Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 10
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 17
1.1. Токсические гепатиты 17
Токсическое поражение печени, патогенез и клиническая картина 17
Морфологические и биохимические нарушения при токсическом гепатите
Окислительный стресс и антиоксидантная система при токсическом поражении печени
Антиоксидантные препараты, применяемые при токсическом гепатите _ .
1.2. Синдром тиреотоксикоза 26
Клиническая картина тиреотоксикоза 26
Нарушения функций печени и сердца при синдроме 27 тиреотоксикоза
Окислительный стресс и антиоксидантная система при 30 тиреотоксикозе
І.З.Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная система 32
организма
Свободнорадикальное окисление биомолекул 32
Активные формы кислорода 34
Роль ионов металлов в протекании свободнорадикальных
ПрОЦеССОВ о 7
1.3.4. Антиоксидантные системы организма 38
1.3.4.1. Ферментативные антиоксид анты 3 9
1.3.4.2. Неферментативные антиоксиданты 43
ІАМелатонин 46
1.4.1. Метаболизм и секреция мелатонина 46
1.4.2. Роль мелатонина в функционировании эндокринной системы ; 48
1.4.3. Мелатонин и свободнорадикальное окисление 50
1.4.4. Перспективы применения мелатонина в клинической практике 51
ГДтВА2.ЭКСШРЙМЕНТАЛЬНАЯЧАСТЬ 54
2.1. Материалы и методы исследований 54
Объект и материалы исследования 54
Методы исследования 5 5 2.1.2.1 .Создание модели токсического гепатита 55
Создание модели гипертиреоза 55
Введение мелатонина j 56
Характеристика препарата эпифамина 56
Получение сыворотки крови и гомогенатов печени и сердца крыс , 56
Характеристика выборки больных с лекарственным поражением ; 57 печени
Характеристика выборки больных с синдромом тиреотоксикоза 58
Общие, клинические и инструментальные методы исследования 60
2.1.2.9. Оценка интенсивности свободнорадикальных процессов 61
Определение параметров биохемилюминесценции 61
Определение содержания диеновых коньюгатов 62
2.1.2.10. Определение активности ферментов 63
2.1.2.10. 1. Определение активности глутатионпероксидазы 64
2.1.2.10.2. Определение активности глутатионредуктазы | 64
2.1.2.10.3. Определение активности НАДФ — специфичной ;
изоцитратдегидрогеназы ,
Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы ; 65
Определение активности аконитатгидратазы 65
Определение активности каталазы : 65
Определение активности супероксиддисмутазы ; 66
2.1.2.10.8. Определение активности аминотрансфераз \ 67
2.1.2.10.9. Определения активности креатинкиназы — MB : 69
2.1.2.11. Определение содержания глутатиона 70
Определение содержания цитрата 70
Определение содержания а-токоферола 71
Определение содержания белка 72
, 2.1.2.15. Статистическая обработка данных 72
і ГЛАВА "3. ВОЗДЕЙСВИЕ МЕЛАТОНИНА НА ИНТЕНСИВНОСТЬ : СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ И АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНОИ СИСТЕМЫ В ПЕЧЕНИ И КРОВИ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ
3.1. Активность аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы
і в сыворотке крови крыс при токсическом гепатите и действии
мелатонина
3.2. Влияние мелатонина на интенсивность свободнорадикальных
процессов в печени и сыворотке крови крыс при токсическом гепатите : _ _
: 3.2.1. Влияние мелатонина на параметры биохемилюминесценции в
печени и сыворотке крови крыс при токсическом гепатите _ _
Изменение уровня диеновых коньюгатов в печени и сыворотке крови крыс под действием мелатонина при токсическом гепатите ,
Активность аконитатгидратазы в печени и сыворотке крови крыс при токсическом гепатите и действии мелатонина _,
3.3. Влияние мелатонина на антиоксидантный потенциал в печени и сыворотке крови крыс при токсическом гепатите
3.3.1. Активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в печени и сыворотке крови крыс при токсическом гепатите и действии мелатонина
3.3.2. Содержание глутатиона в печени и сыворотке крови крыс при :
токсическом гепатите и действии мелатонина : „^
3.3.3. Изменение активностей НАДФ - специфичной , „.
изоцитратдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени и сыворотке крови крыс при токсическом гепатите и действии мелатонина
3.3.4. Содержание цитрата в печени и сыворотке крови крыс при
токсическом гепатите и при действии мелатонина
Изменение активностей каталазы и супероксиддисмутазы в печени и сыворотке крови крыс при токсическом гепатите и действии мелатонина
Содержание а-токоферола в печени и сыворотке крови крыс при токсическом гепатите и действии мелатонина
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА
СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЙ ГОМЕОСТАЗ ПРИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПЕРТИРЕОЗЕ У КРЫС
4.1. Активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и креатининкиназы-МВ в тканях крыс при экспериментальном гипертиреозе и действии мелатонина
4.2. Влияние мелатонина на интенсивность свободнорадикальных процессов в печени, сердце и сыворотке крови крыс при ', экспериментальном гипертиреозе
4.2.1. Влияние мелатонина на параметры биохемилюминесценции в
печени, сердце и сыворотке крови крыс при гипертиреозе
4.2.2. Изменение уровня диеновых коньюгатов в печени, сердце и
; сыворотке крови крыс под действием мелатонина при
экспериментальном гипертиреозе
4.2.3. Активность аконитатгидратазы в печени, сердце и сыворотке
' крови крыс при экспериментальном гипертиреозе и действии
, мелатонина
і 4.3. Влияние мелатонина на антиоксидантный потенциал в печени,
сердце и сыворотке крови крыс при экспериментальном гипертиреозе
; 4.3.1. Активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в 1
печени, сердце и сыворотке крови крыс при экспериментальном гипертиреозе и действии мелатонина
4.3.2. Содержание глутатиона в печени, сердце и сыворотке крови крыс ,
при экспериментальном гипертиреозе и действии мелатонина
4.3.3. Изменение активностей НАДФ -изоцитратдегидрогеназы и
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в печени, сердце и сыворотке крови '
крыс при экспериментальном гипертиреозе и действии мелатонина
4.3.4. Содержание цитрата в печени, сердце и сыворотке крови крыс при
экспериментальном гипертиреозе и действии мелатонина
4.3.5. Изменение активности каталазы в печени, сердце и сыворотке крови крыс при экспериментальном гипертиреозе и действии : мелатонина
4.3.6. Содержание а-токоферола в печени, сердце и сыворотке крови ;
і
крыс при экспериментальном гипертиреозе и действии мелатонина .
ГЛАВА 5. КЛИНИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЭПИФАМИНА И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫИ ГОМЕОСТАЗ ПРИ ЛЕКАРСТВЕННОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ
5.1. Влияние эпифамина на показатели клинической картины заболевания у больных лекарственным гепатитом при проведении
: традиционной терапии
; 5.2. Влияние мелатонина на интенсивность свободнорадикальных
; процессов у больных лекарственным гепатитом
Влияние эпифамина на параметры биохемилюминесценции в ' сыворотке крови больных лекарственным гепатитом при традиционном ; лечении
Активность аконитатгидратазы в сыворотке крови больных і лекарственным гепатитом при проведении базисной терапии и приеме '
:эпифамина лп-х
5.3. Активность антиоксидантной системы у больных с лекарственным ; 19_
гепатитом при базисном лечении и комбинированной терапии с эпифамином
5.3.1. Активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в сыворотке крови больных лекарственным гепатитом при проведении базисной терапии и приеме эпифамина
5.3.2. Содержание глутатиона в сыворотке крови больных лекарственным гепатитом при проведении базисной терапии и приеме эпифамина
5.3.3. Изменение активности каталазы в сыворотке крови больных лекарственным гепатитом при проведении базисной терапии и приеме эпифамина
' 5.3.4. Содержание цитрата в сыворотке крови больных лекарственным гепатитом при проведении базисной терапии и приеме эпифамина ГЛАВА 6. 'ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ЭПИФ АМИНА НА ОКСИДАТИВНЫЙ СТАТУС И ОЦЕНКА ЕГО КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ С СИНДРОМОМ
, ТИРЕОТОКСИКОЗА
6.1. Влияние эпифамина на показатели клинической картины у больных
с синдромом тиреотоксикоза ' _
: 6.2. Влияние эпифамина на интенсивность свободнорадикального
', окисления в сыворотке крови больных с синдромом тиреотоксикоза :
і 13У
! 6.2.1. Влияние эпифамина на параметры биохемилюминесценции в
139!
1 сыворотке крови больных с синдромом тиреотоксикоза
6.2.2. Активность аконитатгидратазы в сыворотке крови больных с \
; синдромом тиреотоксикоза при проведении базисной терапии и приеме ,
'. эпифамина j ...
! 6.3. Влияние эпифамина на антиоксидантный потенциал больных с !
] синдромом тиреотоксикоза при проведении базисной терапии .
; 6.3.1. Активность глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы в,.,.
сыворотке крови больных с синдромом тиретоксикоза при проведении базисной терапии и приеме эпифамина
Содержание глутатиона в сыворотке крови больных при синдроме тиреотоксикоза при проведении базисной терапии и приеме эпифамина 1 ..
Изменение активности каталазы в сыворотке крови больных с синдромом тиреотоксикоза при проведении базисной терапии и приеме эпифамина ..„ 63 Л. Содержание цитрата в сыворотке крови больных с синдромом тиреотоксикоза при проведении базисной терапии и приеме эпифамина 1 .q ЗАКЛЮЧЕНИЕ" ""150 ВЫВОДЫ 161 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ - - ^
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 164
ПРИЛОЖЕНИЕ 190
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АГ - аконитатгидратаза
АлАт — аланинаминотрансфераза
АОЗ - антиоксидантная защита
АОС — антиоксидантная система
АсАт — аспартатаминотрансфераза
АФК — активные формы кислорода
БХЛ - биохемилюминесценция
Г6ФДГ — глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
ГП - глутатионпероксидаза
ГР - глутатионредуктаза
ДК - диеновые коньюгаты
КК-МВ — креатининкиназа (миокардиальный изофермент)
НАДФ — никотинамидадениндинуклеотидфосфат
НАДФ-ИДГ — НАДФ-изоцитратдегидрогеназа
ПОЛ - пероксидное окисление липидов
СОД - супероксиддисмутаза
СРО - свободнорадикальное окисление
Т4 - тироксин
ТТГ - тиреотропный гормон
ТХУ - трихлоуксусная кислота
ЭТГ - экспериментальный токсический гепатит
GSH - глутатион восстановленный
GSSG — глутатион окисленный
Введение к работе
Актуальность проблемы. Важнейшим направлением современной медицины является изучение особенностей клеточного метаболизма в условиях патологии и действия веществ-протекторов, что способствует выяснению молекулярных основ патогенеза болезней и выбору наиболее эффективных путей коррекции патологических состояний.
Из заболеваний пищеварительной системы токсический гепатит является одной из наиболее распространенных форм патологии печени. Имеются данные, что токсическое поражение печени у животных сопровождается усилением процессов свободнорадикального окисления (СРО) [169, 189]. Известно, что от 10 до 25% всех случаев токсического гепатита возникает в результате применения фармацевтических препаратов [12, 95, 99]. Примерно у 20%) пациентов, получающих противотуберкулезные препараты, отмечается лекарственное поражение печени [240, 247]. При синдроме тиреотоксикоза, являющегося одним из самых часто встречаемых заболеваний щитовидной железы, под действием избытка тиреоидных гормонов происходит поражение пищеварительной, сердечно-сосудистой, центральной нервной систем и т.д. [6, 23]. Следует отметить, что антитиреоидные препараты относятся к классу ксенобиотиков, способных оказывать токсическое действие на печень [184]. Данные о вовлечении тиреоидных гормонов в процессы регуляции СРО противоречивы [89, 146, 178]. Известно, что свободнорадикальные процессы являются необходимым звеном метаболизма. Однако при чрезмерной генерации активных форм кислорода (АФК) СРО участвует в развитии ряда заболеваний внутренних органов в качестве ключевого звена патогенеза [36, 79, 163]. Повышенная интенсивность СРО вызывает структурно-функциональные повреждения мембран, белков, нуклеиновых кислот, что приводит к нарушению клеточного гомеостаза в целом. Это сопровождается развитием окислительного стресса, в основе которого лежит дисбаланс между
интенсивностью СРО и активностью антиоксидантной системы (АОС) организма [45, 83, 91].
В настоящее время повышается интерес к средствам антиоксидантной защиты, в основе которых лежат естественные метаболиты клеток. В связи с этим приобретает актуальность исследование антиоксидантной активности мелатонина [85, 124]. Известно, что мелатонин - нейрогормон, продуцируемый эпифизом, а также экстрапинеальными тканями, - участвует в синхронизации биоритмов, регуляции репродуктивной и иммунной систем, антистрессовой защите [55, 58, 122]. Имеются данные, что мелатонин может выступать как перехватчик ряда свободных радикалов [8, 138]. Предполагают, что генерация АФК, а также связанные с ней сигнальные процессы лежат в основе индукции синтеза защитных компонентов клетки, регуляции активности АОС и неспецифической резистентности организма. Однако многие вопросы остаются открытыми. В связи с вышесказанным представляет интерес исследование воздействия мелатонина, а также содержащих его препаратов на интенсивность СРО и состояние АОС организма при токсическом гепатите и синдроме тиреотоксикоза.
Цель исследования: исследование воздействия мелатонина на свободнорадикальный гомеостаз в эксперименте на животных и оценка клинической эффективности препарата на основе мелатонина — эпифамина, а также его влияния на антиоксидантный статус больных при токсическом поражении печени и синдроме тиреотоксикоза.
Задачи исследования:
1. Комплексная оценка ферментативных тестов, характеризующих тяжесть
патологического процесса, интенсивности свободнорадикальных
процессов, активности антиоксидантной защиты, ряда ферментов,
сопряженных с функционированием АОС (глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы (ГбФДГ, КФ 1.1.1.49), НАДФ-
изоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИДГ, КФ 1.1.1.42), аконитатгидратазы
(АГ, КФ 4.2.1.3)) в печени и сыворотке крови экспериментальных животных при токсическом гепатите и действии экзогенного мелатонина.
Определение комплекса показателей: уровня СРО, АОЗ, активности ряда ферментов окислительного метаболизма в тканях печени, сердца и крови крыс при экспериментальном гипертиреозе и действии экзогенного мелатонина.
Анализ клинической картины, показателей лабораторных и инструментальных исследований, а также оценка интенсивности свободнорадикальных процессов в организме больных с лекарственным токсическим поражением печени, развивающемся на фоне приема противотуберкулезных препаратов, при проведении традиционного лечения и комбинированной терапии с использованием препарата, содержащего мелатонин - эпиф амина.
Характеристика активности АОС в крови больных с лекарственным гепатитом на фоне традиционного лечения и при применении комбинированной терапии с использованием эпифамина.
Анализ клинической картины, показателей лабораторных и инструментальных исследований и определение параметров, характеризующих интенсивность СРО у больных с синдромом тиреотоксикоза при проведении традиционного лечения и комбинированной терапии с использованием эпифамина.
Оценка активности компонентов АОС в крови больных синдромом тиреотоксикоза при применении традиционного лечения и комбинированной терапии с использованием эпифамина.
Научная новизна: Впервые осуществлено комплексное исследование действия мелатонина на интенсивность СРО, состояние ферментативного и неферментативного звеньев АОС при токсическом гепатите и гипертиреозе в эксперименте на животных. Проведен анализ клинической картины, показателей лабораторных, инструментальных исследований, параметров СРО
и активности АОС у больных с лекарственным гепатитом, синдромом тиреотоксикоза на фоне базисного лечения и при применении комбинированной терапии с эпифамином. Убедительно доказана интенсификация процессов СРО, приводящая к окислительному стрессу, при токсическом поражении печени и гипертиреозе как в эксперименте на животных, так и у пациентов с лекарственным поражением печени и синдромом тиреотоксикоза в клинических условиях. Установлено наличие антиоксидантного эффекта мелатонина при введении животным с ЭТГ и гипертиреозом. Показана клиническая эффективность применения эпифамина на фоне базисной терапии у больных с лекарственным гепатитом и синдромом тиреотоксикоза. Полученные данные расширяют и углубляют фундаментальные представления о регуляции свободнорадикального гомеостаза при патологиях внутренних органов и действии мелатонина.
Практическая значимость: Изучение механизмов антиоксидантного действия* мелатонина дает основу для рекомендаций по его применению и включению в антиоксидантную терапию при лечении больных с лекарственным поражением печени и синдромом тиреотоксикоза. Полученные данные могут использоваться для разработки лабораторных тестов при выявлении патологических процессов, сопряженных с окислительным стрессом, в клинико-диагностических лабораториях. Выявленные изменения показателей СРО и АОС при исследуемых патологиях могут быть применены для создания ферментных констелляций, используемых в диагностических целях и наиболее информативно отражающих антиоксдантный статус организма.
Положения, выносимые на защиту: 1. Доказано протекторное действие мелатонина при токсическом поражении печени и гипертиреозе у экспериментальных животных. Экзогенный мелатонин приводит к улучшению маркерных показателей при данных
состояниях и способствует торможению процессов СРО, усиливающихся при развитии патологии.
Введение мелатонина животным при токсическом гепатите и гипертиреозе приводит к снижению степени мобилизации АОС и изменению в сторону нормы показателей антиоксидантной защиты и активности ряда ферментов окислительного метаболизма (АГ, Г6ФДГ, НАДФ-ИДГ), способных лимитировать СРО.
Применение эпифамина на фоне базисной терапии у больных с лекарственным поражением печени, развивающемся в результате комплексного приема противотуберкулезных препаратов, улучшает общее состояние и параметры, характеризующие антиоксидантный статус организма.
Включение в традиционное лечение больных с синдромом тиреотоксикоза эпифамина приводит к повышению антиоксидантного статуса пациентов и улучшению ряда показателей клинической картины заболевания.
Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в биологии и медицине» (Воронеж, 2004); третьей междисциплинарной конференции с международным участием (Петрозаводск, 2004); VIII международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004); IV международной научно-практической конференции «Студенческая медицинская наука XXI века» (Витебск, 2004); межрегиональной студенческой научной конференции с международным участием «Студенческая медицинская наука» (Воронеж, 2004); международной научной конференции. «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных» (Саранск, 2005); научной конференции молодых ученых, посвященной 60-летию Института хирургии им. А.В.Вишневского РАМН «Современные методы диагностики и лечения
заболеваний в клинике и эксперименте» (Москва, 2005); 9-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2005); межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Современные направления теоретической и практической медицины» (Воронеж, 2005); научной конференции студентов и молодых ученых «Инновационные технологии в медицине» (Воронеж, 2005); Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006); 1-ой Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2006); 1-ой Всероссийской молодежной медицинской конференции студентов и молодых ученых «Экстремальные и терминальные состояния» (Омск, 2006); 8-ой зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2006); 3-ей Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Томск, 2007); IV Всероссийском тиреоидологическом конгрессе (Москва, 2007). Результаты работы использованы при выполнении проекта по ведомственной целевой программе Министерства образования и науки РФ - «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП.2.1.1.4429.
Внедрение. Результаты исследований апробированы в
эндокринологических отделениях МУЗ ГО г. Воронеж Городской клинической больницы скорой медицинской помощи № 10 (МУЗ ГО г. Воронеж ГКБ СМП №10) и МУЗ ГО г. Воронеж Городской клинической больницы № 7 (МУЗ ГО г. Воронеж ГКБ № 7), терапевтических отделениях ГУЗ Воронежского областного клинического противотуберкулезного диспансера им. Н.С. Похвисневой (ГУЗ ВОКПД им. Н.С. Похвисневой), учебной и клинической практике на кафедре эндокринологии, в учебном процессе на кафедрах
биологии с экологией и патологической физиологии ГОУ ВПО ВГМА им.Н.Н. Бурденко Росздрава.
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 28 публикациях, в том числе — 6 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 189 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, 6 глав, списка литературы (251 источник) и приложения. Иллюстрационный материал включает 46 рисунков и 11 таблиц. В приложении содержатся 11 рисунков и 2 таблицы.
