Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы .14
1.1. Тенденции изучения анатомического строения решетчатой кости и решетчатого лабиринта в общей структуре патологии носа и ОНП .14
1.2. Современные представления о роли лактоферрина и биопленок в развитии ХРС .24
1.3. Генетические аспекты этиопатогенеза хронического риносинусита 35
Глава II. Материалы и методы исследования 45
2.1. Общая характеристика больных 45
2.2. Методы исследования 48
Глава III. Результаты собственных исследований .56
3.1. Клинические особенности течения синусита в зависимости от анатомического строения решетчатой кости и решетчатого лабиринта 56
3.2. Роль лактоферрина в патогенезе хронического бактериального риносинусита .75
3.3. Цитологические особенности слизистой оболочки полости носа у больных хроническим риносинуситом 85
3.4. Молекулярно-генетическое исследование генов факторов внешней среды и факторов роста с предрасположенностью к полипозному этмоидиту 91
3.4.1. Анализ популяционного распределения исследуемых ДНК - маркеров 91
3.4.2. Анализ ассоциации полиморфизмов исследуемых генов с предрасположенностью к полипозному этмоидиту 93
3.4.3. Исследование полового диморфизма в проявлении ассоциаций исследуемых ДНК - маркеров с предрасположенностью к полипозному этмоидиту 96
3.4.4.Анализ ассоциаций парных межгенных комбинаций исследуемых генетических маркеров с риском развития полипозного этмоидита 99
Глава IV. Обсуждение результатов 102
Выводы .112
Практические рекомендации .114
Список литературы .115
Приложение .143
- Современные представления о роли лактоферрина и биопленок в развитии ХРС
- Генетические аспекты этиопатогенеза хронического риносинусита
- Роль лактоферрина в патогенезе хронического бактериального риносинусита
- Анализ ассоциации полиморфизмов исследуемых генов с предрасположенностью к полипозному этмоидиту
Введение к работе
Актуальность проблемы. В общей структуре заболеваемости ЛОР – органов поражения носа и околоносовых пазух прочно заняли первое место как по анализу обращаемости в поликлинику, так и в группе больных, проходящих лечение в стационарных условиях, причем на долю риносинуситов приходится 44 – 46% всех пациентов с ЛОР – патологией (М.С. Плужников, Г.В. Лавренова, 1990; А.В. Староха, 1998; К.Г. Апостолиди, 1998; Г.З. Пискунов, С.З. Пискунов, 2006; М.С. Плужников, 2005; В.С. Козлов, 1985; А.С. Лопатин, 1993).
По своему анатомическому строению полость носа является наиболее сложно устроенным органом человеческого организма. В исследовании, проведенном В.С. Пискуновым (2002) было установлено, что отдельные эндоназальные анатомические структуры или их комплексы в эмбриональном или постнатальном периодах развиваются аномально, в результате на каком-то этапе жизни сформировавшаяся аномалия может привести к функциональным нарушениям, способствующим развитию патологического процесса в слизистой оболочке носа и околоносовых пазух. Однако, до сегодняшнего дня в литературе недостаточно освещены особенности этмоидита в зависимости от анатомического строения решетчатой кости. Функциональное и клиническое значение эндоназальных структур, являющихся элементами решетчатой кости, так же требует дополнительного изучения.
С развитием молекулярно-генетических технологий открылись широкие возможности для формализации генетической компоненты подверженности заболеваний. Однако, несмотря на достигнутые успехи мирового научного сообщества в области изучения генома человека и в разработке высокоразрешающих методов анализа ДНК, по-прежнему известно относительно небольшое число генов, которые в совокупности только частично объясняют некоторые звенья в патогенезе хронического риносинусита.
На современном этапе в медицинской микробиологии происходит переосмысление процессов, происходящих при хронических воспалительных заболеваниях. Исследования механизмов развития инфекционного процесса, включая образование персистирующих форм микроорганизмов, не могут не учитывать наличия особого биологического явления – формирования бактериальных биопленок. В немногочисленных исследованиях, направленных на изучение активности антимикробных пептидов по отношению к биопленкам, было продемонстрировано, что микробные клетки, входящие в структуру биопленки, менее восприимчивы к определенным пептидам антибактериальных препаратов, чем планктонные клетки, например к лактоферрину. Совсем немного известно о роли, которую он играет в развитии хронического риносинусита.
Изучение этих вопросов крайне важно для оториноларингологов. Лечащий врач, основываясь на знании этих особенностей, должен найти индивидуальный подход в каждом конкретном случае, выбрать наиболее подходящую тактику лечения, исходя из основных патогенетических звеньев развития этмоидита.
Степень проработанности темы. Анализ специальной литературы и диссертационных исследований обусловил обращение к разнообразным научным источникам на стыке различных дисциплин: ринология, рентгенология, микробиология, аллергология, генетика, цитология.
Особенности топографической анатомии решетчатого лабиринта наиболее освещены в трудах, как отечественных – Н.И. Пирогов, В.Т. Жолобов, Н.С. Скрипников, B.C. Сперанский, А.С. Киселев, В.Р. Гофман, Т.А. Лушникова, Пискунов И.С., так и зарубежных ученых – D.W. Kennedy, S.J. Zinreich, M. Tos, C. Mogensen. Огромный вклад в изучение морфологии клеток решетчатого лабиринта внесли М.В. Милославский, Г.К. Бокштейн, Т.В. Золотарев, Г.Н. Топоров, Р.Д. Синельников, Б.В. Шеврыгин, W. Messerklinger. H. Stammberger, Е. Zuckerkand, J.M. Bernstein.
При рассмотрении причин развития этмоидита с точки зрения бактериологических факторов – формирования и развития биопленок, следует выделить труды таких исследователей, как Antoni van Leeuwenhoek, J.W. Costerton, K.D. Xu, J. Cryer, T.S. Walker, P.K. Singh, C.B. Whitchurch, P. Stoodly, K.J. Tack, L.D. Sabath, H.H. Ramadam. Спектр рассмотренных ими вопросов касался роли биопленок в организме в целом и при патологических процессах, в том числе на слизистой полости носа. В процессе формирования хронического воспалительного процесса на слизистой оболочке носа и околоносовых пазух нельзя не учитывать генетических факторов, повлекших за собой развитие хронического риносинусита. Изучению данного вопроса посвящены работы А.В. Полоникова, М. Rugina, W.A. Greisner, A. Drake-Lee, A. Delagranda, K. Takeuchi, А.A. Fryer, С. Oretti, F.D. Gilliland, C. Ozcan, L. Tamer. Эти исследования являются лишь первым этапом в изучении наследственной природы хронического синусита, они выявляют лишь некоторые закономерности в его развитии.
Актуальность и недостаточная разработанность проблемы обусловили выбор темы диссертационного исследования: «Клинические, анатомические, бактериологические и генетические особенности хронического бактериального и полипозного этмоидита».
Изложенные выше предпосылки определили цель и задачи нашего исследования.
Цель исследования. Изучить влияние анатомических, бактериологических и генетических факторов на развитие и клинические особенности течения хронического бактериального и полипозного этмоидита.
Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи исследования:
-
Изучить методом компьютерной томографии особенности анатомического строения решетчатой кости у больных этмоидитом.
-
Установить частоту поражения различных групп клеток при изолированном этмоидите и при его сочетании с поражением других пазух.
-
Оценить протективную функцию лактоферрина при хроническом бактериальном этмоидите.
-
Провести анализ ассоциаций аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов факторов внешней среды и факторов роста: I462V гена CYP1A1, I105V гена GSTP1, +/del гена GSTT1, +/del гена GSTM1, +61G/A гена EGF, -509C/T гена TGF1В с предрасположенностью к развитию полипозного этмоидита.
-
Изучить проявления полового диморфизма в ассоциациях полиморфизма генов факторов внешней среды и факторов роста у пациентов с полипозным этмоидитом.
-
Исследовать взаимодействия между различными классами исследуемых генов и дать оценку их комплексного влияния на риск возникновения полипозного этмоидита.
Научная новизна исследования. Впервые определены особенности анатомического строения решетчатой кости у больных этмоидитом. Установлены взаимосвязи анатомического строения клеток решетчатой кости с объемом воспалительного процесса, его локализацией, степенью выраженности. Впервые определена частота поражения различных групп клеток при изолированном этмоидите и при сочетании его с поражением других пазух. Впервые изучена роль лактоферрина в развитии бактериального воспалительного процесса околоносовых пазух. Впервые в рамках одного исследования проведен комплексный молекулярно-генетический анализ полиморфизмов генов, вовлеченных в патогенез хронического полипозного риносинусита и установлены новые генетические маркеры предрасположенности к данному виду патологии. Впервые изучены особенности взаимодействия кандидатных генов при хроническом полипозном риносинусите, выявлены особенности полового диморфизма в проявлении ассоциаций генов.
Практическая значимость. Полученные в ходе проведенного исследования данные могут быть использованы в практике врача-оториноларинголога для определения стратегии диагностики и выбора тактики ведения больных с рассматриваемой патологией. Результаты научной работы могут быть внедрены в практическое здравоохранение в плане определения фактора местного иммунитета – лактоферрина, как протективного фактора и маркера в формировании биопленок при хроническом бактериальном риносинусите. В группах риска по хроническому полипозному риносинуситу будет возможным проведение молекулярно-генетических исследований на предмет выявления полиморфных вариантов генов и использование их в вероятной оценке риска развития эндоназальной патологии. Установленные нами гены могут быть включены в панель молекулярно-генетических диагностических маркеров для прогнозирования риска развития полипозного этмоидита. Результаты исследования могут быть использованы в практической работе врача-оториноларинголога, включены в лекционный материал в вузах медицинского профиля и на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Личный вклад аспиранта. Аспирант лично проводила анализ всех компьютерных томограмм, включенных в исследование. Участвовала в комплексном обследовании всех пациентов. Осуществляла анализ, статистическую обработку и обобщение всех результатов, полученных в ходе исследования.
Внедрение результатов работы в практику. Определение уровня лактоферрина слизистой оболочки полости носа при хронических бактериальных этмоидитах и методика молекулярно-генетического исследования у больных с полипозным этмоидитом внедрены в работу клиник: отделение медико-генетического консультирования БМУ «Курская областная клиническая больница», ЛОР-отделение МБУЗ «Городская больница №2» г. Старый Оскол, ЛОР-отделение МБУЗ «Старооскольская центральная районная больница».
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на пленарных заседаниях Курского областного научного общества оториноларингологов 24.10.2011, 26.11.2012, 26.02.2013; 77 Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» г. Курск 18.04.2012; Межрегиональной научно-практической конференции «Воспалительные заболевания ЛОР-органов: реальность и перспективы» г. Курск 31.03.2012.; на ежегодной традиционной конференции Украинского научного общества оториноларингологов г. Севастополь 19.05.2013; на ежегодном обществе оториноларингологов г. Тамбов 21.06.2013. Апробация на межкафедральном заседании кафедры оториноларингологии и кафедры биологии, медицинской генетики и экологии ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России 30.04.2013.
Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано в печати 14 работ. Из них в журналах, рекомендуемых ВАК – 4.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
От характера распространения воспалительного процесса в пределах решетчатой кости зависит обширность поражения других околоносовых пазух. Характер поражения клеток решетчатой кости напрямую зависит от формы строения решетчатого лабиринта.
-
Протективным фактором в формировании биопленки при ХБРС является лактоферрин, содержащийся на слизистой оболочке носовой полости.
-
Делеционный генотип del/del гена GSTT1 и вариантный аллель 105Val гена GSTP1 - факторы генетической предрасположенности к полипозному этмоидиту. Повышенный риск развития полипозного этмоидита у мужчин ассоциирован с генотипом del/del гена GSTT1.
-
Установленные комбинации генотипов определяют повышенный риск возникновения изучаемых заболеваний. Установленные межгенные различия обусловлены накоплением среди больных главным образом вариантных полиморфных аллелей генов глутатион-S-трансфераз.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 155 листах машинописного текста, содержит 18 рисунков, 21 таблицу, 3 диаграммы. Состоит из введения, обзора литературы, одной главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 49 отечественных и 230 иностранных наименований работ, а так же приложения.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Область диссертационного исследования соответствует научной специальности 14.01.03 – болезни уха, горла и носа: п. 1. «Исследования по изучению этиологии, патогенеза и распространения ЛОР-заболеваний» и п. 2. «Разработка и усовершенствование методов диагностики и профилактики ЛОР-заболеваний» Паспорта научных специальностей ВАК (медицинские науки).
Современные представления о роли лактоферрина и биопленок в развитии ХРС
Впервые биопленки были обнаружены в природных экосистемах. Первое их описание было сделано голландским ученым Антони Ван Левенгуком в 1683 году. Но в то время ученые были сосредоточены на изучении планктонной микрофлоры, которая стала популяризованной благодаря открытиям Роберта Коха в его доктрине бактериальной этиологии заболеваний. Поэтому открытие «биопленок» было в значительной степени проигнорировано. Потребовалось больше, чем два десятилетия, начиная с «повторного открытия» биопленок Costerton et al. в 1978 [62], чтобы интерес к миру биопленок возрос в сотни и тысячи раз. Этот интерес доказан и статистически - с 1990 года в мире было опубликовано более 6500 статей о биопленках. Однако, несмотря на это, все еще есть пробелы в изучении биопленок в области оториноларингологии.
Ранние исследования были полностью сосредоточены на структурном составе биопленки, а именно, бактериальных группах и структуре их матрицы [62, 83]. Вскоре стало очевидно, что биопленки не гомогенные структуры, а обладают пространственной и временной гетерогенностью, а так же множеством различий с их планктонными коллегами с точки зрения роста, уровня метаболизма и генетической экспрессии [77, 89, 193].
Концептуальное понимание ультраструктуры биопленки развилось с появлением новых методик обнаружения. В эру использования световой и трансмиссионной электронной микроскопии, биопленки рассматривались как гомогенные, неструктурированные, плоские сращения бактериальных клеток, заключенные в экзополисахаридный матрикс [202]. Современные технологии формирования изображений привели к новым концептуальным моделям, ставя под серьезное сомнение существование биопленок, как гомогенных плоских структур [166]. Применение софокусной лазерной микроскопии в исследовании биопленок, вероятно, представляет самое значительное продвижение в нашем понимании биопленок. Софокусная лазерная микроскопия позволяет проводить обработку изображений, устраняя расфокусированное искажение с помощью оптического подразделения. Начальные исследования биопленок были полностью описательными [203]. Использование софокусной лазерной микроскопии позволило исследовать разновидности и химический состав биопленок, их физиологические свойства и отношения с нижним слоем.
Несмотря на их гетерогенность, биопленки представлены двумя структурными единицами: микробное сообщество, которое может составлять 15% от объема биопленки, и экзополисахаридная матрица, которая составляет большую часть биопленки. Биопленки содержат многочисленные виды бактерий, часто сосуществуют с грибами во взаимнополезных отношениях, названных сометаболизмом. Этот процесс выгоден для всего микробного сообщества, делая комменсализм общим феноменом в пределах биопленок [235]. Это создает чрезвычайно разнообразные микросреды с точки зрения температуры, рН фактора, питательной доступности и кислородного потенциала [192]. Эти микрониши не только определяют, какие организмы могут существовать и сосуществовать, но также и могут влиять на свою генетическую экспрессию [160].
Другая важная структура, влияющая на организацию и укрепление биопленки - внеклеточная матрица, произведенная составляющими микробных клеток. Состав матрицы является сложным и переменным, его формирование находится в прямой зависимости от состава бактериального сообщества и влияния различных условий окружающей среды [73]. Несмотря на гетерогенный состав матрицы, экзополисахариды и белки являются основными его составляющими, обеспечивая благоприятные условия для микробных сообществ. Другие важные компоненты, идентифицированные в пределах матрицы, включают: липиды, внеклеточную ДНК, ионы металлов, двухвалентные катионы и другие биополимеры [252]. Хотя их роль остается до конца не выясненной, исследователи предположили, что они могут иметь большое значение в этапах построения биопленки. Внеклеточная ДНК, которая, как первоначально думали, просто побочный продукт лизиса клетки, как теперь выяснено, активно участвует в экзотоксическом механизме, вовлекающем внешнюю бактериальную мембрану [165, 197]. Исследование Whitchurch и др. продемонстрировало, что в отсутствии внеклеточной ДНК, формирование биопленки было ингибировано [122], а ферментативное расщепление внеклеточной ДНК так же помогло запустить процесс расщепления биопленки. Формирование, рост, миграция планктонных форм клеток для колонизации в биопленках регулируются на уровне популяции посредством механизмов межклеточной коммуникации. «Quorum sensing» (QS) – это процесс коллективной координации экспрессии генов в популяции бактерий, опосредующий специфическое поведение клеток [186, 276]. Механизм работы QS основан на сложной иерархической регуляции целевых локусов генома бактериальной клетки. При этом регуляция осуществляется на разных уровнях воздействия: транскрипционном, трансляционном, посттрансляционном. На конкретный клеточный сигнал клетки в популяции отвечают специфическим ответом. На сегодняшний день установлено, что клеточно-клеточные взаимосвязи влияют на внутрипопуляционную дифференцировку клеток, на экспрессию генов вирулентности, регулируют ростовые процессы, характер и направление подвижности (таксис), а также бактериальный апоптоз и токсинообразование [69, 221, 276]. Образование биопленок – это сложный комплексный динамический процесс, состоящий из нескольких этапов. В исследованиях, проведенных в Италии, были описаны пять основных шагов жизненного цикла биопленки и схематически представлены Stoodly et al. в статье [70]. Стадии описаны следующим образом: 1) Обратимая адгезия – во время этого процесса отдельные микробные клетки становятся обратимо связанными с поверхностью [140]. Изначальное прикрепление микробной клетки к поверхности субстрата осуществляется за счет действия электростатических, гидрофобных сил, сил Ван дер Ваальса, неспецифической адгезии [70]. 2) Необратимая адгезия – бактерии при участии различных адгезинов (регуляция синтеза которых происходит на транскрипционном уровне) становятся необратимо связанными друг с другом [187]. 3) Скопление и 4) созревание. Во время этих стадий связанные организмы начинают активно размножаться и перераспределяться в переделах QS, тем самым увеличивая плотность биопленки, что способствует созреванию ее архитектуры [262]. 5) Отделение. Когда биопленки достигают своей критической массы, периферический слой роста начинает повторно дифференцироваться в планктонные организмы. Происходит образование подвижных форм клеток в биопленке или высвобождение целого кластера клеток (detachment cell) для колонизации окружающего субстрата.
Генетические аспекты этиопатогенеза хронического риносинусита
До 15 % взрослого населения в мире страдают различными формами синусита. Хронический риносинусит (ХРС) – один из 10 самых распространенных диагнозов в амбулаторной практике [46]. Хронический риносинусит может быть подразделен на 2 группы: ХРС без ПН (полипоз носа) и ХРС с ПН – ХПРС (хронический полипозный риносинусит). Хронический полипозный риносинусит - мультифакторное заболевание, при котором поражается слизистая оболочка носа и околоносовых пазух, вовлекаются иммунные и противовоспалительные механизмы, приводя к формированию хронического воспалительного процесса и образование полипозной ткани. Первенство в развитии анатомии, физиологии и патологии околоносовых пазух отдано Walter Messerklinger и H. Stammberger, из Австрии, их работа о вентиляции решетчатых клеток была ключевой для понимания анатомии боковой стенки полости носа и его мукоцилиарного транспорта, сообщения околоносовых пазух с полостью носа [124, 245]. В нашей стране И.В. Корсаков (1936) доказал почти полную одновременность в развитии поражения слизистой оболочки полости носа и околоносовых пазух, что стимулировало развитие хирургии околоносовых пазух. К середине ХХ столетия накопились большие познания в иммунологии, служащие для дифференцирования и понимания аллергической и неаллергической природы патологических процессов в слизистой оболочке. В 30-е годы впервые появились работы, авторы которых пытались связать патогенез полипозных процессов полости носа с аллергией. В нашей стране одним из первых об аллергической природе носовых полипов писал И.В. Корсаков (1936) в работе «Роль серозного воспаления придаточных полостей носа в происхождении носовых полипов». Он выдвинул гипотезу, согласно которой, так называемое, серозное воспаление и аллергия являются тождественными. В дальнейшем исследователи пытались найти компромиссное решение в определении инфекционной или аллергической природы носовых полипов. В связи с этим большое значение придавалось изучению бактериальной аллергии. Именно инфекцию многие считали источником аллергизации организма, приводящей к развитию полипозного процесса в полости носа.
В 70-е годы появилось большое количество работ, придающих значение аутоаллергии в происхождении полипозного риносинусита. Было отмечено, что при ХПРС снижена иммунологическая реактивность организма. Таким образом, история развития различных этиопатологических концепций хронического риносинусита насчитывает сотни лет.
Нос и окружающие его воздушные полости – структурно и функционально сложно устроенный орган верхних дыхательных путей. Это ворота для входа воздуха в систему органов дыхания. Полость носа является не только главным органом обоняния, но также фильтрует, нагревает, и увлажняет вдыхаемый воздух прежде, чем он войдет в более дистальные дыхательные пути и альвеолярную паренхиму легкого [78]. Нос – важнейший фильтр дыхательных путей, так как он эффективно поглощает водорастворимые и реактивные газы и пары, улавливает поллютанты и воздушно-капельные ксенобиотики [72]. Играя роль "кондиционера" и "защитника" нижних дыхательных путей, нос уязвим для острой или хронической инфекции, вызванной воздействием воздушно-капельных ксенобиотиков или возбудителей инфекции [85, 142]. Высокий уровень ферментов биотрансформации в слизистой оболочке носа вынудил Jeffrey et al. (2006) сравнить нос со “второй печенью”, расположенной во входных воротах инфекции, так как, имеется общность процессов биотрансформации, происходящих в печени и в полости носа [161]. Последние достижения морфологии, аллергологии, иммунологии и молекулярной генетики с современных позиций рассматривают ХПРС как заболевание, связанное с множеством этиологических и патофизиологических факторов, которые могут быть местными и системными. Понимание этих условий важно для адекватного лечения и контролирования болезни. Анатомические аномалии полости носа, блокирующие соустья околоносовых пазух (нарушающие дренажную и оксигенационную функции, транспортную способность реснитчатого эпителия), рецидивирующий острый риносинусит, аллергический ринит, иммунодефицит, заканчивающийся ростом патогенов, могут предрасполагать пациента к ХПРС. Бронхиальная астма, врожденный или приобретенный иммунодефицит могут способствовать формированию ХПРС. У 36-96 % субъектов, чувствительных к нестероидным противовоспалительным препаратам (“непереносимость аспирина”), встречается полипозный риносинусит, по данным рентгенографии у 96% находят воспаление слизистой оболочки околоносовых пазух. Пациенты с непереносимостью аспирина, астмой, и носовыми полипами (“аспириновая триада”) часто люди в возрасте около 40 лет, не являющиеся аллергиками. О генетической предрасположенности стали говорить, после того как заметили, что эта патология накапливается в семьях. В исследовании Rugina et al. [114], больше чем половина из 224 пациентов с ХПРС (52 %) имели положительный наследственный анамнез. Диагноз ХПРС подтверждался объективным осмотром оториноларинголога или хирургическим лечением в прошлом. Ранее Greisner et al. [138] определил более низкий процент наследования (14%) в группе взрослых пациентов с ХПРС. Помимо генетических, внешние факторы окружающей среды, вероятно, влияют на формирование носовых полипов. Так в случае однояйцовых близнецов ХПРС не всегда развивается у обоих сибсов [179, 233]. В исследовании Drake-Lee A. et al. полипозный синусит описывается у идентичных близнецов, но такая распространенность носовых полипов может встречаться чаще, чем описана в литературных материалах. В 2008 году A. Delagranda et al. обнаружив полипозный синусит у 13 из 99 членов одной семьи (19,5%) в сравнении с 21% распространенности ХПРС во Франции, предложили аутосомно-рецессивный характер наследования [103]. Таким образом, эти результаты предполагают наследственный фактор в патогенезе ХРС. Однако, работы, посвященные изучению генетических факторов разрозненны и минимальны. На молекулярном уровне при хроническом риносинусите имеет место поляризация T-1-хелперов лимфоцитов (Th1) с высокими уровнями интерферона (INF) и бета - трансформирующего фактора роста (TGF-). При хроническом полипозном синусите отмечается поляризация Th2 –лимфоцитов с высокими концентрациями интерлeйкина 5 (IL-5) и иммуноглобулина E (IgE). При ХПРС имеется более чем 10-кратное увеличение IgE и эозинофильная инфильтрация. Экспрессия IL-4, IL-5, и эотаксина, наблюдающаяся локально в структуре полипов, является критерием наличия у пациента атопии [228].
Роль лактоферрина в патогенезе хронического бактериального риносинусита
Лактоферрин обладает разнообразными антимикробными свойствами против широкого диапазона бактерий, грибов, вирусов и простейших. Большая часть этой активности потенциирована способностью лактоферрина связывать железо (важное питательное вещество для микробного роста). Лактоферрин может изменять вирулентность и патогенность бактерий через: 1) действие антибиопленки; 2) торможение бактериального проникновения [95]; 3) прямое разрушение и удаление факторов микробного обсеменения, уменьшая патогенность микроорганизмов [146]; 4) способность усиливать сигналы апоптоза в пределах инфицированных клеток [56]; 5) прямое внутриклеточное взаимодействие и повышение бактерицидной активности в пределах полиморфноядерного нейтрофила [156]. В немногочисленных исследованиях, направленных на изучение активности антимикробных пептидов по отношению к биопленкам, было продемонстрировано, что микробные клетки, входящие в структуру биопленки, менее восприимчивы к определенным пептидам антибактериальных препаратов, чем планктонные клетки, например к лактоферрину [184, 189, 219, 248].
Первые признаки формирования биопленки были отнесены к 3,25 миллиарда лет до н.э. и вынудили исследователей выдвинуть гипотезу о биопленке, как о компоненте прокариотического жизненного цикла [141]. Есть мнение, что биопленки могут на самом деле представлять более раннюю эволюционную форму, чем планктонное государство, а так же формой существования некоторых микробных сообществ [68, 160].
Определение, выдвинутое Donlan и Costerton (2002), наиболее точно отражает структурные особенности биопленки, так же определенные физиологические свойства организмов, существующих в пределах этих структур. Биопленки – это структуированное микробное сообщество, состоящее из клеток, присоединенных к какой-либо поверхности (в том числе в живом организме) или друг к другу, заключенных в матрицу из полимерных веществ, которую они сами продуцируют, и обладающих измененным фенотипом с точки зрения темпа роста и генотипа [99].
Повсеместная встречаемость лактоферрина и отсутствие биопленок на здоровой слизистой оболочке вынудили многих исследователей предположить, что этот антимикробный пептид может играть роль в профилактике формирования биопленки. Предшествующие исследования, демонстрирующие «железонезависимое» ингибирование бактериальной пленки, поддерживают эту гипотезу [146, 155]. В 2002 году Singh [236] показал, что P. aeuroginosa, существующая в биопленке, в 100 раз более устойчива к воздействию лактоферрина, чем те же самые бактерии, живущие планктонно. Далее invitro он обнаружил, что лактоферрин, воздействуя на микроколонии, стимулирует бактериальное передвижение, тем самым предотвращая формирование полноценной биопленки [236]. Это действие антибиопленки было решено связывать с железо связывающей способностью лактоферрина, которое, казалось, не оказывало влияние на зрелые, хорошо сформированные биопленки. Однако, на данный момент, не существует доказательных исследований, целью которых было бы изучение уровня лактоферрина в слизистой оболочке пациентов с ХРС. Нами было обследовано 50 больных хроническим бактериальным риносинуситом (Таблица 10). Таблица 10. Распределение форм ХБРС в исследуемой группе Форма риносинусита Количество пациентов Гаймороэтмоидит 21 (42%) Гайморофронтоэтмоидит 12 (24%) Гайморофронтосфеноэтмоидит 10 (20%) Фронтоэтмоидит 7 (14%) ВСЕГО 50 (100%) Как видно из таблицы 10, наиболее распространенной формой риносинусита в исследуемой группе был гаймороэтмоидит 22 (44%). Большинство пациентов основной группы составили лица в возрасте от 15 до 30 лет (50%). При бактериологическом исследовании мазков со слизистой среднего носового хода (Таблица 11) и отделяемого, полученного при пункции ОНП (Таблица 12) были получены следующие данные.
Исследование видового состава микрофлоры слизистой оболочки полости носа, показало совпадение спектра возбудителей у 8 больных с хроническим бактериальным риносинуситом.
Исследование нативных мазков со слизистой оболочки полости носа больных с бактериальным риносинуситом с помощью люминесцентной микроскопии выявило две группы пациентов: “биопленко-позитивные”(56%) и “биопленко-негативные” (44%). В контрольной группе в нативных мазках биопленки обнаружены не были.
Контрольная группа (n=100) Группа синуситов («биопленко-позитивные») (n=28) Группа синуситов («биопленко-негативные») (n=22) 0,55 ± 0,005 (р 0,05) 0,0033 ± 0,0008 (р 0,05) 0,0068 ± 0,00075 (р 0,05) У пациентов с обнаруженными биопленками на слизистой оболочке среднего носового хода уровень секреторного лактоферрина 0,0033 ± 0,0008 мг/мл (р 0,05). В «биопленко-негативной» группе - 0,0068 ± 0,00075 мг/мл (p 0,05). В контрольной группе (100 здоровых добровольцев) - 0,55 ± 0,005 мг/мл (p 0,05). Таким образом, у пациентов с ХБРС уровень секреторного лактоферрина в 126 раз ниже, чем в контрольной группе. В «биопленко-позитивной» группе уровень секреторного лактофферина в два раза ниже, чем в «биопленко-негативной» группе. На сегодняшний день биопленкообразование госпитальными штаммами бактерий является серьезной угрозой для практического здравоохранения. Особое значение это приобретает в отделениях интенсивной терапии, хирургических стационарах, отделениях интенсивной терапии поскольку образование биопленок является причиной возникновения тяжелых инфекций, сепсисов и летальных исходов. Большие экономические потери связаны с неэффективной антибиотикотерапией этих инфекций. В связи с этим разрабатываются новые подходы для идентификации и изучения биопленок, ведется разработка новых антибиотиков, изменение тактики антибиотикотерапии, а также поиск ингибиторов QS. Важность бактериальных пленок в патогенезе многих хронических заболеваний установлена давно. Полученные нами данные доказывают протективную роль лактоферрина в формировании биопленок на слизистой оболочке носа при хроническом бактериальном риносинусите.
Анализ ассоциации полиморфизмов исследуемых генов с предрасположенностью к полипозному этмоидиту
В связи с тем, что анализ аллелей исследуемых генов не дает полного представления о характере взаимодействия изучаемых полиморфизмов с предрасположенностью к болезни, нам представляется актуальным оценить влияние генотипов данных генов на риск формирования полипозного этмоидита.
Частоты генотипов изучаемых полиморфизмов генов представлены в таблице 18. Частота делеционного полиморфизма del/del GSTТ1 (OR=1,99 95%CI 1,01–3,93, p=0,0438) была выше в группе больных полипозным этмоидитом. Отсутствие нормального полиморфизма + GSTТ1 обусловливало повышенный риск развития полипозного этмоидита (OR=1,99 95%CI 1,01–3,93, p=0,0438). При сравнительном анализе мы обнаружили статистически достоверное различие по одному полиморфному ДНК – маркеру. Частота вариантного аллеля гена GSTT1 была достоверно выше в группе больных полипозным этмоидитом.
При мультифакториальных заболеваниях фенотипические эффекты кандидатных генов проявляют половые различия по распространенности в популяции [7, 11]. В связи с этим, представляется актуальным провести анализ полиморфных вариантов изучаемых нами генов с предрасположенностью к исследуемому заболеванию раздельно для мужчин и женщин.
В таблице 19 представлены результаты сравнительного анализа частот генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и генов факторов роста у мужчин. Частота функционально неполноценного генотипа del/del GSTT1 была выше в группе мужчин, больных полипозным этмоидитом (OR=2,63, 95%CI 1,10–6,27, p=0,03), отсутствие же нормального полиморфизма + GSTT1 ассоциировалось с повышенным риском развития полипозного этмоидита у мужчин (OR=2,63, 95%CI 1,10–6,27, p=0,03). Таблица 19. Распределение частот генотипов полиморфных вариантов генов в группе больных полипозным этмоидитом и здоровых мужчин
Как видно из представленных результатов в таблице 20, статистически достоверных различий получено не было в группе женщин. Таблица 20. Распределение частот генотипов полиморфных вариантов генов в группе больных полипозным этмоидитом и здоровых женщин. Наиболее патогенетически важными межгенными взаимодействиями, определяющими предрасположенность к полипозному этмоидиту были следующие комбинации генотипов: GSTP1 105VV х CYP1A1 462II (OR=8,61), TGF1B 509СТ х GSTT1 del (OR=7,58), EGF 61GG x GSTT1 del (OR=2,84), EGF 61GG x CYP1A1 462IV (OR=6,32), GSTT1 del x CYP1A1 462IV (OR=7,45), GSTT1 + x GSTM1 del (OR=2,25).
Протективными в отношении риска развития полипозного этмоидита были парные межгенные сочетания генотипов: GSTP1 105II х TGF1B 509СС (OR=0,45), GSTP1 105II х GSTT1 + (OR=0,53), GSTP1 105VV х TGF1B 509СС (OR=0,00), TGF1B 509CC x CYP1A1 462II (OR=0,53), GSTM1 del x CYP1A1 462IV (OR=0,23).
Таким образом, при исследовании комплексной вовлеченности генов в патогенез хронического полипозного этмоидита (генов ферментов 1 и 2 фаз биотрансформации ксенобиотиков, генов белков-факторов роста) выявлено, что рисковой значимостью обладают вариантный аллель 105Val гена GSTP1 и функционально неполноценный полиморфизм del/del GSTT1, а нормальный полиморфизм + GSTT1 является фактором резистентности. При полипозном этмоидите выявлена значительная эозинофилия слизистой оболочки. Число эозинофилов значительно выше у данной группы больных, чем их содержание в секрете полости носа здорового человека. Содержание оксидантов в высоких концентрациях в полипозной ткани может привести к скоплению значительного количества клеток воспаления (эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов). Оксидантный стресс - ключевой механизм воспаления. Регуляция оксидантной системы происходит за счет антиоксидантной системы, функционирование которой определяется генетическими факторами. Семейство генов GST регулирует деятельность антиоксидантной системы, влияет на синтез цитокинов, каскад арахидоновой кислоты, способствует хронизации воспалительного процесса и образованию полипозной ткани.
Хронический риносинусит является мультифакторным заболеванием. Это результат взаимодействия как процессов происходящих внутри организма, так и воздействия факторов внешней среды. Множество ученых сходятся во мнении, что основными этиологическими факторами в развитии данной патологии может выступать как генетически опосредованные механизмы, бактериальные агенты, грибы, так или иначе приводящие к развитию хронического воспаления в слизистой оболочки носа и околоносовых пазух, и при определенных условиях инициируя рост полипов. До конца остается не известным, почему в некоторых случаях хроническое воспаление приводит к росту и формированию полипов, а в других – этого не происходит. Мы постарались изучить, на наш взгляд, наиболее важные звенья в этой патологической цепи и разобраться в этиологических факторах, инициирующих этот патологический процесс.
Решетчатый лабиринт занимает центральное положение в общей структуре околоносовых пазух и наиболее часто вовлекается в воспалительный процесс. Анатомическое строение решетчатого лабиринта очень индивидуально и вариабельно. До настоящего времени не проводилось сравнительного анализа особенностей строения решетчатой кости у страдающих этмоидитом пациентов.
На основании проведенного нами анализа результатов компьютерного исследования головного мозга и ОНП у 869 пациентов с синуситом было установлено, что в большинстве случаев (64,3%) поражены клетки решетчатого лабиринта. При этом наиболее часто встречалось сочетанное поражение клеток решетчатой кости и других ОНП (47,9%), нежели чем изолированная форма этмоидита (16,4%), что еще раз подтверждает значимость пазух решетчатой кости в формировании воспалительного процесса и его распространении. Второй по частоте встречаемости является верхнечелюстная пазуха как при сочетании с воспалением клеток решетчатой кости (34,4%), так и без явлений этмоидита (19,05%).Эти данные еще раз подчеркивают важность выполнения компьютерной томограммы ОНП больным с подозрением на синусит. При выполнении лишь обзорного рентгеновского снимка ОНП провести дифференцировку клеток решетчатого лабиринта и определить степень вовлеченности их в воспалительный процесс редко представляется возможным. Поэтому в большом количестве литературных источников наиболее часто встречающимся является воспаление верхнечелюстной пазухи, а не клеток решетчатого лабиринта.
Необходимо отметить, что двухсторонний изолированный воспалительный процесс в решетчатой кости встречался почти в 2 раза чаще (10,47%), чем односторонний (5,87%). Это, вероятно, объясняется сложной архитектоникой решетчатого лабиринта, при котором большинство ячеек сообщаются друг с другом, что приводит к распространению инфекции. Данное предположение подтверждается еще и тем фактом, что при формировании двухстороннего этмоидита воспалительный процесс в других вовлеченных пазухах тоже чаще двухсторонний. Мы предполагаем, что это связано со сложной дренажной системой ОНП, при которой решетчатый лабиринт является центральным звеном и через него осуществляется большая часть дренажной функции ОНП. Важно отметить, что при одностороннем поражении клеток решетчатой кости, чаще встречается одностороннее поражение и других ОНП. При этом воспалительный процесс может затрагивать ОНП как одноименной стороны, так и противоположной. Возможно, в данном случае имеет значение не только особенности строения решетчатого лабиринта, но и полости носа в целом, создавая тем самым условия для распространения воспалительного процесса именно в этом направлении.
Другим фактом, подтверждающим центральную роль решетчатого лабиринта в процессах воспаления, является преобладание одностороннего характера поражения ОНП без вовлечения клеток решетчатой кости. При этом необходимо оценивать состояния ОНП с обязательным эндоскопическим осмотром полости носа, для выявления особенностей строения латеральной стенки и состояния клапана носа.
В ходе анализа степени вовлеченности клеток решетчатого лабиринта в воспалительный процесс были выделены 5 основных групп: передний этмоидит, задний этмоидит, тотальный этмоидит, «мозаичный» этмоидит и изолированное воспаление клетки. Наиболее часто вовлекаемыми в воспалительный процесс оказались передние клетки решетчатого лабиринта. Это, возможно, связано с преобладанием в количественном составе этих клеток по отношению к остальным клеткам решетчатой кости.
Если рассматривать 5 основных форм строения [35] решетчатой кости в зависимости от положения бумажных пластинок, то при переднем этмоидите преобладающей была прямоугольная форма (43%), второй по встречаемости была обнаружена симметричная форма с наружными стенками, вогнутыми в полость орбит (28,8%). Такая же картина наблюдалась при заднем этмоидите: прямоугольная форма преобладала (52,6%). Мы считаем, что это может быть связано с тем, что прямоугольная форма является наиболее распространенной в популяции.
