Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА1 Обзор литературы 12
1.1. Естественное течение ХГС: многообразие факторов, определяющих темп прогрессирования фиброза
1.2. Факторы вируса 15
1.3. Факторы внешней среды, определяющие прогрессирование фиброза печени у больных ХГС
1.4. Факторы хозяина, влияющие на прогрессирование фиброза печени у больных ХГС 20
1.4.1 Длительность заболевания, возраст и пол 20
1.4.2. Иммуносупрессия, коинфекция HIV и HBV 23
1.4.3. Метаболические факторы прогрессирования ХГС (стеатоз, ^-инсулинорезистентность, сахарный диабет) 25
1.4.4. Генетические факторы «хозяина» прогрессирования ХГС... 28
ГЛАВА2 Материал и методы исследования 56
2.1. Материал исследования 56
2.2. Методы исследования 57
2.2.1. Анализ анамнестических, клинико-лабораторных и морфологических данных 57
2.2.2. Определение полиморфизма генов цитокинов и гена гемохроматоза 59
2.2.2.1. Выделение ДНК из цельной крови с помощью протеиназы К и экстракцией фенол-хлороформом 59
2.2.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) go
2.2.2.3. Рестриктный анализ 52
2.2.3. Статистическая обработка 54
ГЛАВА 3 Результаты собственных исследований 66
3.1. Клинико-морфологическая характеристика обследованных больных 66
3.2. Распространенность полиморфных маркеров исследованных генов в популяции, и у больных ХГС 74
3.3. Анализ взаимосвязи меэ/сду клинико-лабораторными показателями и носителъством вариантных аллелей исследованных генову больныхХГС *
3.4. Анализ взаимосвязи меэ/сду прогрессированием фиброза печени и носителъством вариантных аллелей исследованных генову больныхХГС $
3.5. Использование полиморфных маркеров исследованных генов для определения прогноза у больныхХГС 94
3.6. Анализ эффективности комбинированной противовирусной терапии в зависимости от носительства вариантных аллелей исследованных генов
ГЛАВА 4 Обсуждение результатов исследования 104
Выводы 131
Практические рекомендации 13з
Список литературы
- Естественное течение ХГС: многообразие факторов, определяющих темп прогрессирования фиброза
- Факторы внешней среды, определяющие прогрессирование фиброза печени у больных ХГС
- Анализ анамнестических, клинико-лабораторных и морфологических данных
- Клинико-морфологическая характеристика обследованных больных
Введение к работе
Актуальность темы. Прогноз хронического гепатита С (ХГС), являющегося наиболее частой причиной развития цирроза печени (ЦП) и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) [63], а также ведущим показанием к трансплантации печени [264], определяется темпом прогресснрования фиброза или развитием тяжелых внепеченочных проявлений и характеризуется значительными индивидуальными различиями [74]. Известно, что у 20-30% больных ХГС существует риск развития ЦП в течение 20-30 лет от момента инфицирования, и, в то же время, у значительной части пациентов с HCV-инфекцией формирования ЦП не происходит на протяжении всей жизни [16, 284]. Гетерогенность клинических проявлений и темпов прогресснрования фиброза печени при ХГС обусловливают сложность определения индивидуального прогноза заболевания и выбора тактики ведения больных.
В исследованиях, проведенных за два десятилетия с момента идентификации HCV, было установлено, что помимо целого ряда хорошо известных вирусных и внешних факторов, несомненная роль в определении течения и исходов ХГС принадлежит факторам хозяина [64]. Особое значение в работах последних лет отводится изучению генетического полиморфизма, играющего ключевую роль в определении индивидуальных особенностей ответа на один и тот же этиологический фактор [75]. Среди генетических факторов хозяина у больных ХГС большинство исследований посвящено изучению однонуклеотидного полиморфизма (SNP) — наиболее распространенной формы индивидуальной генетической вариабельности [76, 211]. Однонуклеотидный полиморфизм в ряде случаев сопряжен с увеличением или уменьшением концентрации/активности продукта гена. Принимая во внимание решающее значение иммунных механизмов и интенсивности оксидативного стресса в прогрессировании фиброза печени и формировании ответа на противовирусную терапию (ПВТ), наиболее широко обсуждаемыми генами-кандидатами являются
гены цитокинов и гемохроматоза [76]. При этом показано, что доминирование провоспалительных цитокинов ассоциировано с быстрым прогрессированием фиброза и лучшим ответом на ПВТ, тогда как преобладание противовоспалительных — с медленным накоплением фиброза и более низкой эффективностью ПВТ [94,217],
В литературе представлено большое число исследований, посвященных поиску взаимосвязи между аллельными вариантами генов-кандидатов и темпами прогрессирования фиброза печени, а также со спонтанным клиренсом вируса и ответом на ПВТ [234, 132, 109]. Вместе с тем, до настоящего времени убедительные данные об ассоциации однонуклеотидных замен с особенностями течения ХГС получены только для малого числа полиморфизмов. Разноречивость опубликованных работ во многом связана с неодинаковыми критериями включения/исключения больных, изучением различных популяций и обследованием сравнительно небольших групп больных, что увеличивает вероятность получения ложных ассоциаций [212]. В большинстве работ по определению клинической значимости генетического полиморфизма изучаются больные, имеющие дополнительные факторы прогрессирования фиброза печени (в т.ч. алкоголь) [241, 285], отсутствует оценка влияния на результаты исследования других факторов хозяина и вируса, длительности заболевания [71, 282], и только в единичных работах проводится анализ комбинации генетических факторов [241]. Особо следует отметить крайнюю немногочисленность отечественных работ по изучению генетического полиморфизма при заболеваниях печени, которые представлены единичными исследованиями по установлению генетических маркеров быстрого развития цирроза печени у пациентов с HCV-инфекцией [243] или у лиц, злоупотребляющих алкоголем [44].
Таким образом, разноречивость результатов исследований, в том числе вследствие различной популяционнои распространенности аллельных вариантов генов цитокинов и гемохроматоза, а также ограниченность данных по
российской популяции определили актуальность и необходимость проведения работы по выявлению аллельных вариантов генов-кандидатов, ассоциированных с особенностями течения и прогнозом ХГС.
Цель исследования: определить клиническую и прогностическую значимость носительства аллельных вариантов генов цитокинов и гена гемохроматоза, а также их влияние на результат противовирусной терапии у больных ХГС.
Задачи исследования:
Исследовать распространенность генотипов и аллелей полиморфных маркеров генов цитокинов (-511 С/Т гена IL-lb; -1082 G/A гена IL-10; -238 G/A гена TNF; -174 G/C гена IL-6 и +915 G/C гена TGF-bl) и гена гемохроматоза (C282Y и H63D) в российской популяции и у больных ХГС.
Проанализировать особенности клинико-лабораторной картины у больных ХГС в зависимости от носительства определенных аллельных вариантов исследованных генов цитокинов и гена гемохроматоза.
Определить взаимосвязь между полиморфными маркерами исследованных генов и темпом прогрессирования фиброза у больных ХГС.
Исследовать ассоциацию между генетическим полиморфизмом и эффективностью противовирусной терапии.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые в России проведено клинико-лабораторное и морфологическое исследование значительной по численности выборки больных ХГС, имеющих разный темп прогрессирования фиброза печени, с определением у них частоты генотипов и аллелей полиморфных маркеров генов цитокинов (IL-lb -511 С/Т; IL-10 -1082 G/A; TNF -238 G/A; IL-6 -174 G/C и TGF-bl +915 G/C) и гена гемохроматоза (HFE C282Y и HFE H63D). Впервые на большой группе здоровых доноров изучена распространенность генотипов и аллелей полиморфизма вышеуказанных генов в российской популяции.
Охарактеризованы особенности клинико-морфологической и
лабораторной картины заболевания в зависимости от носительства полиморфных маркеров исследованных генов. Впервые показана взаимосвязь между развитием смешанной криоглобулинемии (СКГ) и носительством больными ХГС генотипа гена IL-10 -1082 GG; также впервые показана ассоциация между уровнем гликемии и полиморфизмом гена TGF-bl +915 G/C; индексом массы тела и полиморфизмом гена IL-lb -511 С/Т.
Определены «профибротические» (IL-lb -511 СТ и -511 ТТ; IL-6 -174 GC и -174 СС; TGF-bl +915 GC и +915 СС; HFE 63FID и 63DD) и «протективные» (IL-lb -511 СС и IL-6 -174 GG) генотипы, ассоциированные соответственно с быстрым и медленным темпами прогрессирования фиброза печени. Показано, что комбинация «профибротических» и «протективных» генотипов является независимым фактором прогноза ХГС. Впервые среди отечественных работ продемонстрирована ассоциация генетического полиморфизма гена IL-10 -1082 G/A с эффективностью противовирусной терапии.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Результаты проведенного исследования, позволившие выделить клинические и генетические факторы, влияющие на особенности течения ХГС, темпы прогрессирования заболевания и эффективность противовирусной терапии, имеют значение для оценки прогноза ХГС. Установлены генетические факторы, влияющие на особенности клинико-лабораторной картины ХГС, в том числе развитие СКГ. Разработана модель определения прогноза ХГС, основанная на анализе комбинации «протективных» и «профибротических» полиморфных маркеров генов цитокинов и гемохроматоза. Присвоение баллов «протективным» и «профибротическим» генотипам позволяет вычислить суммарный балл генетического профиля больных ХГС и по его значению прогнозировать течение заболевания: выделить больных с благоприятным прогнозом и больных, наиболее угрожаемых по развитию ЦП. Установлены
клинические и генетические факторы, ассоциированные с низкой эффективностью противовирусной терапии. Проведенное исследование позволяет индивидуализировать тактику ведения больных ХГС, учитывая данные клинического и генетического обследования, а также разработать рекомендации по изменению образа жизни больными ХГС.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
У больных ХГС распространенность генотипа гена IL-lb -511 СС (52,6%) достоверно выше, чем в популяции (40,6%; р=0,006), на основании чего можно предполагать, что носительство данного генотипа, ассоциированного с низкой продукцией провоспалительного цитокина IL-lb, способствует хронизации HCV инфекции.
Больных ХГС с генотипом гена IL-10 -1082 GG имеют повышенный риск развития СКГ; носители гетерозиготного генотипа гена IL-lb -511 СТ имеют более высокий индекс массы тела, чем носители нормального (-511 СС) генотипа. У больных ХГС носительство генотипа гена TGF-bl +915 GC сопряжено с более высоким уровнем гликемии, а наличие мутации гена гемохроматоза C282Y (282 CY генотип) - с повышенным содержанием сывороточного железа. Выявленные ассоциации имеют значение в понимании патогенеза ХГС и позволяют прогнозировать особенности клинического течения заболевания.
Определение генетического профиля, представляющего собой комбинацию генетических полиморфизмов, ассоциированных с быстрым (генотипы гена IL-lb -511 СТ и -511ТТ; генотипы гена IL-6 - 174 GC и -174 СС; генотипы гена TGF-bl - +915 GC и +915 СС; генотипы гена HFE - 63HD и 63DD), и медленным (генотип гена IL-lb -511 СС; генотип гена IL-6 - 174 GG) темпом накопления фиброза, позволяет пропюзировать течение ХГС — оценить риск формирования ЦП, что имеет значение для выбора тактики ведения больных.
4. Генетический полиморфизм гена IL-10 -1082 G/A наряду с другими факторами хозяина определяет эффективность ПВТ. Генотип -1082 GG, ассоциированный с повышенной продукцией противовоспалительного цитокина IL-10, является независимым предиктором отсутствия ответа на лечение или рецидива виремии. Генетический анализ, выявляющий носительство этого генотипа, целесообразно использовать в оценке прогноза эффективности противовирусного лечения.
Естественное течение ХГС: многообразие факторов, определяющих темп прогрессирования фиброза
HCV инфекция характеризуется значительной вариабельностью клинической картины, течения и исходов поражения печени. Так ЦП развивается в 10-44% случаев ХГС через 5-40 лет после инфицирования [11, 16, 22, 42, 49, 106, 308, 312]. Столь различные оценки темпов прогрессирования фиброза и частоты формирования ЦП связаны с трудностями длительного проспективного изучения естественного течения ХГС [17, 257], а также многообразием факторов, определяющих скорость нарастания фиброза [7, 19, 107,232,238].
Freeman A.J. и соавт. [127], обобщив имеющиеся в литературе данные большого числа работ по изучению прогрессирования ХГС, установили, что частота развития ЦП через 20 лет после инфицирования варьирует от 3,8% до 25%. Таким образом, проведенное исследование подтвердило высокую вариабельность темпа прогрессирования фиброза и клинических проявлений у больных ХГС, а также наличие риска развития ЦП и его осложнений на протяжении жизни приблизительно у четверти инфицированных [127].
Роль вируса гепатита С в развитии поражения печени бесспорна, однако отсутствие четкой корреляции между уровнем виремии и степенью морфологических изменений в ткани печени и гетерогенность клинических проявлений у больных ХГС, имеющих одинаковый причинный фактор заболевания, свидетельствуют о наличии дополнительных детерминант, модифицирующих естественное течение ХГС [23, 64].
Несомненный вклад в вариабельность прогрессирования фиброза вносят, выявленные в многочисленных работах, популяционные особенности течения HCV инфекции [78, 154, 1170, 199]. В настоящее время имеются доказательства более тяжелого течения ХГС с высокой частотой развития ГЦК в некоторых регионах мира - в Японии, Италии, Испании, а также различия в частоте хронизации и тяжести течения HCV инфекции у чернокожих американцев и лиц белой расы, проживающих в одном и том же регионе [257]. Также установлено, что афроамериканцы имеют более высокий уровень хронизации HCV инфекции и хуже отвечают на ПВТ, чем белые или испаноязычные американцы [154], и, кроме того, частота формирования ГЦК в исходе ХГС у афроамериканцев в 2, а у азиатов в 4 раза выше, чем у белых [213].
Формирование ЦП сопряжено со значительным снижением качества жизни и выживаемости больных ХГС [4, 9, 13, 35, 172, 260]. Основными причинами смерти больных HCV инфекцией являются декомпенсированный ЦП и ГЦК [23, 64, 108]. По данным американских авторов 3, 5 и 10-летняя выживаемость больных с компенсированным ЦП составляет 96%, 91% и 79% соответственно [120], а кумулятивная вероятность декомпенсации составляет 5% в течение 1 года и достигает 30% спустя 10 лет после диагностирования ЦП [112, 156,260]. Ежегодная частота развития ГЦК у больных ЦП в Европе и США колеблется от 1% до 4%, а в Японии составляет 5-7% [93, 135,260].
Значительно реже прогноз и исход ХГС определяется развитием внепеченочных системных проявлений [2, 3, 21, 22] с поражением кожи, почек, синовиальных оболочек, органов лимфатической системы (селезенка, лимфатические узлы), которые, как правило, ассоциируются с наличием смешанной криоглобулинемии (СКГ) [18, 28, 29, 84]. На рисунке 1 приведено схематическое изображение естественного течения HCV инфекции от развития острого гепатита С до формирования ЦП, ГЦК и смерти больного.
Таким образом, широкая распространенность HCV инфекции, прогрессирующее течение заболевания, по-крайней мере у части больных, с развитием тяжелых осложнений и преждевременной смерти, диктует необходимость установления факторов, ассоциированных с прогрессирующим течением болезни и определяющих прогноз, для снижения частоты неблагоприятных исходов.
В настоящее время суждение о прогнозе ХГС основывается на представлении о скорости прогрессирования фиброза, которую предложено рассчитывать путем деления индекса фиброза F (в баллах) на длительность заболевания (в годах) с момента инфицирования до проведения морфологического исследования [17, 237]. Считается, что средняя скорость прогрессирования фиброза при ХГС составляет 0,12-0,15 единиц фиброза F в год. Именно такие расчеты, предполагающие неизменность темпов прогрессирования фиброза со временем, легли в основу прогнозирования срока болезни до формирования ЦП [237].
Факторы внешней среды, определяющие прогрессирование фиброза печени у больных ХГС
HCV характеризуется значительной генетической вариабельностью [26, 227] и в организме хозяина существует большое количество квазивидов [ПО], что обусловлено высоким уровнем мутаций в геноме вируса. Такая генетическая гетерогенность может быть причиной функциональных различий между изолятами HCV, что было подтверждено в большом числе исследований [41, 53, 117,195,228,299].
В научной литературе до настоящего времени сохраняется противоречивость в отношения влияния ряда факторов вируса на течение и прогрессирование ХГС [195, 228]. Большое число исследований было посвящено поиску корреляций между клиническими проявлениями заболевания (тяжестью и темпами прогрессирования фиброза, частотой развития ГЦК) и такими факторами вируса, как генотип, уровень виремии, наличие квази-видов.
В то время как в ранних работах было установлено, что генотип lb HCV связан с более тяжелым течением болезни, это предположение не было подтверждено в более поздних рандомизированных исследованиях [64]. Также не было подтверждено предположение о связи между генотипом вируса и активностью аминотрансфераз у больных ХГС [191]. Кроме того, не было получено убедительных данных о характере влияния уровня виремии и наличия квази-видов на прогрессирование ХГС [227]. Однако отсутствие четкой связи между течением ХГС и уровнем виремии не преуменьшает патогенетической роли вируса гепатита С, а только подчеркивает многофакторный механизм формирования повреждения печени.
В последние годы в литературе накапливается все больше данных о том, что некоторые белки HCV могут влиять на различные внутриклеточные метаболические и сигнальные каскады, усиливая либо наоборот блокируя их, тем самым, внося дополнительный вклад в прогрессирование фиброза [56, 57, 77, 187]. В этой связи наибольшее число работ посвящено изучению взаимодействия белка core с внутриклеточными сигнальными путями. В системе in vitro и на трансгенных мышах было показано, что белок core индуцирует оксидативный стресс вследствие нарушения цепи переноса электронов в митохондриях. Это приводит к повышенной продукции свободных форм кислорода (СФК) и пероксидации липидов [56, 98, 219]. Кроме того, в других работах было установлено, что белок core снижает активность антиоксидантных путей, в частности наблюдается сниженный уровень гемовой оксигеназы [57, 305] и, кроме того, активирует апоптоз гепатоцитов [72]. Повышенный уровень СФК не только повреждает гепатоциты, но и активирует звездчатые клетки, продуцирующие внеклеточный матрикс [128].
В работе Perlemuter G и соавт. (2002) [229] было установлено, что белок core блокирует активность микросомального переносчика триглицеридов (MTR), что нарушает сборку и секрецию липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и ведет к накоплению липидов в гепатоцитах, в результате чего развивается стеатоз печени. Кроме того, core-белок взаимодействует с аполипопротеинами А1 и А2, что также приводит к накоплению триглицеридов в гепатоцитах [67]. Наиболее выраженным стеатогенным эффектом, по мнению ряда авторов, обладает 3 генотип HCV [59]. Таким образом, можно предполагать, что при разных генотипах вируса доминируют различные патогенетические механизмы повреждения гепатоцитов, что требует дальнейшего изучения с целью оценки влияния факторов вируса на темпы прогрессирования фиброза, течение и прогноз ХГС.
Неструктурные белки HCV, также как и core белок, вовлечены в избыточную продукцию СФК и запуск апоптоза, однако механизм их патогенного действия до настоящего времени не уточнен [56, 77, 305]. Экспрессия NS5A белка в печени в условиях мышиной трансгенной модели приводит к блокированию апоптоза, индуцируемого TNF [191], что, как предполагается, может способствовать развитию ПДК у больных ХГС.
При использовании технологии микрочипов было показано, что экспрессия NS5A в Huh-7 клетках приводит к увеличению транскрипции генов, вовлеченных в фиброгенез, как например, генов из семейства TGF-b [133].
Таким образом, HCV может способствовать прогрессированию фиброза печени независимо от активации иммунной системы и воспаления, и, по-видимому, эти эффекты являются генотип-специфичными.
Анализ анамнестических, клинико-лабораторных и морфологических данных
При анализе данных анамнеза жизни и заболевания особое внимание обращали на установление факта перенесенного ОВГ, желтушной формы ОВГ и наиболее вероятного фактора риска инфицирования, от которого производился отсчет длительности заболеваїїия. У некоторых больных имело место несколько факторов риска инфицирования, при этом наиболее вероятным моментом инфицирования считалось воздействие, предполагающее максимальный объем инфицирующего материала. В случае наличия нескольких одинаковых факторов риска (несколько гемотрансфузий), момент инфицирования рассчитывался как среднее между наиболее ранним и наиболее поздним фактором. Кроме того, больные тщательно расспрашивались относительно употребления алкоголя.
У больных с декомпенсированным циррозом печени обращали внимание на давность декомпенсации (кровоточивость, наличие синяков, появление отеков, увеличение живота, вздутие живота).
При сборе анамнеза также обращали внимание на наличие жалоб на боли в суставах, высыпания на коже.
Всем больным, включенным в исследование, было проведено тщательное клинико-лабораторное и инструментальное обследование. Биохимические исследования сыворотки крови больных проводились в динамике (анализаторы "Technicon", "Toshiba", межклиническая биохимическая лаборатория ММА им. И.М. Сеченова, зав. - Т.Н. Александровская).
Иммунологические исследования включали определение уровней сывороточных иммуноглобулинов классов А, М и G по Манчини, общей гемолитической активности комплемента — СН50, исследование антинуклеарных антител, активности ревматоидного фактора, криоглобулинов осадочным методом, альфа-фетопротеина. Эти исследования проводились в межклинической иммунологической лаборатории ММА им. М.И. Сеченова (зав. - Н.М. Кудряшова).
У всех больных до 40 лет проводилось исключение болезни Вильсона-Коновалова (осмотр офтальмологом с помощью щелевой лампы, определение уровня церуллоплазмина в сыворотке крови).
Исследование уровней гормонов щитовидной железы и антитела к тиреоглобулину радиоиммунным методом проводилось в межклинической гормональной лаборатории ММА им. И.М. Сеченова. больным было проведено морфологическое исследование ткани печени с определением индекса гистологической активности и стадии фиброза по Knodell RG. Гистологическое исследование препаратов ткани печени проводилось доцентом Т.П. Некрасовой (кафедра патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова, зав. - акад. РАН и РАМН проф. М.А. Пальцев)
Венозная кровь в объеме 5 мл забиралась в пробирки, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта (1 объем раствора 0,5 М №2-ЭДТА, рН 8,0 + 9 объемов крови). После тщательного перемешивания образцы помещались в морозильную камеру и хранились при -20С. Выделение геномной ДНК проводили с помощью модифицированного метода с протеиназой К и экстракцией фенол-хлороформом. Для выделения ДНК в 1,5 мл пробирку (Eppendorf) вносили 700 мкл размороженной крови и 700 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА), перемешивали на вортексе и осаждали клетки центрифугированием 2 минуты при 7000 об/мин. Затем из пробирок удаляли 700 мкл супернатанта. Клеточный осадок ресуспендировали на вортексе или постукивая о дно пробирки, после чего добавляли 750 мл ТЕ-буфера или гемолитика и повторяли осаждение клеток центрифугированием 3 минуты при 7000 об\мин. Удаляли весь супернатант. Процедуру повторяли дважды, пока осадок не становился бесцветным либо слабоокрашенным. К клеточному осадку добавляли 400 мкл буфера для протеиназы К (10 мМ Трис-С1, рН 7,4, 10 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl), содержащего 0,5% SDS и 100 мкг/мл протеиназы К (до конечной концентрации 200 мкг/мл). Ресуспендировали осадок пипетированием, после чего инкубировали 4 часа при 600С на термошейкере с постоянным перемешиванием (850 об/мин).
После 4 часовой инкубации к образцам добавляли сначала по 400 мкл фенола, перемешивали на вортексе и оставляли на 5 минут при комнатной температуре, периодически перемешивая; через 5 минут производили разделение фаз центрифугированием 2 минуты при 10000 об\мин. Верхнюю водную фазу (350 мкл) переносили в новую пробирку, затем добавляли 200 мкл фенола и смесь хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), хорошо перемешивали на вортексе и оставляли на 5 минут при комнатной температуре, периодически перемешивая. Через 5 мин производили разделение фаз центрифугированием 2 минуты при 10000 об/мин. Верхнюю водную фазу (300 мкл) переносили в новую пробирку, добавляли в нее 400 мкл смеси хлороформа-изоамилового спирта (24:1), перемешивали на вортексе и разделяли фазы центрифугированием 2 минуты при 10000 об/мин. Верхнюю водную фазу (240 мкл) переносили в новую пробирку, измеряли объем и добавляли 1/10 объема 3 М ацетата Na, рН 5,2, и 2,5 объема 96% этанола (охлажденного до -20С). Пробирку оставляли на 20 мин при -20С, после чего ДНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин и удаляли супернатант.
К осадку добавляли 1 мл 70% этанола, аккуратно перемешивали, центрифугировали 2 мин на максимальных оборотах, супернатант удаляли, а осадок высушивали на термошейкере при 37 С с постоянным перемешиванием до исчезновения видимых следов этанола (примерно 20-30 мин). Осадок растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) при 370С в течение 30 мин с периодическим перемешиванием. Измеряли концентрацию ДНК на спектрофотометре Eppendorf. Добавляли ТЕ-буфер до концентрации ДНК 50 нг/мкл. ДНК хранили при -20С.
Клинико-морфологическая характеристика обследованных больных
ХГС, занимая ведущее место в структуре причин ЦП, его осложнений и смерти больных в исходе хронических прогрессирующих заболеваний печени, является актуальной проблемой современной гепатологии. Прогноз хронического гепатита С (ХГС), определяемый темпом прогрессирования фиброза или развитием тяжелых внепеченочных проявлений характеризуется значительными индивидуальными различиями, которые, как полагают, обусловлены факторами вируса, внешними воздействиями и факторами хозяина, в том числе генетическими [318]. Исследования последних двух десятилетий, не подтвердив предполагавшейся ранее ключевой роли факторов вируса в прогрессировании заболевания, показали, что целый ряд хорошо известных внешних факторов имеет несомненное, а факторы хозяина — решающее влияние на течение и исходы ХГС [64,204].
Особое внимание исследователей к фиброзу печени - прогрессирующему накоплению внеклеточного матрикса — обусловлено его большой значимостью для прогноза ХГС. Фиброз печени может рассматриваться как заболевание, при котором уникальная комбинация генетических факторов хозяина взаимодействует с вирусными и внешними факторами [75]. В настоящее время ключевую роль в прогрессировании ХГС придают особенностям иммунного ответа организма хозяина, в частности генетически детерминированным уровням секреции цитокинов в ответ на повреждающий фактор, и интенсивности оксидативного стресса, определяемой, в том числе, уровнем свободного железа [75,232].
Цитокины - группа гормоноподобных белков и пептидов, синтезируемых и секретируемых клетками иммунной системы и другими типами клеток, основные биологические функции которых связаны с регуляцией развития и гомеостаза иммунной системы, контролем за ростом и дифференцировкой клеток и участием в неспецифических защитных реакциях организма [128].
Применительно к прогрессированию фиброза печени наибольший интерес к изучению вызывают цитокины, участвующие в таких процессах, как воспаление, регенерация гепатоцитов и фиброгенез, типичными представителями которых являются IL-lb, TNF, IL-6, IL-10 и TGF-bl [251]. Поскольку считается, что до 50% индивидуальных различий в продукции цитокинов обусловлено наличием полиморфизма (однонуклеотидных замен в пределах гена), закономерно ожидать, что аллельные варианты, связанные с изменением продукции названных цитокинов, могут модифицировать естественное течение ХГС и служить дополнительными маркерами течения заболевания и его прогноза, а также ответа на ПВТ [296, 307].
Другим важным звеном патогенеза прогрессирования фиброза при ХГС является гиперпродукция свободных форм кислорода, приводящая к усилению перекисного окисления липидов и повреждению гепатоцитов [15, 31, 47, 54]. Одним из наиболее актуальных при болезнях печени факторов, способствующих гиперпродукции свободных радикалов, является избыток железа. Сочетание синдрома перегрузки железом, часто наблюдаемого при ХГС [73], с наследственной предрасположенностью к избыточному всасыванию этого микроэлемента, способствует большему накоплению железа в организме, преимущественно в паренхиматозных органах, что может приводить к усилению оксидативного стресса при поражениях печени. Наиболее распространенной наследственной причиной избыточного всасывания железа в ЖКТ, является полиморфизм гена гемохроматоза (HFE). В настоящее время описано несколько мутаций в этом гене, однако клинически наиболее значимыми являются C282Y HH63D[15].
За последние годы в литературе накоплено большое число данных свидетельствующих о ключевой роли факторов хозяина в развитии ЦП у больных ХГС. Изучена ассоциация значительного количества полиморфизмов генов-кандидатов с особенностями течения ХГС и ответа на ПВТ. В единичных работах полученные данные апробированы в дополнителыю обследованной группе больных и показана возможность использования результатов генетического тестирования для определения прогноза ХГС [241, 159].
Вместе с тем необходимо отметить, что в большинстве опубликованных исследований приводятся противоречивые данные. Разноречивость опубликованных работ во многом связана с неодинаковыми критериями включения/исключения больных, изучением различных популяций и часто обследованием недостаточных размеров выборки больных, что увеличивает вероятность выявления ложных ассоциаций [212]. К недостаткам большинства работ по определению клинической значимости генетического полиморфизма следует отнести частое включение больных с дополнительными факторами прогрессирования фиброза печени (в т.ч. алкоголь) [234, 241], отсутствие оценки влияния на результаты исследования других факторов хозяина и вируса, частое подразделение больных только на основании установленной стадии фиброза печени, без учета длительности заболевания [71, 282], а также отсутствие анализа комбинации генетических факторов. Особо следует отметить крайнюю немногочисленность работ по изучению генетического полиморфизма у больных ХГС в России.
Таким образом, обзор данных литературы по патогенезу фиброза печени, а также результаты предшествующих работ, главным образом, зарубежных авторов, определили наш выбор в пользу исследования функционально значимого полиморфизма генов цитокинов (-511 С/Т гена IL-lb, -1082 G/A гена 1L-10, -238 G/A гена TNF, -174 G/C гена IL-6 и +915 G/C гена TGF-bl) и гена гемохроматоза (FIFE C282Y и HFE H63D) с целью изучения его клинической и прогностической значимости.
![Значение полиморфизма генов цитохрома-Р4502С19 и интерлейкина-1[В] для прогноза эффективности эрадикационной терапии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter](/i/i/4270/366296.png "Значение полиморфизма генов цитохрома-Р4502С19 и интерлейкина-1[В] для прогноза эффективности эрадикационной терапии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированной с Helicobacter Оганесян Татьяна Сергеевна")
