС явная, относятся повышенное артериальное давление (АД), курение, диабет, избыточная масса тела, недостаточная физическая активность, гиперлипидемия, фибрилляция предсердий, стеноз сонных артерий и сердечная недостаточность. Апное во сне, метаболический синдром, употребление наркотиков или большого количества алкоголя, оральные контрацептивы у курящих женщин -потенциально модифицируемые факторы риска [Goldstein L.B., 2006]
Главной, по сути, единственной причиной ИБС является атеросклероз венечных артерий, выявляемый у 90-97% больных с данной патологией. Атероск'лсроз венечных артерий широко распространен и часто начинается
еще в молодом возрасте. В 10 процентах случаев склеротические изменения коронарных артерий обнаруживается в возрасте 15-20 лет. К 50 летнему возрасту этот процент достигает 50 [Новиков В.П., 2000]. Раннее морфологическое проявление атеросклероза — атеротромбоз, то есть образование богатого кровяными пластинками белого тромба на поверхности разорвавшейся или изъязвленной бляшки. Атеротромбоз, лежащий в основе подавляющего большинства острых поражений коронарных, мозговых и периферических артерий, считается ведущей причиной смерти в мире [Bhatt D.L., 2006; Libby P., 2001].
Представление об атеросклерозе как о хроническом вялотекущем воспалительном заболевании окончательно сформировалось еще в прошлом веке [Ross R., 1999; Memon L., 2006]. Атеросклероз является генерализованным прогрессирующим заболеванием, поражающим различные сосудистые бассейны. Ранние структурные изменения в стенке средних и крупных артерий, возникающих в молодом возрасте, эволюционируют от дисфункции эндотелия к фиброатероматозным, гемморагическим и тромботическим бляшкам, развивающиеся чаще к 40 годам. Формирующая атеросклеротическая бляшка имеет много сходства с реакцией развития иммунного воспаления: образование неоантигена, очаговое скопление незернистых лейкоцитов, разрастание соединительной ткани [Пальцев М.А., 2005; Diener Н.С., 2005;FusterV.,2005].
В поддержании нормального функционирования стенки сосуда принимают участие 2 группы клеток. Первая представлена эндотелиальными, затем гладкомышечными клетками (ГКМ) сосудов, тромбоциты и моноциты. Вторая группа нейтрофилы, базофилы. Сосудистая стенка каждого человека имеет слабые места, такие как бифуркация, места отхода и изгиба сосудов, то есть это те участки, которые подвергаются гидравлическому и гемодинамическому удару. В
данных местах уменьшается давление сдвига и присутствует турбулентность, обратное движение крови и вихревые потоки [Libby Р., 1991]. Пульсирующий характер кровотока в коронарных артериях в местах их анатомических искривлений и сужений особенно способствует повреждению эндотелия. Повреждение эндотелия вызывает сложный каскад патологических процессов. Он утрачивает способность нормально функционировать. При этом клетки не могут соединяться друг с другом и с подлежащей соединительной тканью [Шулутко Б.И. 1998]. В результате этого происходит повышенное тромбообразование в коронарных артериях, за счет снижения антитромбогенной активности сосудистой стенки [Чазов Е.И. 2001].
Трансмиграция лейкоцитов в артериальную стенку стимулируется хемоатрактантами, например фактором хемотаксиса моноцитов. Однако лимфоциты не содержат актомиозинового комплекса и не способны самостоятельно проходить через поврежденную сосудистую стенку в ткани, где они выполняют основную функцию — участие в клеточном и гуморальном иммунитете. Перейти в очаг повреждения им помогают тромбоциты, содержащие весь комплекс сократительных белков и способные самостоятельно передвигаться и «тащить» за собою лимфоциты в зону распространения патологического процесса. [Витковский Ю.А., 2006.].
Большое количество теоретических и клинических исследований показывает, что воспаление играет ключевую роль в развитии атеросклероза. Воспаление при этом конкурирует с накоплением липопротеидов в артериальной стенке. Происходит накопление воспалительных макрофагов и Т- клеток в артериальной стенке. Эти активированные лейкоциты выделяют протеазы, пептидные ростковые факторы и цитокины, которые разрушают белки матрикса
и стимулируют гладкомышечные клетки, эндотелиоциты и макрофаги. Моноциты трансформируются в макрофаги и поглощают модифицированные липопротеиды, используя скавенджер-рецепторы, и превращаются в пенистые клетки, а также выделяют ряд провоспалительных цитокинов (интерлейкин -1 [ИЛ-1], ИЛ-4 и фактор некроза опухоли [ФНО-а]). Тромбоциты связываются с ЛПНП, и это усиливает тромбоцитарный ответ, также кровяные пластинки, фагоцитируемые макрофагами, появляются в бляшках, что приводит к формированию пенистых клеток и привлечение белка амилоида р [Relou I.A., 2003; Jans D., 2004].
Известно, что иммунитет, гемостаз и неспецифическая резистентность организма является клеточно-гуморальнои системой в котором связующим звеном выступают цитокины [Кузник Б.И., Цыбиков 1988-2005, Витковский Ю.А. и соавт., 1996-2007]. Синтез всех цитокинов в очаге воспаления активируют, главным образом, оседлые макрофаги. Для реализации действия каждого из цитокинов, клетки мишени выставляют на плазматическую мембрану рецепторы, которые обладают высокой специфичностью при связывании индивидуальных лигандов — первичных медиаторов воспаления. Именно действие интерлейкинов, как синергистов, функционально объединяет многие, казалось бы, разрозненные, иммунокомпетентные клетки [Титов В.Н., 2003].
Активация системы цитокинов играет существенную роль в
патогенезе ИБС, начиная с ранних этапов формирования
атеросклеротической бляшки, являясь маркером тяжести и
прогрессирования заболевания [Павликова Е.П., 2003]. Повышенная продукция цитокинов может приводить к прогрессированию коронарного атеросклероза, так как она является неспецифическим воспалительным ответом на ишемию миокарда и может вызвать повреждение эндотелия, активацию и адгезию клеточных элементов [Ребров А.П., 2004].
Скопление пенистых клеток и Т- лимфоцитов представляет собой липидное пятно - начальную стадию атеросклеротического процесса [Королева О.С, 2007]. Поскольку в атеросклеротической бляшке одновременно присутствует большое количество Т-лимфоцитов и макрофагов моноцитарного происхождения, повышена продукция ИЛ-2 и экспрессия эндотелием HLA-II класса возникает предположение, что атерогенез представляет собой также иммунный ответ [Мазуров В.И., 2005].
Атероматозное ядро, состоящее из внеклеточных липидов, пенистых клеток и некротизированных компонентов сосудистой стенки, занимает до 40 % площади бляшки. Размер ядра является угрожающим фактором разрыва и тромбоза. Разрушающиеся пенистые клетки, высвобождают содержащие в них липиды, постоянно увеличивают объем атероматозного ядра [Вихтер А.М.,1983; Forrester J.S.,1998; Zaman A.G., 2000.].
Фиброзные покрышки характеризуются значительным скоплением клеточных элементов с преобладанием моноцитов/макрофагов над Т-лимфоцитами. Причем последние располагаются в краевых отделах бляшки, в то время как моноциты/макрофаги встречаются на всем протяжении фиброзной покрышки [Шлычкова Т.П. 2003]. Среди Т-лимфоцитов преобладают Т- хелперы (CD4) как в неизмененной интиме, так и в зоне липоидоза, где отмечается значительное увеличение их числа. Количество моноцитов/макрофагов (CD11) также резко увеличено в области липидных пятен по сравнению с неизмененной интимой [Жданов B.C., 2004]. GK. Hansson и соавт. [1989] определили, что многие лимфоциты, прилежащие к гладкомышечным клеткам, экспрессируют антигены гистосовместимости II (HLA- II класса). Гладкомышечные клетки в бляшках могут также экспрессировать комплекс гистосовместимости II и синтезировать у-
интерферон. При обычном атеросклерозе лимфоциты поликлональны. Однако липопротеиды низкой плотности (ЛПНП) похоже, являются, по меньшей мере, одним из источников антигена для Т-клеток.
Воспаление в бляшке, содержащие мягкое, богатое липидами ядро, покрытое тонкой и воспаленной капсулой из фиброзной ткани, ведет к ослаблению капсулы, делает ее нестабильной, ранимой, предрасположенной к разрыву [Климов А.Н., 1995; Nityanand S.,1995].
В эндотелии над липидными пятнами выявляются зоны микроповреждения клеток, приводящие к деэндотелизации. Эти зоны небольшие и по протяженности захватывают не более 3-4 клеток, но их значение для прогрессирования атеросклероза велико. В них полностью нарушена проницаемость сосудистой стенки, и интима артерий отграничена от просвета тонкой прослойкой фибриллоподобной структуры. С другой стороны, на деэндотелизированных участках артериальной поверхности наблюдается агрегация тромбоцитов с частичной или полной дегрануляцией. В зоне повреждения эндотелия было отмечено также скопление и других форменных элементов крови: эритроцитов, моноцитов, тучных клеток, лимфоцитов и плазматических клеток. Таким образом в зоне деэндотелизации уже в начальной стадии атеросклероза образуются микротромбы, а дегрануляция тромбоцитов, как известно, сопровождается выделением тромбоцитарного фактора роста, который, вероятно, оказывает митотический эффект на клетки сосудистой стенки. Образование микротромбов в местах повреждения стенки артерий является пусковым механизмом в сложной реакции тромбообразования.
Таким образом, воспалительные процессы имеют существенное значение, как формирования самой атеросклеротической бляшки, так и повреждения стабильной атеромы с последующей тромботической
окклюзией и развитием сердечно - сосудистых осложнений [Насонов Е.Л., 1999].
1.2. Роль иммунных механизмов в развитии атеросклероза.
Все более очевидной становится роль тромбоцитов как инициирующих агентов в развитии атеросклероза. Тромбоциты способны вступать непосредственно в контакт с эндотелиальными клетками, гранулоцитами, моноцитами, лимфоцитами и эритроцитами, образуя важную связь между воспалением и атеросклерозом [Gasser О., Schifferli J.A., 2004; Losche W., 2004; Weyrich A.S., Zimmerman G.A., 2004; Gawaz M., 2005]. Они играют значительную роль в инициации, развитии и полной степени атеросклеротического повреждения и во многих случаях является важнейшим патогенетическим механизмом кардиальной патологии. [Lindemann S., 2007., Gawaz М., 2008]. Известно, что кровяные пластинки не только являются участниками гемостаза, но и имеют непосредственное отношение к врождённому и адаптивному иммунитету, протеканию воспалительных реакций, регенерации и репарации повреждённых тканей [Цыбиков Н.Н.,1985; Витковский Ю.А., 1999; Ridker P.M., 2001; Solpov А., 2004]. Тромбоциты, находящиеся в общей циркуляции, содержат в себе около 35 а-гранул и 5 плотных гранул, которые являются основным местом хранения биологически активных соединений, и играют ведущую роль в свертывании крови, будучи основой формирования тромба и активатором плазменных факторов свертывания. В а-гранулах содержится большое количество медиаторов пептидной природы: тромбоцитарный фактор-4 (PF-4), |3-тромбоглобулин ф-TG), фактор регулирующий активацию Т-клеток (RANTES), макрофагальный воспалительный пептид-la (MP-1а) [Шишкова А.С., 2000].
Агрегация тромбоцитов является одной из главных функций первичного звена гемостаза и служит важнейшим показателем реологических свойств крови. Первичный (сосудисто-тромбоцитарный) гемостаз предполагает взаимодействие двух структур - тромбоцита и сосудистой стенки.
Сосудистая стенка в норме обладает выраженными атромбогенными свойствами. Неповрежденный эндотелий создает механическую защиту, предотвращающую контакт крови и субэндотелиальных структур, продуцирует соединения, тормозящие адгезию и агрегацию тромбоцитов, таких как оксид азота (NO), простациклин, или простагландин h, АДФ-азу, представляет естественные антикоагулянты (антитромбин-Ш, протеин С, протеин S, тромбомодулин, кофактор-П гепарина) и активатор плазминогена тканевого типа. Основная роль тромбоцитов в физиологическом процессе гемостаза обусловлена их способностью к адгезии, агрегации и секреции биологически активных соединений [Вашкинель В.К., 1982; Баркаган З.С., 1988].
Многочисленные экспериментальные и клинические данные
свидетельствуют о том, что интенсивность воспаления в
атеросклеротической бляшке связана с процессами тромбообразования, происходящие на ее поверхности. Тромбоциты первыми реагируют на разрыв атеросклеротической бляшки и образуют тромбоцитарную пробку [Fuster V., 1997]. Поэтому возрастание их активности считаются важными составляющими атеросклероза, и является непосредственной причиной развития острых сосудистых катастроф, таких как инфаркт миокарда (ИМ) и инсульт.
Коронарный тромбоз часто возникает на участках разрыва или повреждения бляшки. Незамедлительно после разрыва или эрозирования бляшки субэндотелиальный коллаген, липидный слой и прокоагулянты, такие как фактор фон Виллебранда (VWF), выходят в циркуляцию. В
результате высвобождения в кровоток многочисленных проагрегантов (АДФ, серотонин, тромбоксан Аг, адреналин, тромбин и др.) происходит осуществление механизма положительной обратной связи, проявляющейся в усилении первоначальной агрегации тромбоцитов с одновременным вовлечением в процесс агрегации соседних неактивированных клеток. Единовременное действие нескольких индукторов агрегации (в противном случае в кровеносном русле постоянно образовывались бы тромбоцитарные тромбы) является стимулом к началу общего финального этапа агрегационного процесса: на мембранах псевдоподий происходят конформационные изменения ИЬ/Ша рецепторов, сопровождающиеся многократным увеличением их аффиности к своим лигандам, прежде всего к фибриногену и фактора фон Виллебранда [Rauch U., 2001; Massberg S., 2003; Neiswandt В., 2003]. Молекулы фибриногена и VWF, являясь мультивалентными, способны взаимодействовать одновременно с большим количеством тромбоцитов, что приводит к образованию многочисленных межклеточных "мостиков".
Значительная активация тромбоцитов отмечается также при различных патологических процессах воспалительной природы, так как секреторная фосфолипаза А2 является белком острой фазы. Она обусловливает гидролиз фосфолипидов, входящих в состав липопротеинов и клеточных мембран с образованием лизофосфолипидов, которые составляют субстрат для образования фактора активации тромбоцитов (ФАТ). Помимо этого, развитие острых коронарных явлений происходит вследствие не только осложненного течения атеросклероза венечных сосудов с разрушением бляшки, но и сопутствующего образования тромба, обтурирующего просвет сосуда в месте повреждения его стенки. В связи с этим многие исследователи рассматривают процесс, определяющий патогенез острого коронарного синдрома (ОКС) и его трансформацию в ИМ как «атеротромбоз».
Эндотелий, считавшийся ранее инертным барьером между кровью и сосудистой стенкой, сейчас признается важным сосудисто-резистентным центром. Благодаря работе R.F. Furchgott и J.V. Zawadzk [1980] участие эндотелия в сосудистом гемостазе становится очевидным. Эндотелий участвует в регуляции сосудистого тонуса, питания и репарации сосудов, воспалении, тромбозе и коагуляции.
Регуляция эндотелием этих процессов происходит при паракринной и аутокринной секреции медиаторов, включая не только оксид азота (NO), но и простагландинов, эндотелина. Эти вещества обеспечивают баланс между вазодилятацией и вазоконстрикцией, тромбозом и антикоагуляцией, модуляцией воспаления. Среди этих медиаторов NO наиболее известен [Moncada S., 1993]. Он продуцируется эндотелиальной NO- синтетазой (NOS III) и является мощным вазодилататором [ Rees D.D., 1989]. Мощные вазоконстрикторы, такие как ангиотензин II и эндотелии действуют как антогонисты оксида азота, и все они контролируют баланс сосудистого тонуса [ Luft F.C., 2002].
Активность тромбоцитов находится под постоянным угнетающим влиянием N0, высвобождаемого эндотелиоцитами. Уменьшение биодоступности N0, наблюдаемое как у больных с ишемической болезнью сердца (ИБС), с хронической сердечной недостаточностью, так и в экспериментальных условиях при блокаде синтетазы NO, приводит к реципрокному повышению активности клеток крови, прежде всего тромбоцитов, с возрастанием протромбогенного потенциала и может являться одной из причин повышенного риска развития ИМ.
Концепция эндотелиальной вазодилятирующей дисфункции возникла при наблюдении за изменением кровотока у больных атеросклерозом в сравнении со здоровыми. У здоровых активация NOS III вызывает расширение, как сосудов мышечного типа, так и артериол. У больных атеросклерозом такая же стимуляция вызывает расширение
периферических сосудов и парадоксальную констрикцию коронарных сосудов [Lieberman Е.Н., 1996; Ludmer P.L., 1986]. Эндотелиальная дисфункция была исследована у пациентов с факторами риска атеросклероза, но отсутствием его самого. При наличии эндотелиальной дисфункции наблюдалось развитие и прогрессирование заболевания.
Снижение биоактивности NO и увеличение продукции вазоконстрикторов создает благоприятную среду для возникновения тромбоза и развития атеросклероза [Loscalso J., 2001]. Кроме того, эндотелиоциты принимают важное участие в «рекрутировании», адгезии и диапидезе лейкоцитов в сосудистую стенку благодаря продукции хемокинов, цитокинов и внутриклеточных транскрипционных факторов, таких как ядерный фактор и активатор протеина-1, a NO выступает как антагонист каждого из этих процессов [Berk B.C. 2001., Hawiger J. 2001.; Rosenfeld M.E. 1996.; Libby P. 2000]. Более того, при снижении уровня NO, увеличивается пролиферация и миграция гладкомышечных клеток сосудов, активируются тромбоциты [Loscalzo J. 2001.; Vallance P. 2001].
Интактный, неактивированный эндотелий в норме предотвращает адгезию тромбоцитов и других воспалительных клеток и сосудистой стенки. Как только возникает повреждение, эндотелиальная дисфункция способствует развитию клинических проявлений. Поврежденный эндотелий может снижать стабильность бляшки и увеличивать тромбогенность бляшки [Diodati J.G., 1998; Loscalzo J. 2001].
Однако даже если нет заметного повреждения эндотелия, тромбоциты способны взаимодействовать и адгезировать к эндотелию в таких участках как бифуркация артерий. Р-селектин зависимое связывание и роллинг инициирует взаимодействие тромбоцитов с интактным эндотелием, и является хорошо контролируемым механизмом. Связывание тромбоцитов является первым, очень коротким контактом с эндотелием и опосредуется Р-селектином и PSGL-1 [Massberg S., 2002]. Это приводит к
дальнейшей активации тромбоцитов и замедляет скорость их движения. Затем тромбоциты вращаются с небольшой скоростью на активированном эндотелии. Напряженная адгезия тромбоцитов с другими клетками, которая обеспечивается интегринами, называется роллингом. Роллинг зависит от активации эндотелиоцитов, которая возникает при воспалении. Агентами, вызывающие воспаление, могут быть инфекция, механическое повреждение или ишемия и перфузия [Frennete P.S., 1995; Massberg S., 1998].
Кровяные пластинки активируются при контакте с какой-либо поверхностью. Поэтому изменение функционального состояния тромбоцитов свидетельствует не только о состоянии свертывающей системы крови, но и косвенно указывает на функциональные возможности эндотелия и может быть показателем тяжести поражения сосудистой системы. Клиническое значение эндотелиальной дисфункции заключается в усугублении патологии коронарных сосудов и дает информацию о вероятности осложнений у пациентов с поражением коронарных сосудов [Kuvin J.T. 2001.; Heitzer Т. 2001].
В настоящее время особое внимание уделяется вопросам межклеточного взаимодействия на уровне различных физиологических систем. Не обошла внимания исследователей иммунная система и система гемостаза.
Еще в начале прошлого века было известно, что в процессе свертывания крови участвуют лейкоциты. В связи с развитием новой иммунологии стали накапливаться факты, свидетельствующие о том, что основными клетками, принимающими участие в иммунном ответе, являются лимфоциты и макрофаги. Однако только в 1981 году Б.И.Кузник и Н.Н.Цыбиков представили первые данные, свидетельствующие о наличии иммунного механизма регуляции свертывания крови и фибринолиза. Несмотря на то, что в настоящее время исследования
иммунных механизмов регуляции системы гемостаза проводятся в разных направлениях, многие вопросы этой проблемы остаются до сих пор нерешенными. Это обусловлено, в первую очередь, особенностями функций иммунитета и гемостаза.
Взаимодействие между тромбоцитами и лейкоцитами являются важными звеньями механизмов, обеспечивающих миграцию лейкоцитов в зону повреждения и развития там иммунных и репаративных процессов [Витковский Ю.А. и соавт., 1999-2008; Солпов А.В. и соавт. 2001-2008]. В кровотоке активированные тромбоциты прикрепляются к лейкоцитам и формируют лейкоцитарно-тромбоцитарные агрегаты. Более того, тромбоциты привлекают эти лейкоциты в сосудистую стенку. Повышение числа лейкоцитарно-тромбоцитарных агрегатов было обнаружено у больных со стенокардией [Ott I., 1996]. Активация лейкоцитов приводит к образованию их скоплений, что является маркером субклинического атеросклероза.
В конце прошлого столетия Т. Jungi [1986] продемонстрировал прямое адгезивное взаимодействие между полиморфнонуклеарными лейкоцитами и кровяными пластинками. Было установлено, что клеточно-тромбоцитарная адгезия осуществляется с участием Р-селектина и гликопротеина, экспрессированного на поверхности а-гранул после активации тромбоцитов некоторыми агонистами [Hamburger S.A., 1990; Burger Р.С., 2003; Massberg S., 2005], включая катепсин G [Maugeri N., 1994].
Р-селектин локализуется в альфа-гранулах и тельцах Weibel-Palade васкулярных эндотелиальных клеток и тромбоцитах. При воздействии стимулирующих факторов (ЛПНП, окислительные радикалы, тромбин, цитокины) Р-селектин мгновенно устремляется к поверхности клетки. Повышенная экспрессия Р-селектина отмечается в атеросклеротических бляшках и это позволяет предполагать роль Р-селектина в развитии
атеросклероза и коронарных заболеваний сердца. Экспрессия
индуцибельная и нуждается в активации клеток. Однако активация клеток с помощью фактор некроза опухолей (ФНО-а) может индуцировать новый синтез Р-селектина с его экспрессией на поверхности клеток. Активация эндотелиальных клеток рядом оксидантов приводит к пролонгированию экспрессии Р-селектина на их поверхности и связыванию лейкоцитов поскольку их углеводный покров содержит комплементарные структуры..
Без предшествующего взаимодействия с тромбоцитами лейкоциты
не могут прочно адгезировать к активированному эндотелию [Martins Р.С.,
2004]. Р-селектин обеспечивает быструю адгезию нейтрофилов и
моноцитов к активированному сосудистому эндотелию на ранней фазе
воспаления, а также лейкоцитов к активированным тромбоцитам. Р-
селектин, транзитно экспрессируемый на эндотелиальных клетках,
устойчиво представлен на поверхности активированных тромбоцитов
[Blann A.D.,2003]. При повреждении стенки тромбоциты прикрепляются к
ней, способствуют появлению тромбоцитарно-моноцитарных агрегатов
(ТМА), адгезии моноцитов и их трансэндотелиальной миграции.
Образование ТМА осуществляется через взаимодействие Р-селектина с Р-
селектин-гликопротеиновым лигандом (PSGL-1), постоянно
экспрессированным на поверхности моноцитов. Адгезия моноцитов к поверхности эндотелия может поддерживаться также моноцит-моноцитарным взаимодействием, которое проявляется в образовании клеточных агрегатов на поверхности эндотелия. Такие образования получили название кластеров. Кровяные пластинки, покрывая собой, поврежденные участки сосудов создают тем самым дополнительную адгезивную поверхность для других тромбоцитов, а также для моноцитов [da Costa Martins P., 2004]. Активация тромбоцитов кровотоком и последующая их агрегация в микроциркуляторном русле приводит к повреждению эндотелия [Jorgensen L., 2005., 2006]. Более того, адгезия
тромбоцитов к эндотелиальным клеткам и выделение кровяными
пластинками мощных воспалительных и митогенных веществ повреждает
хемотаксические, адгезивные и протеолитические функции
эндотелиоцитов, способствуя хемотаксису, адгезии и трансмиграции
моноцитов в участки воспаления [Lindemann S., 2007]. Следовательно,
циркулирующие активированные тромбоциты и тромбоцитарно-
лейкоцитарные агрегаты способствуют формированию
атеросклеротического повреждения [Huo Y., 2003].
Тромбоцитарный Р-селектин является независимым фактором развития изменений структуры стенки сосуда [Коуата Н.,2003]. Количество тромбоцитов, положительных по Р-селектину, возрастает при старении, увеличении уровня систолического и диастолического артериального давления крови, гликозилированного гемоглобина и обратно коррелирует с содержанием холестерина липопротеидов высокой плотности.
Присоединившись к стенке, лейкоцит может покинуть кровеносное русло, проникнув между смежными эндотелиальными клетками. Р- и Е-селектины присутствуют на эндотелиальных клетках в разное время и "вербуют" лейкоциты разных типов. В эндотелиальных клетках имеется внутренний запас Р-селектина, который они могут мобилизовать, т.е. вывести на свою поверхность в течение буквально нескольких минут.
Следовательно, Р-селектин способен привлекать лейкоциты, действующие на самых ранних стадиях иммунной защиты. Экспрессия Р-селектина на поверхности активированных тромбоцитов является главным фактором адгезии кровяных пластинок к полиморфноядерным лейкоцитам. Р-селектин на поверхности тромбоцитов индуцирует экспрессию тканевого фактора у моноцитов [Celi А., 1994], усиливает секрецию моноцитами цитокинов, и увеличивает экспрессию молекулы CD1 lb/CD 18 [Neumann F. J., 1999].
Таким образом, активированные тромбоциты способны адгезировать к поверхности, как гранулоциты, так и моноциты, и практически всегда их контакт зависит от экспрессии Р-селектина на поверхности кровяных пластинок и его спецефического лиганда PSGL [Hamburger S.A., 1990; Rinder Н.М., 1991].
Адгезия активированных тромбоцитов к лейкоцитам (розеткообразование) также осуществляется посредством молекулы кровяных пластинок CD62 (Р-селектина) и ее корецептора CD15 (PSGL) на поверхности полиморфонуклеарных лейкоцитов. Вместе с этим стало известно, что молекула тромбоцитов GP Ilb/IIIa (CD41a) также участвует в адгезии активированных тромбоцитов к нейтрофилами посредством связывания молекулы фибриногена [Spangenberg Р., 1993]. Позже на мембране тробоцитов была обнаружена молекула ICAM-2, выполняющая ту же функцию [Diacovo T.G., 1994].
Позже было установлено, что в условиях тока стойкая адгезия нейтрофилов к поверхности активированных тромбоцитов осуществляется за счет молекулы MaK-l(CDl lb/CD 18), которая относится к семейству р2-интегринов, фибриноген, молекула 1САМ-2 [Diacovo T.G., 1996].
На некоторых клетках воспаления экспрессированы CD40 и
мембран-связанный CD40 лиганд (CD40L), включая макрофаги, В- и Т-
лимфоциты, эндотелиоциты, гладкомышечные клетки и
фибробласты. Тромбоциты способны экспрессировать на своей
поверхности молекулу CD40-CD40L [Henn V., Inwald D.P., 2004], которая
имеет ключевое значение в развитии атеросклероза и его
осложнений, индуцируя синтез провоспалительных и
проатерогенных медиаторов на всех стадиях атерогенеза. Считается,
что это приводит к адгезии лейкоцитов, разрушение матрикса и
вызывает продукцию клеточных молекул адгезии,
провоспалительных цитокинов, хемокинов, тканевого фактора,
индуцирует иммунный ответ по Th-типу, пролиферацию
гладкомышечных клеток и ангиогенез. Это приводит к
прогрессированию атеросклеротического поражения,
дестабилизации атероматозной бляшки и образование внутрисосудистого тромба [Schonbek U., 2001; Andre P., 2002]. Прерывание СО40-сигнального пути уменьшает прогрессирование атеросклероза в эксперименте. В формирующихся атеросклеротических бляшках появляются клетки, характеризующие иммунное воспаление (тучные клетки различной степени зрелости и плазматические клетки, малые и средние лимфоциты).
Активированные тромбоциты выделяют огромное количество CD40L в течение нескольких секунд. Связывание CD40L с эндотелиальным CD40, что приводит к выделению ИЛ-8 и МСР-1, основных хемоатрактантов нейтрофилов и моноцитов. Параллельно происходит усиление экспрессии эндотелиальных адгезивных рецепторов, таких как Е-селектин, VCAM-1 и ICAM. Выделяемый тромбоцитами CD40L способен стимулировать активацию дендритных клеток в смешанных лимфоцитарных реакциях. Снижать функцию апоптоза дендритных клеток, за счет блокировки Mac-l-JAM-C-взаимодействия [Langer HF., 2007]. Следовательно, тромбоциты играют значительную роль в атеропрогрессии за счет активации, дифференцировки дендритных клеток и индукции апоптоза. Эти адгезивные молекулы опосредуют прочную адгезию нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов [Lindemann S.,2000].
VCAM-1 - один из членов суперсемейства иммуноглобулинов, который вовлекается в лейкоцитарно-эндотелиальное взаимодействие. VCAM-1 содержит либо 6, либо 7 иммуноглобулиновых доменов Н-типа и экспрессируется только после стимуляции клеток ИЛ-1, ФНОос или эндотоксином. Контррецептором для VCAM-1 служит VLA-4 -
интегрин, найденный на лимфоцитах, моноцитах и эозинофилах [Lobb R. R., 1992]. VCAM-1 обладает относительной селективной лейкоцитарной адгезией, обеспечивая накопление мононуклеарных клеток в процессе смены острой фазы воспаления на хроническую.
CD40L также индуцирует экспрессию и выделение разрушающих матрикс протеиназ (MMPs). Значительно усиливается воспаление и разрушение воспалительной ткани. Однако разрушение матрикса также происходит и под действием протеаз тучных клеток. Они являются основным источником катепсина G, который разрушает фибронектин и VE-кадгерин, обеспечивающие межклеточные взаимодействия эндотелиоцитов [Mayranpaa М.І., 2006].
Тромбоциты в избытке секретируют PF4 и P-TG, которые являются наиболее значимыми медиаторами, и участвуют в процессах активации лейкоцитов. PF-4 является хемоатрактантом для нейтрофилов, моноцитов и фибробластов. Он индуцирует дифференцировку моноцитов в макрофаги, что является одним из звеньев развития атеросклеротической бляшки. Более того, приводит к задержке ЛПНП на клеточной поверхности путем ингибирования ЛПНП-рецепторов и облегчает эстерификацию и стимулирует поглощение ЛП макрофагам [Nassar Т., 2003]. PF4 и МІР-1а индуцирует высвобождение гистамина базофилами, а также стимулирует адгезию эозинофилов. Посредством PF-4 индуцируется адгезия нейтрофилов к нестимулированному эндотелию и высвобождение содержимого вторичных гранул. Бета-тромбоглобулин - белок, который является продуктом протеолиза неактивных предшественников и может действовать как активатор факторов ингибиции нейтрофилов [Brandt Е., 2000]. МІР-1а является хемоаттрактантом для CD8+ Т лимфоцитов [Taub D.D, 1993].
RANTES - представитель класса хемокинов также стимулирует привлечение и адгезию моноцитов к активированному эндотелию [Von
Himdelshausen В., 2001], индуцирует высвобождение гистамина базофилами и секрецию катионных белков эозинофилами [Кипа Р., 1992]. В дополнение ко всему МІР-1а и RANTES оказывают непосредственное влияние на кровяные пластинки, усиливая стимулирующий эффект ионов Са , повышая агрегацию и ускоряя высвобождение содержимого гранул. Rinder М. [1991] считает, что процесс агрегации тромбоцитов и лейкоцитов отражает степень активации тромбоцитов и адгезивные свойства нейтрофилов и моноцитов.
В основе взаимодействия лимфоцитов и тромбоцитов лежат иные
механизмы адгезии, чем к коллагену, фактору фон Виллебранда и
фибриногену. Миграционный каскад всех подклассов Т-хелперов
(CD3+/CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (Т-киллеров, CD3+/CD8+),
В-клеток и натуральных киллеров модулируется тромбоцитами. Механизм
лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия включает в себя
образование интегриновых и неинтегриновых мостов, таких как а IIb/Рз и
Pi-связанные интегрины, Р-селектин-PSGL и CD40-CD40L [Солпов А.В.,
2002; Солпов А.В.,2005]. Лимфоциты способны к роллингу и
последующей адгезии к иммобилизованным, активированным
тромбоцитам в условиях кровотока в основном за счет тромбоцитарного Р-
селектина и Р-селектин глигопротеинового лиганда-1 (PSGL-1) и сиаловых
сахаридов [Lalor Р., 1995; Diacovo T.G., 1996; Sheikh S., 2004].
Взаимодействие Р-селектина с PSGL-1 индуцирует кластеринг aL-
интегрина и затем усиливает адгезию лимфоцитов через связывание с
ICAM-1 [Atarashi К., 2005]. Это предполагает, что трансформация
селектин - опосредованного роллинга лимфоцитов в интегрин -
опосредованный укрепляет адгезию в физиологической
последовательности' Р-селектин связывания. Более того, Т-клетки обладают большей адгезивной способностью, чем В-клетки [Lalor Р., 1995], и у/6 подвид Т-клеток обладает большей связывающей аффиностью
с Р-селектином, чем сс/р субпопуляция Т-лимфоцитов [Diacovo T.G., 1996]. Последнее указывает на то, что Т-клетки, особенно у/5 Т-клетки, могут быть избирательно привлечены в участки воспаления, где имеется повышающая регуляция Р-селектина.
Тромбоциты также усиливают адгезию Т-хелперов к субэндотелиальному матриксу в условиях высокой силы сдвига благодаря образованию тромбоцитарно-Т-хелперных коньюгатов и через связывание с Р-селектином, CD40 лигандом (CD40L), также как и с aIIb/(33 и (31 интегринами [Solpov А., 2006]. Выделяемые тромбоцитами микрочастицы с готовностью связываются с лейкоцитами, эндотелиальными клетками, субэндотелиальным матриксом и впоследствии усиливают адгезию моноцитов и гранулоцитов [Barry О.Р., 1998; Merten М., 1999; Forlow S.B., 2000].
В дополнение к облегчению Т-клеточной адгезии, тромбоциты могут влиять на другие функциональные аспекты Т-клеток. Выделяемый тромбоцитами фактор 4 (PF4) регулирует активность Т-клеток прикрепляясь с гликозаминогликану [Fleischer J., 2002] и хемокиновому рецептору (CXCR3B) [Lasagni L., 2003] на поверхности Т-клетки [Kalz I.R., 1985; Kalz I.R., 1986]. PF4 ингибирует моноцит-зависимую и CD3/CD28 антитело - индуцированную пролиферацию и выделение цитокинов [Fleischer J., 2002], также как и митоген - индуцированную супрессорную генерацию Т-клеток [Kalz I.R., 1986]. Интересно, что недавно было обнаружено, что PF4 модулирует регуляторные Т-клетки (Treg, CD4+ CD25+) и нерегуляторные Т-лимфоциты (CD4+ CD25-) в противопоставляющей манере [Liu C.Y., 2005].Так, PF4 ингибирует пролиферацию CD4+CD25+ Treg клеток, и последние теряют способность подавлять пролиферацию CD4+CD25- клеток [Liu C.Y., 2005]. Кроме PF4 и другие выделяемые тромбоцитами медиаторы также могут модулировать функцию Т-клеток. Связывание аллергена с покрытыми IgE тромбоцитами
приводит к выделению серотонина и впоследствии инициирует Т-лимфоцит-зависимую реакцию гиперчувствительности [Matsuda Н., 1997]. Более того, неидентифицированный протеин, выделяемый активированными стрессом сдвига тромбоцитами, может индуцировать значительную пролиферацию Т-лимфоцитов через активацию дендритических клеток [Hagihara М., 2004].
Тромбоциты в основном усиливают функцию Т-цитолитических
лимфоцитов, увеличивают продукцию IFN-y, вызванную аденовирусной
инфекцией, и цитолитическую активность Т-киллеров [Elzey B.D., 2005]
через сигнальные механизмы, опосредуемые экспрессируемым
тромбоцитами CD40L (CD 154). Это подтверждается тем фактом, что
введение активированных тромбоцитов от нормальных, но не CD40L -
дефицитных мышей приводит к усилению генерации IFN-y-
продуцирующих Т-киллеров и общей цитотоксической активности Т-клеток [Elzey B.D., 2005].
Важно подчеркнуть, что тромбоциты проявляют свое влияние на субпопуляции Т-лимфоцитов индивидуально и через многообразие механизмов и медиаторов. Один и тот же тромбоцитарный фактор может влиять по-разному на разные виды Т-клеток, и разные медиаторы могут по-разному влиять на один подкласс Т-лимфоцитов. Истинное значение тромбоцитарно - Т-клеточного взаимодействия будет таким образом зависеть от физиологического и патофизиологического микроокружения, также как от согласованности множества механизмов.
Тромбоциты также модулируют гуморальный иммунитет. Тромбоциты могут прямо стимулировать пролиферацию и продукцию антител В-клетками in vitro через опосредуемый CD40L межклеточный контакт [Sollanila А., 2005]. Суммируя все, тромбоцитарно-В-клеточное взаимодействие очень важно по двум причинам. Во-первых, опосредованная CD40L сигнализация тромбоцитов обеспечивает
назревание ответа антител, предшествующее вступлению Т-хелперов, что традиционно обеспечивает CD40L сигнал. То есть, опосредуемая CD40L сигнализация тромбоцитов играет критическую роль в незамедлительном ответе гуморального иммунитета. Во-вторых, антиген-специфичные Т-клетки в физиологических условиях редки; тромбоциты же могут усиливать сигналы, требуемые для здорового, адаптивного, гуморального иммунитета.
Активированные тромбоциты высокоафинно адгезируются к натуральным киллерам, формируя гетеротипические коньюгаты, и эта конъюгация не зависит от активации лимфоцитов [Li N., 2006]. Иммобилизированные тромбоциты способствуют прикреплению и роллингу натуральных киллеров через Р-селектин - PSGL-1 мосты, и «катящиеся» лимфоциты ту же переходят в |32 - интегриновую прочную адгезию в присутствии ИЛ-2 и лейкотриена В4 (LTB4) [Sheikh S., 2004]. Так, адгезированные тромбоциты могут облегчать инфильтрацию натуральных киллеров в зону действия.
Однако лейкоциты не являются единственными клетками, привлекаемыми в зону повреждения сосуда. В участки повреждения и воспаления эндотелия привлекаются также клетки предшественники из костного мозга [Massberg S., 2002]. Клетки предшественники являются предшественниками различных зрелых клеток, происходящих из плюрипотентных стволовых клеток, включая гемопоэтические, мезенхимальные и соединительнотканные стволовые клетки. Клетки предшественники обладают высоким регенеративным потенциалом, способны индуцировать ангиогенез и участвовать в репаративных процессах [Asahara Т., 1997; Lyden D., 2001; Dimmeler S., 2005]. Эти клетки непосредственно адгезируют к тромбоцитам через Gp Ilb/IIIa и Р-селектин, а не к коллагену 1-типа, фибронектину, фибриногену являющимся компонентом экстрацелюлярного матрикса поврежденной
артериальной стенки [Massberg S., 2002; Daub К., 2006]. Активированные тромбоциты выделяют хемокин-стромальный фактор la (SDF-la), который способствует адгезии клеток-предшественников к поверхности артериального тромба [Massberg S., 2006].
Экспрессия SDF-la на тромбоцитах регулирует привлечение и дальнейшее преобразование клеток-предшественников CD34+ в эндотелиоциты. Этот механизм может вносить значительный вклад в сосудистую и миокардиальную регенерацию в участках накопления тромбоцитов.
Однако тромбоциты не только привлекают эти клетки в зону повреждения, но и регулируют их дифференцировку в пенистые или эндотелиальные клетки. [Daub К., 2006]. Тромбоциты индуцируют морфологические изменения CD34+ клеток и дифференцировку их субпопуляции в макрофаги и в последствии в пенистые клетки, за счет фагоцитирования тромбоцитов CD34+ клетками [Daub К., 2006.]. Снижение их количества в кровотоке является неблагоприятным прогностическим признаком при сердечно-сосудистых заболеваниях [Schmidt-Lucke С, 2005; Heiss С, 2005; Urbich С, 2005].
Таким образом, такое взаимодействие между тромбоцитами и лейкоцитами может служить ярким примером тесной связи между воспалением и тромбозом при развитии сердечно-сосудистых заболеваний. Деструкция поверхности атеросклеротической бляшки вызывает активацию иммунного ответа, а экспрессия тканевого фактора инициирует свертывание по внешнему пути.
2.2 Ацетилсалициловая кислота - основное антитромбоцитарное средство в лечении атеротромбозов.
Тромбоз является основной причиной осложнений атеросклероза, в том числе и смертельных. Активация и агрегация тромбоцитов важнейшее звено в образовании тромба. Тромбоциты участвуют в развитии острого инфаркта миокарда и патогенезе прогрессирующей стенокардии. Высвобождение из них тромбоцитарного фактора роста способствует развитию атеросклероза и прогрессированию ИБС [Аверков О.В., 2003.; Панченко Е.П., 1987]. Однако тромбоциты не только играют роль в поздних осложнениях атеросклероза, но также участвуют в его развитии за счет взаимодействия с эндотелиальными клетками и лейкоцитами [Lindemann S., 2007; Gawaz М., 2008].
Используя антитромбоцитарные средства при различных проявлениях атеросклероза, существенно уменьшают риск развития сердечной смерти, ИМ и ишемического инсульта (ИИ). Результаты последних исследований показали, что назначение антиагрегантов снижает суммарный риск развития сосудистой смерти, ИМ и ИИ на 23%, нефатального ИМ на 34%, нефатального ИИ на 25% и сосудистой смерти на 15% [Каткова О.В., 2007]. За последнее столетие ацетилсалициловая кислота (АСК) заняла центральное место в терапии заболеваний сердца и сосудов. АСК была синтезирована в 1897 году немецким химиком Феликсом Хоффманом [Elwood Р.С., 2001]. Широкое применение АСК связано с глубоким изучением процессов коагуляции, тромбообразования, воспаления и их роли в сосудистой патологии. Лишь только в 1967 году было обнаружено влияние АСК на функциональные свойства тромбоцитов.
Главной ролью в реализации противовоспалительного эффекта аспирина, как и всех НПВС, отводится способности тормозить биосинтез
одних из основных медиаторов воспаления - простагландинов (ПГ). Эти эндогенные биологически активные вещества являются продуктами превращения арахидоновой кислоты и образуются в различных клетках организма под воздействием фермента циклооксигеназы (ЦОГ), которую блокирует аспирин. АСК, ковалентно связываясь с остатком аминокислоты серина в молекуле фермента, ингибирует его необратимо. В результате возникают стерические препятствия присоединению субстрата (арахидоновой кислоты) к активному центру ЦОГ, который участвует в синтезе тромбоксана Аг, являющегося мощным проагрегантным и сосудосуживающим фактором.
Тромбоциты не способны синтезировать ЦОГ, поэтому внутриклеточные запасы данного фермента, полученные кровяными пластинками при рождении, в течение их жизни не восполняются. Жизненный цикл кровяных пластинок в среднем составляет 10-11 дней. При действии АСК на тромбоциты, они теряют способность к агрегации до своей гибели [Goodman L.S., 2001.]. Наряду с торможением агрегации кровяных пластинок, АСК уменьшает образование тромбина, за счет ацетилирования молекул протромбина и фибриногена и повышает фибринолитическую активность крови, за счет облегчения активации плазминогена [Преображенский Д.В., 2002].
Помимо антиагрегационного эффекта, АСК обладает противовоспалительным действием. Наиболее отчетливо подавляется вторая, экссудативная фаза воспаления, характеризующаяся выходом жидкой части крови через сосудистую стенку, что приводит к отеку ткани. АСК уменьшает образование и влияние на сосуды медиаторов воспаления, таких, как гистамин, брадикинин, гиалуронидаза. В результате снижается проницаемость сосудов и экссудация ослабляется. Салицилаты нарушают синтез АТФ, ухудшая энергетическое обеспечение воспалительного процесса (чувствительного к недостатку энергии), в частности миграции
лейкоцитов. Стабилизирующее влияние на мембраны лизосом клеток препятствует освобождению агрессивных лизосомальных ферментов и тем самым ослабляет деструктивные явления в очаге воспаления. Интересно, что АСК подавляет воспалительный отек конечностей экспериментальных животных при введении в латеральный желудочек мозга, что свидетельствует и о воздействии на центральные механизмы регуляции периферического воспаления [Алехин Т.К., 1999].
АСК ингибирует экспрессию гена фактора некроза опухолей (ФНО-а), активирующий нейтрофилы и макрофаги, которые могут поддерживать воспаление, ограниченивает продукцию ИЛ-1, обладающего наряду с активацией макрофагов и нейтрофилов собственной провоспалительной способностью - индуцируют синтез белков острой фазы. Воздействуя на позднюю, пролиферативную стадию воспаления, аспирин угнетает образование гранулем (воспалительные разрастания соединительной ткани в виде узелка или бугорка), особенно характерных для ревматизма. Полагают, что это действие связано с устранением стимулирующего фибробласты влияния серотонина и брадикинина. Существенный вклад в терапевтическое действие аспирина на воспаление вносит метаболит арахидоновой кислоты липоксин (ЛХ) А4 (тригидроэйкозотетраеновая кислота). Его генерируют разные типы клеток, в том числе активные участники воспалительного процесса нейтрофилы и макрофаги. Пусковым моментом в индукции синтеза (ЛХ) А4 является ацетилирование ЦОГ аспирином. Установлено, что липоксины регулируют клеточные реакции воспаления и иммунитета. Доказано, в частности, что липоксины резко тормозят освобождение ИЛ-8, который вызывает ускоренное созревание, хемотаксис, трансэндотелиальную миграцию, активацию нейтрофильных лейкоцитов, активирует также макрофаги и Т-лимфоциты.
Аспирин обладает еще одним полезным свойством: являясь антагонистом витамина К, он тормозит в печени синтез предшественника тромбина — основного фактора свертывания крови.
АСК защищает эндотелий от перекисного повреждения, что связано с усилением синтеза цитопротективного протеина ферритина, который секвестрирует из цитозоля ионы железа, главного катализатора образования кислородных радикалов. Интересно, что другие НПВС этим свойством не обладают. Аспирин индуцирует образование синтетазы NO и тем самым увеличивает продукцию NO, важнейшего фактора расширения сосудов и улучшения в них кровотока [Алехин Г.К.,1999].
Эти эффекты полезны при различных сердечно-сосудистых заболеваниях. При атеросклерозе они удачно дополняют известную способность аспирина замедлять формирование атеросклеротических бляшек, защищая липопротеиды низкой плотности от окисления.
Применение антитромбоцитарной терапии является эффективной мерой вторичной профилактики сердечно-сосудистых заболеваний и предотвращение серьезных коронарных осложнений у больных с хроническими формами ИБС [Ridker P.M., 1991; Patrono С, 1986]. АСК на сегодняшний день сохраняет свои позиции наиболее доступного и широко применяемого антиагреганта. Тем не менее, значительное число больных, ежедневно принимающих аспирин, переносят различные сердечнососудистые осложнения. Этот феномен был описан как «аспиринорезистентность», однако четких критериев данного понятия не существует. Под этим термином подразумевают неспособность препарата предупреждать развитие повторных тромботических осложнений и подавление функции тромбоцитов. По различным данным, частота неэффективного применения АСК - от 6 до 56% [Sanderson S., 2005].
Одной из причин устойчивости к терапии АСК может быть сниженная биодоступность препарата. А.А. Weber и соавт. изучали
агрегацию тромбоцитов и определяли концентрацию тромбоксана В2 в
крови при приеме данного препарата. Авторами было выделено 3 типа
«резистентности». Первый тип - фармококинетический, полностью
преодолевался добавлением большей дозы АСК in vitro и, вероятно,
связан с биодоступностью препарата. Второй тип —
фармакодинамический, приводил к частичному подавлению синтеза тромбоксана in vitro, что может быть связано с повышенной экспрессией циклооксигеназы-2 в кровяных пластинках, и с полиморфизмом гена циклооксигеназы-1. Третий тип - «псевдорезистентность», характеризовалась отсутствием влияния АСК на синтез тромбоксана и агрегацию тромбоцитов. Первый тип требует повышения дозы АСК, а второй и третий - замены данного препарата другим антитромбоцитарным препаратом [Weber А.А., 2002].
Тем не менее, АСК остается наиболее доступным и широко распространенным антитромботическим препаратом. Появление новых классов антитромботических препаратов не заменяет, а скорее, дополняет лечение АСК [Лагута П.С., 2005]. В настоящее время все более широко используют комбинацию АСК с ингибиторами GP-рецепторов, непрямыми антикоагулянтами. Расширение применения антитромбоцитарных препаратов, использование их комбинации требует решения вопроса об их безопасности. Необходим подбор оптимальной дозы препаратов и создание новых форм АСК.
Таким образом, в основе предупреждения развития ИБС должны лежать воздействия, направленные не только на стабилизацию бляшки, но и на нормализацию активности тромбоцитов и коагуляционного потенциала крови, которые существенно возрастают при ИБС.
Резюмируя данные литературы, можно утверждать, что вопросы патогенеза ИБС до конца не раскрыты. Новые сведения о механизмах
миграции клеток в очаг воспаления, каким и является атеросклеротическое повреждение сосудов, требуют дальнейшего развития учения об атеросклерозе и ишемической болезни сердца.
Атеросклероз как системное воспаление
Все более очевидной становится роль тромбоцитов как инициирующих агентов в развитии атеросклероза. Тромбоциты способны вступать непосредственно в контакт с эндотелиальными клетками, гранулоцитами, моноцитами, лимфоцитами и эритроцитами, образуя важную связь между воспалением и атеросклерозом [Gasser О., Schifferli J.A., 2004; Losche W., 2004; Weyrich A.S., Zimmerman G.A., 2004; Gawaz M., 2005]. Они играют значительную роль в инициации, развитии и полной степени атеросклеротического повреждения и во многих случаях является важнейшим патогенетическим механизмом кардиальной патологии. [Lindemann S., 2007., Gawaz М., 2008]. Известно, что кровяные пластинки не только являются участниками гемостаза, но и имеют непосредственное отношение к врождённому и адаптивному иммунитету, протеканию воспалительных реакций, регенерации и репарации повреждённых тканей [Цыбиков Н.Н.,1985; Витковский Ю.А., 1999; Ridker P.M., 2001; Solpov А., 2004]. Тромбоциты, находящиеся в общей циркуляции, содержат в себе около 35 а-гранул и 5 плотных гранул, которые являются основным местом хранения биологически активных соединений, и играют ведущую роль в свертывании крови, будучи основой формирования тромба и активатором плазменных факторов свертывания. В а-гранулах содержится большое количество медиаторов пептидной природы: тромбоцитарный фактор-4 (PF-4), 3-тромбоглобулин фG), фактор регулирующий активацию Т-клеток (RANTES), макрофагальный воспалительный пептид-la (MP-1а) [Шишкова А.С., 2000].
Агрегация тромбоцитов является одной из главных функций первичного звена гемостаза и служит важнейшим показателем реологических свойств крови. Первичный (сосудисто-тромбоцитарный) гемостаз предполагает взаимодействие двух структур - тромбоцита и сосудистой стенки.
Сосудистая стенка в норме обладает выраженными атромбогенными свойствами. Неповрежденный эндотелий создает механическую защиту, предотвращающую контакт крови и субэндотелиальных структур, продуцирует соединения, тормозящие адгезию и агрегацию тромбоцитов, таких как оксид азота (NO), простациклин, или простагландин h, АДФ-азу, представляет естественные антикоагулянты (антитромбин-Ш, протеин С, протеин S, тромбомодулин, кофактор-П гепарина) и активатор плазминогена тканевого типа. Основная роль тромбоцитов в физиологическом процессе гемостаза обусловлена их способностью к адгезии, агрегации и секреции биологически активных соединений [Вашкинель В.К., 1982; Баркаган З.С., 1988].
Многочисленные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что интенсивность воспаления в атеросклеротической бляшке связана с процессами тромбообразования, происходящие на ее поверхности. Тромбоциты первыми реагируют на разрыв атеросклеротической бляшки и образуют тромбоцитарную пробку [Fuster V., 1997]. Поэтому возрастание их активности считаются важными составляющими атеросклероза, и является непосредственной причиной развития острых сосудистых катастроф, таких как инфаркт миокарда (ИМ) и инсульт.
Коронарный тромбоз часто возникает на участках разрыва или повреждения бляшки. Незамедлительно после разрыва или эрозирования бляшки субэндотелиальный коллаген, липидный слой и прокоагулянты, такие как фактор фон Виллебранда (VWF), выходят в циркуляцию. В результате высвобождения в кровоток многочисленных проагрегантов (АДФ, серотонин, тромбоксан Аг, адреналин, тромбин и др.) происходит осуществление механизма положительной обратной связи, проявляющейся в усилении первоначальной агрегации тромбоцитов с одновременным вовлечением в процесс агрегации соседних неактивированных клеток. Единовременное действие нескольких индукторов агрегации (в противном случае в кровеносном русле постоянно образовывались бы тромбоцитарные тромбы) является стимулом к началу общего финального этапа агрегационного процесса: на мембранах псевдоподий происходят конформационные изменения ИЬ/Ша рецепторов, сопровождающиеся многократным увеличением их аффиности к своим лигандам, прежде всего к фибриногену и фактора фон Виллебранда [Rauch U., 2001; Massberg S., 2003; Neiswandt В., 2003]. Молекулы фибриногена и VWF, являясь мультивалентными, способны взаимодействовать одновременно с большим количеством тромбоцитов, что приводит к образованию многочисленных межклеточных "мостиков".
Значительная активация тромбоцитов отмечается также при различных патологических процессах воспалительной природы, так как секреторная фосфолипаза А2 является белком острой фазы. Она обусловливает гидролиз фосфолипидов, входящих в состав липопротеинов и клеточных мембран с образованием лизофосфолипидов, которые составляют субстрат для образования фактора активации тромбоцитов (ФАТ). Помимо этого, развитие острых коронарных явлений происходит вследствие не только осложненного течения атеросклероза венечных сосудов с разрушением бляшки, но и сопутствующего образования тромба, обтурирующего просвет сосуда в месте повреждения его стенки. В связи с этим многие исследователи рассматривают процесс, определяющий патогенез острого коронарного синдрома (ОКС) и его трансформацию в ИМ как «атеротромбоз».
Методы определения количества лейкоцитов
Подсчет общего числа лейкоцитов проводили стандартным методом в камере Горяева. Мазки крови фиксировали метанолом в течение 10 мин и окрашивали по Романовскому-Гимза. Подсчет клеток крови осуществляли под иммерсионным объективом х90, окуляр ХІ5.
Свежую фикол (плотность 1,077) и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 40 минут. Собирали интерфазное кольцо, содержащие клетки и кровяные пластинки, однократно промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3-4 мин. Надосадочную жидкость сливали, осадок микроскопировали в камере Горяева. Подсчитывали число лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов на 100 клеток. Степень адгезии цитратную кровь обследуемых больных наслаивали на градиент урографин- определяли как число кровяных пластинок, адгезированных на поверхности одного лимфоцита.
Исследование агрегационной способности тромбоцитов проводилось по следующей методике. Обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) получали из крови, взятой с использованием в качестве антикоагулянта 3,8 % раствора цитрата натрия в соотношении кровь: антикоагулянт 9:1. Кровь центрифугировали при 200 g в течение 7 мин при комнатной температуре. Из пробирки осторожно отбирали 2,5 мл супернатанта (верхнего слоя). Бедную тромбоцитами плазму (БТП) получали повторным центрифугированием остатков крови при 2000 g в течение 15 минут. Агрегацию тромбоцитов исследовали с помощью стандартного турбидометрического метода, с использованием двухканального лазерного анализатора агрегации тромбоцитов «Биола» (модель LA230). В качестве индуктора агрегации тромбоцитов использовали растворы в конечной концентрации: АДФ (5 и 2.5 мкг), коллагена (1 мг/мл) и адреналина (1,25 мкг/мл) фирмы «Технология-стандарт», г. Баранул. Оценивали степень и скорость спонтанной и индуцированной агрегации тромбоцитов по данным кривой среднего размера агрегатов и кривой светопропускания. Определение параметров агрегации по кривой среднего размера агрегатов: - степень агрегации определяется как максимальное значение среднего размера агрегатов и измеряется в относительных единицах (отн. ед), - скорость агрегации определяется как максимальный наклон кривой среднего размера агрегатов и измеряется в относительных единицах в минуту (отн. ед/мин).
Определение параметров агрегации по кривой светопропускания: - степень агрегации определяется как максимальное приращение светопропускания и измеряется в процентах (%), - скорость агрегации определяется как максимальный наклон кривой светопропускания и измеряется в процентах в минуту (%/мин.). Определение концентрации цитокинов IL-1RA, IL-4, IL-8 и IL-18 проводили иммуноферментным методом с использованием тест-наборов ООО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Техника проведения иммуноферментного анализа представлена в современных руководствах (Friemel Н., 1987; Ngo Т.Т., Lenhoff Н.М., 1988). Определение концентрации человеческого sP-селектина проводили иммуноферментным методом с использованием тест-наборов "Bender MedSystems GmbH" (Vienna, Austria).
Иммуноферментный анализ количественного определения растворимого человеческого sP-селектина
В соответствии с поставленной целью и задачами мы изучали механизм лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия, агрегационные свойства тромбоцитов, роль цитокинов и Р-селектина в развитии ишемической болезни сердца.
Поскольку системы иммунитета, гемостаза и неспецифической резистентности организма составляют так называемую единую интегральную клеточно-гуморальную систему защиты, то изменения в одной из составляющих обязательно приводит к сдвигам в других системах (Кузник Б.И., Цыбиков Н.Н., 1988; Витковский Ю.А., 1997, 2005).
Иммунитет представляет собой комплекс защитных реакций, направленных на обнаружение антигена, его обезвреживание и удаление из организма. В иммунной защите организма принимают участие иммунокомпетентные клетки, среди которых ведущее значение принадлежит лимфоцитам. Различают три популяции лимфоцитов. Первую из них составляют Т-лимфоциты, прошедшие функциональную дифференцировку в тимусе, вторую - В-лимфоциты, получившие специфические детерминанты у млекопитающих в аналогах сумки Фабрициуса птиц, третью - низкодифференцированные лимфоциты.
Лимфоциты различаются по наличию на клеточной мембране рецепторов к тем или иным антигенам, иммуноглобулинам, сигнальным молекулам (цитокинам) и т.д. Кроме того, лимфоциты несут на своей поверхности специфические маркеры, обозначаемые буквами CD (от англ. Claster of Determination) с добавлением порядковой цифры. Также в иммунном ответе принимают участие другие клетки, способствующие деструкции и элиминации антигенов, такие как макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и др.
Нами изучено содержание лейкоцитов, лимфоцитов в периферической крови у пациентов с ишемической болезнью сердца и здоровых лиц. Выявлено, что количество лейкоцитов в контрольной группе составило 6,8 ± 0,3 х ю9/л, тогда как у больных со стабильной стенокардией в первой подгруппе (не принимающие аспирин) - 7,3 ± 0,5 х 109/л (р 0,05), во второй (принимающие аспирин) - 7,0 ± 0,8 х Ю9/л (р 0,05). У пациентов первой подгруппы с прогрессирующей стенокардией этот показатель составил 8,3 ± 0,7 х Ю9/л (р 0,01), а во второй - 8,1 ±0,4 х 109 (р 0,05). При инфаркте миокарда в 1-2 сутки количество лейкоцитов повышалось до 9,5 ± 0,6 х Ю9/л (р 0,001), после этого к 10-12 суткам снижалось до 6,0 ± 0,4 х 109/л (р 0,05), а к 20-22 суткам незначительно повышалось - 8,3 ± 1,3 х Ю9/л (р 0,05) (табл. 1.).
Относительное число лимфоцитов в контрольной группе находилось в пределах 34,1 ± 2,0%). При стабильной стенокардии этот показатель равен в первой подгруппе — 30,0 ± 4,5% (р 0,05), во второй — 26,4 ± 2,5% (р 0,01). При прогрессирующей стенокардии у больных первой подгруппы он снизился до 26,7 ± 2,3% (р 0,01), во второй - 29,8 ± 1,3% (р 0,05). При инфаркте миокарда в 1-2 сутки заболевания этот показатель находился на минимальном уровне - 19,6 ± 2,0% (р 0,001), после чего к 10-12 суткам наблюдения возрос до 26,4 ± 2,6% (р 0,01), а к 20-22 суткам число лимфоцитов приблизилось к значению контрольной группы - 31,3 ± 2% (р 0,05) (табл. 1.).
Вместе с тем, у больных со стабильной стенокардией во второй подгруппе и при инфаркте на 1-2 и 10-12 сутки наблюдалось снижение абсолютного числа лимфоцитов. В других клинических подгруппах этот показатель соответствовал контролю (табл. 1.).
Феномен лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии представляет собой одну из физиологических функций, присущую различным субпопуляциям лимфоцитов, и реализуемую посредством адгезивных молекул. Наиболее выраженной способностью к образованию коагрегатов с интактными тромбоцитами обладают Т-хелперы (CD4+) и NK-клетки (CD 16+) (Витковский Ю.А., Кузник Б.И., Солпов А.В., 1999). Как известно, лимфоциты способны к спонтанному образованию коагрегатов с тромбоцитами. Доказано, что после активации тромбоциты экспрессируют следующие мембран - связанные молекулы на своей поверхности: CD40L и P-selectin. Посредством этих молекул тромбоциты могут контактировать с лейкоцитами [Lindemann S.,2000, Inwald DP., 2003]. Кроме того, различные типы лейкоцитов, включая Т-клетки экспрессируют CD40L и PSGL, которые могут взаимодействовать с соответствующими им рецепторами на тромбоцитарной поверхности [Hamburger S.A., 1990]. Сам тест ЛТА отражает функциональную активность иммунокомпетентных клеток, и был апробирован для оценки состояния иммунитета, как в норме, так и при патологических состояниях (Витковский Ю.А., 1999 - 2006; Ильиных Л.В., 2001; Леснидзе Э.Э., 2002; Солпов А.В., 2002-2006 и др.)
При использовании оригинальной методики, предложенной Витковским Ю.А. и соавт.(1999), в общем пуле лимфоцитов, выделенных у пациентов с ИБС, выявлено, что у пациентов со стабильной стенокардией, не принимавших аспирин, отмечалось снижение количества лимфоцитарно-тромбоцитарных агрегатов (ЛТА) до 8,0 ± 1,4% (р 0,01), с прогрессирующей стенокардией - 7,8 ± 0,8% (р 0,01) в сравнении с контрольной группой (14,3 ± 0,9%)
Число лейкоцитов и лимфоцитов у больных ИБС
В группе пациентов, перенесших инфаркт миокарда, также наблюдались значительные изменения агрегационных свойств тромбоцитов. В 1-2-е сутки развития инфаркта миокарда при оценке среднего размера агрегатов выявлено снижение индуцированной агрегации на фоне всех используемых индукторов агрегации. Так при внесении АДФ в дозе 5 мкг размер агрегатов кровяных пластинок уменьшался до 5,5 ± 0,5 отн. ед. (в контроле - 8,5 ± 0,7 отн. ед., р 0,05), АДФ 2,5 мкг — до 5,0 ± 0,5 отн. ед. (в контроле - 7,7 ± 0,6 отн. ед., р 0,05). У пациентов с инфарктом миокарда выявлено снижение размера агрегатов тромбоцитов в тест-системе с адреналином до 4,6 ± 0,4 отн. ед., против 6,8 ± 0,5 отн. ед. в контроле (р 0,05), с коллагеном - до 3,4 ± 0,4 отн. ед. против 5,8 ± 0,5 отн. ед. в контроле (р 0,05) (рис. 3.2.1.).
У больных с инфарктом миокарда на 10-12-е сутки несколько уменьшалась гипоагрегация тромбоцитов, однако при этом параметры индуцированной агрегации не достигли значений здоровых людей. При добавлении в качестве индуктора АДФ 5 мкг средний размер агрегатов составил 6,7 ± 0,4 отн. ед. (р 0,05), АДФ 2,5 мкг - 6,0 ± 0,4 отн. ед. (р 0,05), адреналина - 4,5 ± 0,4 отн. ед. (р 0,01), коллагена - 3,5 ± 0,4 отн. ед. (р 0,05) (рис.5.).
На 20-22-е сутки отмечалось нормализация показателей агрегационных свойств тромбоцитов. Так средний размер агрегатов кровяных пластинок по кривой АДФ (5 мкг) достиг 8,3 ± 0,6 отн. ед. (р 0,05), АДФ (2,5 мкг) - 8,7 ± 0,4 отн. ед. (р 0,05), адреналина - 7,2 ± 0,6 отн. ед. (р 0,05), коллагена - 6,0 ± 0,5 отн. ед. (р 0,05) (рис. 5.).
Изменение показателей агрегации по кривой светопропускания имела схожую картину. В первые сутки после развития инфаркта наблюдалось увеличение максимального значения и скорости спонтанной агрегации кровяных пластинок в сравнении с контрольной группой. При добавлении же индукторов агрегации выявлено значительное снижение агрегационных свойств тромбоцитов (табл. 4.).
Таким образом, у пациентов с инфарктом миокарда наблюдалась выраженная гипоагрегация тромбоцитов в 1-2 сутки, которая уменьшалась к 10-12 суткам. На 20-22 сутки агрегационные показатели кровяных пластинок соответствовали показателям контрольной группы.
При стабильной стенокардии в первой подгруппе (пациенты, не принимающие аспирин) выявлена обратная корреляционная связь средней силы, которая обусловлена снижением как числа ЛТА (8,0 ± 1,4%), так и агрегационной способности тромбоцитов при АДФ (2,5 мкг) - (г = -0,47, -0,37) и коллаген-индуцированной агрегации (г = -0,54, -0,32). Во второй подгруппе количество ЛТА соответствовало норме (13,8 ± 0,9%), но показатели активности кровяных пластин отличались. При спонтанной агрегации г = 0,33 и АДФ (5мкг)-индуцированной агрегации г = 0,40, 0,49 наблюдалась прямая корреляционная связь средней силы, и обратная средней силы связь между ЛТА и АДФ (2,5мкг)- и коллаген-индуцированной агрегацией (табл. 5.).
При прогрессирующей стенокардии наблюдалась схожая картина, присутствовала корреляционная связь средней силы (табл. 5.).
Нами обнаружено, что количество ЛТК у пациентов после инфаркта миокарда значительно варьировало. Поэтому мы разделили этих пациентов на подгруппы в зависимости от количества ЛТК. В первую подгруппу (n = 10) вошли пациенты с количеством ЛТК 12 %, во вторую от 12 до 16% (п = Ю), в третью 16% (n = 9).
Установлено, что в группе больных с минимальным содержанием тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов, признаки гипоагрегации тромбоцитов были наиболее выражены. Так по результатам кривой среднего размера агрегатов выявлено наличие корреляционной связи средней силы между числом ЛТК и агрегацией тромбоцитов в первые сутки после инфаркта (г = 0,48 - 0,89). По мере формирования рубца сила корреляции снижалась, а также изменялся ее характер за счет уменьшения признаков гипоагрегации (г = 0,32 - 0,52 на 10-12 сутки) и на 20-22 сутки корреляционная связь была слабой (табл.6.1.).
В подгруппе с нормальными показателями ЛТА показатель корреляционной связи на 1-2 сутки находился от -0,52 до -0,84, к 10-12 суткам он уменьшался, а к 20-22 суткам приобретал прежний характер (г = -0,40 - -0,98)(табл. 6.2.).
В подгруппе с увеличенным количеством ЛТК связь имела отрицательный характер, и была меньшей силы в сравнении с подгруппой с низким содержанием лейкоцитарно-тромбоцитарных агрегатов (г = -0,38 —0,48). На 10-12 сутки сила связи снижалась до -0,32 —0,37 По мере выздоровления ее сила становилась слабой (табл. 6.3.).
Таким образом, снижение количества лимфоцитарно-тромбоцитарных агрегатов в циркуляции указывает на хорошую восприимчивость к антиагрегационным препаратам, причем, чем ниже степень лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии, тем выраженнее гипоагрегация кровяных пластинок.
![Особенности факторов риска ишемической болезни сердца и гипертонической болезни среди коренного и некоренного населения г. Улан-Удэ [Электронный ресурс]](/i/i/4457/200638.png "Особенности факторов риска ишемической болезни сердца и гипертонической болезни среди коренного и некоренного населения г. Улан-Удэ [Электронный ресурс] Шедоева Марина Николаевна")
