Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы
1.1. Введение
1.2. Современное представление о факторах прогрессирования ХГС .
1.3. Факторы, влияющие на темп прогрессирования ХГ С.
1.4. Спектр внепеченочных клинических проявлений при HCV-инфекции.
1.5. Роль провоспалительных цитокинов в течение ХГ С
1.6. Цитохром Р450
1.7. Заключение
Глава II Материалы и методы
II. 1. Общие клинико-лабораторные методы исследования 38
11.2. Специальные методы исследования. 40
Глава III Результаты собственного исследования
III. 1. Общая характеристика больных хроническим гепатитом С.
III.2. Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови у больных ХГ С
III.3 Уровень ИЛ-6 в моче больных ХГ
Ш.4. Полиморфизм гена KJI-6-174G/C у больных ХГ С
III. 5. Экспрессия гена цитохрома Р-450 в ткани печени больных ХГ С
Заключение
Выводы
Практические рекомендации
Библиографический список использованной литературы
- Современное представление о факторах прогрессирования ХГС
- Факторы, влияющие на темп прогрессирования ХГ С.
- Общие клинико-лабораторные методы исследования
- Общая характеристика больных хроническим гепатитом
Введение к работе
Глава I Обзор литературы
Введение
Современное представление о факторах прогрессирования ХГС.
Факторы, влияющие на темп прогрессирования ХГ С.
Спектр внепеченочных клинических проявлений при HCV-инфекции.
Роль провоспалительных цитокинов в течение ХГ С
Цитохром Р450
Заключение
Стр.
Современное представление о факторах прогрессирования ХГС
В настоящее время, среди множества факторов, участвующих в поддержании активности ХГС, рассматривают влияние факторов вируса (генотип, квазивиды, уровень виремии, длительность инфицирования), особенности хозяина (возраст, пол, генетические факторы, иммунная реактивность и др.) и дополнительные факторы (инфекция другими вирусами, факторы внешней среды, сопутствующие патологические состояния и др.). Значение некоторых из этих факторов (возраст в момент инфицирования, пол, злоупотребление алкоголем, коинфекция HBV, HIV) убедительно доказано, роль других либо высоко вероятна, либо пока недостаточно изучена [8]. В частности, несмотря на подробное изучение спектра внепеченочных проявлений, частота которых нарастает с увеличением длительности ХГ С [3,26,56,73], механизм их развития и роль в прогрессировании заболевания оценено недостаточно.
Влияние генотипа, степени гетерогенности популяции вируса (квазивиды), объема инфицированного материала (уровень виремии), в том числе с применением многофакторного анализа на течение и прогноз ХГС разноречивы [42,60,99]. Считается, что более тяжелое поражение печени вызывается генотипом lb (возможно за счет влияния дополнительных факторов - инфицирование при гемотрансфузиях и в более пожилом возрасте) и За (в связи с предполагаемым при этом генотипе более значимым развитием стеатоза печени и более быстрым прогрессированием фиброза) [60,99]. С другой стороны, тяжесть инициального поражения печени зависит и от количества инфицированного материала.
К настоящему времени в исследованиях с проведением многофакторного анализа убедительно доказано влияние на течение ХГС возраста в момент инфицирования (больные старших возрастных групп имеют более тяжелое течение) и пола - принадлежность к тому или иному является независимым фактором, определяющим темпы прогрессирования ХГС [9]. В исследовании Kiyosawa К.(1996) ГЦК развивалась в 4 раза чаще у мужчин, чем у женщин [114].
В последние годы накапливаются данные о возможном влиянии генетических факторов или их комбинации с уже известными клиническими факторами на темпы прогрессирования заболевания и прогноз ХГС [153]. Наиболее широко изучаемыми генетическими факторами являются однонуклеотидные полиморфизмы (однонуклеотидная замена-SNP), которые в ряде случаев сопряжены с увеличением или уменьшением концентрации и/или активности продукта гена [154]. Считают, что наличие однонуклеотидных замен является одним из факторов, определяющих индивидуальные особенности течения болезней, и их выявление может быть использовано для определения прогноза заболевания. Между тем, результаты исследований, касающихся изучения ассоциации полиморфизма генов-кандидатов с вариантами течения ХГС, до настоящего времени не дали однозначного ответа. Так, в работе Powell Е. и соавт. (2000) было установлено, что в случае совместного наследования профибротического аллеля гена TGF-b 1 и гена ангиотензиногена, у их носителей обнаруживалась более тяжелая стадия фиброза, чем у пациентов, не имеющих этих полиморфных маркеров или имеющих только один из них [160]. В исследовании Richardson М. и соавт. (2005) показано, что комбинация из 8 профибротических аллелей может быть использована для определения прогноза ХГС [160]. Особый интерес представляют результаты масштабной работы американских авторов, которые, проанализировав 24823 полиморфизма у 433 больных ХГС, установили, что с прогрессированием фиброза ассоциированы 1609 однонуклеотидных замен [103].
Изучается возможное влияние гетерозиготного носительства гена гемохроматоза (HFE) и гена дефицита а-1 антитрипсина (фенотип Pi MZ) на прогрессирование ХГС.
Не меньший интерес в последнее время вызывает изучение влияния полиморфизма генов цитокинов на темпы прогрессирования фиброза у больных ХГС. В работе Абдуллаева СМ. и соавт. (2007), при анализе полиморфизма генов цитокинов (IL-lb -511 С/Т, IL-6 -174 G/C, IL-10 -1082 G/A, TGF-bl +915 G/C) и гемохроматоза (C282Y, H63D), были установлены аллели, ассоциированные с прогрессирующим вариантом течения ХГС -«профибротические» (аллель гена IL-lb -511 С, гена IL-6 -174 С, гена TGF-bl +915 С) и наоборот, ассоциированные с медленным развитием фиброза -«протективные» (генотип гена IL-lb -511 СС и гена IL-6 -174 GG) [1 ].
Помимо генетических факторов, важное значение для оценки прогноза ХГС отводят внепеченочным проявлениям HCV-инфекции.
Факторы, влияющие на темп прогрессирования ХГ С.
Особую роль в развитии внепеченочных поражений иммунокомплексного генеза отводят смешанной криоглобулинемии (СКГ), частота выявления которой среди больных хроническим вирусным гепатитом С в различных регионах и этнических группах колеблется от 19 до 66% [66,79,100,172].
В настоящее время СКГ II типа с наличием моноклонального SMK компонента рассматривают как специфический маркер хронической HCV-инфекции. Проведенные популяционные исследования показали высокую частоту обнаружения HCV-инфекции среди больных с СКГ (63-93%) [66,79,172]. В исследовании Малышко Е.Ю. (1998 г.) среди 50 больных с СКГ у 76% были обнаружены антитела к HCV, из них у 28% - в сочетании с маркерами HBV-инфекции. [ 14,27]. Появление доказательств роли HCV в качестве этиологического фактора СКГ явилось мощным толчком в изучении патогенеза СКГ и криоглобулинемического васкулита. Согласно одной из концепций, вирус в комплексе с сывороточными липопротеинами (или в сочетании с другими факторами, например, вирусом Эпштейна-Барр) вызывает прямую антигенную стимуляцию особой субпопуляции В-клеток CD5+ (или В1) с выработкой ими поликлонального IgMk-РФ или моноклонального IgMk-РФ, которые при определенных условиях соединяются в циркуляции или in situ с анти-HCV-IgG, образуя КГ соответственно III или II типа. [15,40,117,180].
Основным звеном в процессе образования КГ при HCV-инфекции является синтез IgM-РФ, действующего как антитело к комплексу антиген HCV-IgG. Около 90% молекул IgM-РФ имеют в антигенсвязывающем участке одинаковый WA-кросс идиотип (по инициалам больного, у которого впервые был идентифицирован), который представлен кросс-идиотипом легких цепей 17-109 и кросс-идиотипом тяжелых цепей G6, образующихся, как считают, вследствие ограничения экспрессии gremlin-генов [15,166] Такая специфичность ревматоидного фактора предполагает, что продукция его обусловлена стимуляцией одним и тем же антигеном, роль которого играет белок оболочки HCV-E2. По результатам исследований последних лет получены данные о лимфотропности HCV, о наличии иммунодоминантных эпитопов в оболочечном белке E2-HCV, ответственных за связывание со специфическими рецепторами на поверхности В-лимфоцитов. Предполагаемым специфическим рецептором для E2-HCV является клеточный протеин CD81 - необходимый компонент В-клеточного рецепторного комплекса, снижающего порог активации В-лимфоцитов. В результате взаимодействия поверхностных антигенов HCV со специфическими рецепторами на поверхности В-лимфоцитов происходит активация В-лимфоцитов и повышение экспрессии белка Вс1-2, ингибирующего их апоптоз, что может объяснить В-клеточную пролиферацию и продукцию аутоантител, в том числе моноклонального IgMK-РФ [69,136].
Преципитация криокомплекса возможна при наличии 3-х компонентов - core-HCV, IgM-РФ и IgG. Связывание этих компонентов в циркуляции и in situ рассматривают как активный иммунный процесс, сопровождающийся отложением в мелких сосудах (артериях и венах) иммунных комплексов с потреблением комплемента и развитием воспаления - иммунокомплексного васкулита, имеющего различные клинические эквиваленты - кожную пурпуру, триаду Мельтцера (слабость, пурпура, артралгии), нейропатию, поражение легких, абдоминалгии, гломерулонефрит (ГН) [116].
Кроме васкулитов, хронический гепатит С может сопровождаться аутоиммунным тиреоидитом, полимиозитом, дерматомиозитом, синдромом Шегрена, идиопатической пурпурой и другими внепеченочными проявлениями. [69].
Среди внепеченочных поражений при ХГ С наиболее часто встречается поражение кожи, которое проявляется сосудистой пурпурой, крапивницей и ретикулярным ливедо, особенно у больных КГ (от 70 до 100%). Морфологически кожный васкулит при КГ обычно лейкокластического типа, редко некротизирующий по типу узелкового полиартериита [10,11,6,23]. Патогенетическая роль HCV в развитии кожного васкулита подтверждается выявлением HCV-RNA, а также антигенов HCV (иммуногистохимическими методами) в коже больных ХГС и КГ [15,116]. Считается, что иммунные комплексы в сосудах кожи формируются in situ через фиксацию антигена HCV на эндотелии с присоединением циркулирующих иммуноглобулинов IgG (анти-HCV) и моноклонального IgMk-РФ, причем этому способствует стаз, гидростатическое давление и охлаждение в субэндотелиальных посткапиллярных венулах - основном месте повреждения сосудов. Развитие иммунного воспаления происходит в результате активации комплемента и привлечения лейкоцитов. Помимо кожного васкулита, имеются единичные описания узловатой и многоформной эритемы, связанной с HCV-инфекцией [15].
Общие клинико-лабораторные методы исследования
Обследование больных, вошедших в основную группу, проводили по плану, включающему изучение жалоб и анамнеза, физическое обследование, клинические анализы крови и мочи, пробы мочи по Нечипоренко и по Зимницкому, пробу Реберга, биохимическое исследование сыворотки крови, определение уровня С-реактивного белка, иммунологические тесты -определение иммуноглобулинов сыворотки (метод одномерной радиальной иммунодиффузии в агарозе по Манчини), гемолитической активности комплемента (по 50% гемолизу в реакции гемагглютинации в модификации Резниковой), активности ревматоидного фактора (с использованием реакции Ваале-Роузе и латекс-теста), ультразвуковое исследование органов брюшной полости, эзофагогастродуоденоскопию, рентгенологическоге исследование органов грудной клетки.
Поражение печени диагностировали на основании изучения анамнеза, в том числе выявления известных факторов риска инфицирования вирусом гепатита С, клинических и лабораторных признаков заболевания печени, включающих наличие HCVAb, HCVRNA, в сыворотке крови, изучение следующих синдромов: цитолиза (повышение аланинаминотрансферазы ACT, аспартатаминотрансферазы - АЛТ), холестаза (повышение уровня гамма-глютамил-транспептидазы-ГГТ, щелочной фосфотазы - ЩФ5 билирубин), портальной гипертензии (варикозное расширение вен пищевода и желудка, спленомегалия, асцит), печеночноклеточной недостаточности (гипопротеинемия, гипоальбуминемия, снижение протромбина, фибриногена, холестерина), желтухи (повышение сывороточного билирубина за счет прямой его фракции). У 91 больного был определен генотип вируса.
Морфологическое исследование печени проведено у 59 больных. Материал, полученный в результате пункционной биопсии, заливался в парафин, с каждого блока приготовлялись тонкие срезы, которые окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону. Оценивались параметры активности воспаления с определением индексов гистологической активности и стадии фиброза по R.G. Knodell. Морфологическое исследование печеночных биоптатов выполнено на кафедре патологической анатомии ММА им.И.М.Сеченова.
Клиническая картина поражения почек оценивалась с учетом величины суточной протеинурии, эритроцитурии (ориентировочным методом и количественным по Нечипоренко), уровня общего белка и альбумина сыворотки. Состояние азотовыделительной функции почек определялось по величине клиренса эндогенного креатинина в пробе Реберга в модификации Е.М.Тареева. Суждение об активности почечного процесса складывалось на основании нарастания протеинурии, формирования нефротического синдрома, усиления гематурии, диспротеинемии, снижения почечных функции и данных морфологического исследования. Поражение почек выявляли на основании наличия стойкого мочевого синдрома, изменения функциональных показателей почек с учетом появления их у больных хроническим гепатитом С в отсутствии других возможных причин: предшествующее хроническое заболевание почек, сахарный диабет и т.д.
У 3 больных с тяжелыми формами нефрита было проведено морфологическое исследование почек. Материал для морфологического исследования получали с помощью чрезкожной пункционной биопсии почек. Морфологическое исследование почечных биоптатов выполнено на кафедре патологической анатомии ММА им.И.М.Сеченова.
Общая характеристика больных хроническим гепатитом
В последние два десятилетия в мире проводятся широкие исследования проблемы хронического гепатита С, что обусловлено продолжающимся нарастанием распространения инфекции вируса гепатита С среди населения. Несмотря на это, многие вопросы, касающиеся патогенеза, факторов прогрессирования и путей влияния на них далеки от разрешения. Для определения критериев прогноза течения ХГ С нами оценена связь уровня интерлейкина-6 в сыворотке крови и моче с особенностями клинического течения, степенью фиброза и нарушениями экспрессии гена цитохрома Р450 в печени у 124 больных с диагнозом ХГ С, подтвержденным наличием HCVRNA в сыворотке крови.
Предполагаемая длительность течения ХГС у обследуемых больных составила от 1 года до 45 лет (в среднем - 19,1±11,7 лет). У 23 больных по данным клинико-лабораторного и морфологического исследования определена IV степень фиброза печени.
Среди 42 больных с рассчитанным темпом прогрессирования фиброза более чем у половины (55%) отмечался медленный темп прогрессирования фиброза печени (менее ОД ед. фиброза/год), 20% имели средний темп прогрессирования (0,1-0,13 ед. фиброза/год), и у 25% - быстрый темп нарастания фиброза в ткани печени ( 0,13 ед.фиброза в год).
Системные проявления (криоглобулинемия, поражение кожи, почек, легких, суставов и др.) наблюдались у 59 (48%) среди 124 больных, что согласуется с данными литературы о частоте внепеченочных поражений у больных ХГ С в гепатологических центрах Европы (40-74%) и результатами исследований, ранее проведенными в клинике им.Е.М.Тареева (47%) [10, 25, 35].
Криоглобулинемия, как наиболее частый и специфический признак HCV-инфекции, составила в целом по группе 35,5%. Полученные данные практически не отличаются от приводимых в литературе: частота СКГ среди лиц, инфицированных HCV, в Европе оценивается от 34% в Италии до 54% во Франции. В этих и других работах показано, что криоглобулинемия при HCV-инфекции принадлежит ко II типу по классификации I.C.Brouet и соавт. (1974), и содержит моноклональный IgMk РФ, с которым связывают развитие криоглобулинемического васкулита [15, 166, 190].
По нашим данным криоглобулинемия являлась интегральным признаком, с которым сочетались другие системные проявления.
Так, все наблюдаемые нами внепеченочные поражения, кроме синдрома Шегрена и поражения щитовидной железы, встречались значительно чаще у больных с КГ, чем без криоглобулинемии.
Поражение почек у большинства больных с КГ (15 из 20) развивалось в среднем через 3,2±2,86 года после первых симптомов КГ, часто после появления кожного васкулита (пурпуры). Это согласуется с устоявшимся к настоящему времени представлением об ассоциированном с вирусом гепатита С поражении почек как о проявлении криоглобулинемического васкулита - преимущественно криоглобулинемическом гломерулонефрите (морфологически мезангиокапиллярном гломерулонефрите) [7, 65, 189]. И действительно, у 3 наблюдаемых нами больных с остронефритическим и нефротическим синдромами и выраженной гематурией при биопсии почки были выявлены морфологические признаки криоглобулинемического мезангиокапиллярного гломерулонефрита.
Клинически по нашим данным, как и по данным литературы [7, 15, 65, 189], у большинства - 60% больных наблюдался умеренный мочевой синдром, у 25% - нефротический синдром и у 15% - тяжелый остронефритический синдром с последующим развитием быстропрогрессирующего гломерулонефрита с увеличением сывороточного креатинина за короткий срок от нормального уровня до 3,8 и 7,0 мг/дл). Артериальная гипертония, нередко трудно коррелируемая с помощью современных антигипертензивных средств, наблюдалась у 75% больных с поражением почек, являясь особенностью этой формы гломерулонефрита [65]. Уровень ИЛ-6 был исследован у всех 124 больных в сыворотке крови и у 57 в моче иммуноферментным методом с использованием тест-систем "Pro con" (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург) и «Benter MedSystems» (Австрия).
Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови составил в целом по группе 7,4±14,8 пг/мл (от 5 до ПО пг/мл), что превышает этот показатель у здоровых людей (до 5 пг/мл); частота выявления гиперпродукции ИЛ-6 - 35% (у 44 из 124) соответствует данным литературы - в исследованиях А.С.Логинова и соавт. (2001) гиперпродукция ИЛ-6 обнаружена у 37% больных ХГ С [44].
Среди 44 больных с повышенным уровнем ИЛ-6 в сыворотке крови у большинства - 66% повышение было умеренным (до 2 норм), у 27% — значительным (до 5 норм) и у 7% больных наблюдалась выраженная гиперпродукция ИЛ-6 (более 10 норм).
При сопоставлении уровня ИЛ-6 в сыворотке крови со степенью фиброза печени было отмечено, что у больных с нормальным уровнем ИЛ-6 в сыворотке крови достоверно чаще (у 57%, р=0,005) отмечалась 1 (легкая) степень фиброза печени, в то время как среди больных с повышенным уровнем ИЛ-6 достоверно чаще (у 52%, р=0,004) наблюдался цирроз печени.
Группа больных с нормальным уровнем сывороточного ИЛ-6 у большинства (64%) характеризовалась медленным темпом прогрессирования фиброза печени. И напротив, в группе больных с повышенным уровнем ИЛ-6 достоверно чаще (у 67%), р 0,05) выявлен быстрый темп прогрессирования фиброза печени.
