Содержание к диссертации
Список сокращений 4
Введение 5
Глава 1. Обзор литературы 13
Тканевая инженерия-описание дисциплины 13
Использование биореакторов 20
Эмбриогенез костной ткани 22
Морфологические характеристики кости 27
Остеокласты 29
Гены, контролирующие первичный и вторичный остеогенез 29
Остеогенез в культуре 32
Трансплантационный репаративный остеогенез 33
Тканевая инженерия кости 39 Глава 2. Материалы и методы 43
Общая характеристика материала и структура исследования 43
Выделение и характеристика стромальных клеток из подкожной 49 жировой ткани крыс
Проточная цитометрия 4 8
2.4. Подготовка к исследованию биобезопасности клеток и 49
получение аутологичного биотрансплантата
Молекулярные исследования клеток СКЖТ 52
Гистологическое и микроскопическое исследования 56
Сканирующая электронная микроскопия 58
Статистический анализ 59 Глава 3 Результаты 59 3.1 Характеристика клеток СКЖТ 60
3.2 Характеристика ткане-инженерного биотрансплантата 62
3.3 Результаты молекулярного исследования экспрессии генов 65
остеогенеза в клетках СКЖТ
3.4 Исследование иммунологического ответа после трансплантации 66
ксеногенных, аллогенных и аутологичных клеток
3.5 Постабразивный остеогенез в зоне дефекта. Результаты 69
исследования на 7 сутки после пересадки материала
Результаты исследования на 21 сутки исследования 73
Результаты исследования на 40 сутки исследования 78
Результаты исследования на 120 сутки исследования 82
Иммуногистохимическое окрашивание срезов биотрансплантата 88
3.10 Сравнение количества сосудов в экспериментальной и 91
контрольной группах
Глава 4. Обсуждение 93
Заключение 98
Выводы 100
Список литературы 101
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
BMP - Bone morphogenetic protein
IL-6 - интерлейкин 6, фактор дифференцировки В-клеток
LIF - Leukemia Inhibitory factor
PLGA - Poly Glycolic Lactic Acid
PCL - poly (D, L)-lactide-co-caprolactone
SHH - Sonic hedgehog
VEGF - vascular endothelial growth factor
VCAM - vascular cell adhesion molecule
BKM - внеклеточный матрикс
ГАГ - гликозоаминогликаны
ДМСО - диметилсульфокид
ККМ - клетки костного мозга
ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки
МСК - мезенхимальные стволовые клетки
НГ - нервный гребень
ОБ - остеобласты
ОК - остеокласты
СКЖТ - стромальные клетки подкожной жировой ткани
ССФ - стромально-сосудистая фракция
ТИ - тканевая инженерия
ФСБ - фосфатно - солевой буфер
Введение к работе
Травмы, хирургические вмешательства при доброкачественных и злокачественных опухолях на челюстях заставляют клиницистов и исследователей искать новые подходы к восстановлению пораженной, травмированной или утерянной костной ткани. В ортопедической и стоматологической практике широко применяются остеопластические и остеоиндуктивные материалы различного происхождения. Так, гидроксиапатит был впервые применен в 1978 году, а с конца 80-х годов больше половины статей в специализированном журнале «Materials in Medicine», а также значительное количество исследовательских работ в наиболее престижных ортопедических и стоматологических журналах были посвящены исследованию и применению этого и других остеопластических материалов [19, 57, 72, 127]. В дальнейшем спектр используемых материалов стал значительно расширяться. Несмотря на то, что костная ткань обладает высокой восстановительной способностью, в ряде случаев репаративный процесс в костной ткани (даже при использовании различных остеопластических и остеоиндуктивных материалов) не заканчивается восстановлением ее структуры и функции [20, 21]. Подобные случаи, обусловленные разрушением или недостатком клеток-предшественников костной ткани, можно охарактеризовать как "остеогенную недостаточность" [3, 21, 22, 23]. В связи с этим, на протяжении последних десяти лет в различных странах исследователями и клиницистами ведется поиск новых материалов, а также методик (в том числе и с использованием клеток-предшественников костной ткани) для восстановления не только структуры костной ткани, но и ее функций [38].
Актуальность
Восстановление целостности кости является актуальной проблемой современной травматологии, ортопедии и стоматологии, а также
фундаментальных медико-биологических дисциплин. В настоящее время активно ведется поиск новых клеточных технологий, которые позволяли бы ускорить образование костной ткани, как на периферии костного дефекта, так и внутри имплантата.
Как известно, аутологичные и аллогенные костные трансплантаты характеризуются невысокой выживаемостью in situ, плохо взаимодействуют с костью реципиента из-за влияния на нее патофизиологических процессов и подвергаются быстрой резорбции [21-23]. Также часто происходит полная перестройка пересаженной костной ткани, а процесс получения кости прежней прочности длительный и занимает несколько лет. Кроме того, полноценное восстановление костной ткани возможно только при перемещении костного трансплантата на сосудистой «ножке» или после предварительной его пересадки на отдаленные участки тела с включением в кровоток [132, 133]. Такие операции могут быть выполнены с помощью микрохирургической техники в высокоспециализированных стационарах, которые не могут обеспечить потребностей в возрастающем количестве остеопластических операций. По этим причинам в последнее время органные костные трансплантаты признаны неперспективным видом борьбы с дефицитом костной ткани.
В последние годы на первый план в фундаментальной и клинической стоматологии и ортопедии выходят клеточные трансплантаты на основе стволовых и прогениторных клеток. Изучение клеточной биологии костной ткани в культуре, открытие ростовых факторов, контролирующих патоморфологические изменения в поврежденной костной ткани, привело к бурному прогрессу знаний и технологий по направленному остеогенезу, разработке новых методов лабораторного выращивания костной ткани in vitro на биологически активных, не имеющих иммуногенных свойств, заменителях костной ткани, способных к биодеградации и обладающих
остеокондуктивными свойствами [51]. Клиницистами получены первые
результаты, которые свидетельствуют о перспективности лечения дефектов костей различных локализаций и доступности подобных методик, и их приемлемой стоимости [109]. Однако дальнейшее развитие новых клеточных технологий в области стоматологии, оперативной травматологии и ортопедии сдерживается тем, что в подобных работах не прослежены отдаленные результаты лечения, недостаточно хорошо освящена динамика процесса, а исследования не структурированы по срокам наблюдения; также часто не описана функциональная активность восстановленной костной ткани, что затрудняет оценку адекватности выбора методов лечения и его эффективности. Как известно, лимиты естественной репарации костной ткани определяются патофизиологическими процессами, приводящими к снижению активности и численности остеобластов, что сопровождается снижением уровня щелочной фосфотазы, остеокальцина, коллагена 1 типа и других маркерных белков остеогенеза, а также дефицитом ростовых факторов, сигнальных молекул и цитокинов, регулирующих процесс репарации. Исследовательские работы с глубоким подходом в этой области и качественным гистологическим описанием патологических процессов единичны [2]. Изучение вопросов данной проблемы позволит дополнить сведения о морфофункциональной характеристике репаративного остеогенеза, изучить современные способы его оптимизации, что позволит разработать новые методы реконструкции костной ткани in vitro с участием стволовых клеток, остеоиндуктивных и остеопластических высокопористых материалов и факторов, ускоряющих региональную и системную репарацию кости.
Регенерация кости - сложный многоступенчатый процесс, составляющими которого являются миграция, пролиферация, дифференцировка различных клеточных популяций мезенхимального происхождения. Регенерация костной ткани и развитие кости в эмбриогенезе протекают с участием незрелых клеток мезенхимы, которые сохраняются в
так называемых стволовых нишах периоста, эндоста и костного мозга [31, 78, 137]. Теоретические основы использования остеогенных и хондрогенных клеточных элементов в целях костной пластики и лечения повреждений тканей хряща закладывались основоположниками классической гистологии. Известный гистолог А.А. Максимов, еще в двадцатые годы предложил теорию о «мезенхимальном резерве», согласно которому, все «механоциты» (фибробласты, остеобласты, хондроциты и др.) и клетки крови во взрослом организме происходят от слабо дифференцированных полипотентных предшественников [89]. Через некоторое время в процессе исследований, в экспериментах с культурами стромы костного мозга взрослых доноров были выявлены клетки, которые очевидно являлись предшественниками «механоцитов», однако при этом они не были идентичны стволовым клеткам крови по своим свойствам [5].
Исследований патологов, гистологов и морфологов, касающихся целостного гистологического и гистоморфометрического анализа репаративных процессов в костной ране при использовании клеточных биотехнологий в научной литературе недостаточно. Исследовательские работы с глубоким подходом в этой области и качественным гистологическим описанием патологических процессов единичны [2]. Кроме того, одной из сложных проблем является выбор адекватного носителя для культуры клеток, что непосредственно влияет на судьбу клеточной культуры, привнесенной в дефект кости, и исход процесса регенерации кости.
Исследование данной проблемы позволит дополнить сведения о морфофункциональной характеристике репаративного остеогенеза, изучить современные способы его оптимизации, что может быть использовано в теоретической гистологии и клинической практике. С учетом приведенных положений разрабатываемая проблема является актуальной и представляет не только теоретическое, но и практическое значение, что и определяет тему данного экспериментального исследования.
Цель исследования
Целью данного исследования является изучение влияния биотрансплантата, состоящего из рЗ-фосфата кальция (ChronOs) и стромальных клеток подкожной жировой ткани на de novo остеогенез после частичной остеоабразии наружной поверхности нижней челюсти у крыс
Задачи
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Отработать условия получения культуры стромальных клеток подкожной жировой ткани и охарактеризовать ее.
Продемонстрировать биобезопасность применения стромальных клеток подкожной жировой ткани при подкожном введении (ксеногенной, аллогенной и аутологичной трансплантациях на различных сроках).
Создать и охарактеризовать 3D тканеинженерный биотрансплантат для моделирования репаративного остеогенеза in vivo.
Разработать способ получения тканеинженерной конструкции, пригодной для имплантации с целью эффективного и безопасного репаративного остеогенеза.
Разработать модель повреждения костной ткани в виде остеоабразии на нижней челюсти крыс.
Изучить влияние матрицы с клетками и без них на процессы формирования кости de novo на разных сроках исследования (в том числе и длительных).
Научная новизна
Модифицирован и оптимизирован способ выделения и культивирования стромальных клеток подкожной жировой ткани, показана биобезопасность полученных клеток. Охарактеризован остеогенный потенциал культуры.
Разработана оригинальная технология заселения клеток на выбранную матрицу, доказано выживанием клеток на матрице, показана высокая эффективность прикрепления и пролиферации клеток на матрице. Разработана доклиническая модель исследования костного трансплантата, моделированного in vitro, на животных (in vivo).
Изучен и сопоставлен регенерационный остеогенез без внесения и с внесением в область поверхностного дефекта нижней челюсти стромальных клеток подкожной жировой ткани (СКЖТ), показано их влияние на образование сосудистой сети в области имплантата и вокруг нее.
С помощью гистологического анализа выявлены закономерные этапы остеогенеза, происходящие на границе биотрансплантата и нативной костной ткани нижней челюсти после операции остеобаразии. На разработанной оригинальной модели репаративного остеогенеза у крыс с помощью серийного гистологического анализа изучены особенности действия клеточного трансплантата по сравнению с бесклеточным матриксом. Выявлена и изучена ангиогенная активность клеточного трансплантата. Установлено, что на длительных сроках наблюдения de novo остеогенез идет только в условиях контакта с нативной костью в сравнении с подкожной имплантацией, тогда как васкулогенез происходит в обоих случаях.
Проведенная работа является оригинальным экспериментальным исследованием, в котором впервые произведена оценка динамики репаративного остеогенеза и васкулогенеза in vivo.
Теоретическая и практическая значимость
Разработанная технология выделения и культивирования СКЖТ и их последующее заселение на подобранный пористый носитель позволила создать биобезопасный и биодеградируемый тканеинженерный имплантат.
Предложена адекватная экспериментальная модель повреждения
костной ткани на животных (операция частичной остеоабразии).
Работа является первым экспериментальным исследованием, в котором проводится оценка стимуляции и динамики регенерации костной ткани трансплантации тканеинженерного трансплантата, полученного in vitro, путем заселения СКЖТ на пористый носитель ChronOs. Материалы диссертации могут служить основой для дальнейшей научно-практической работы в данной области и разработки новых биомедицинских технологий. Результаты работы использованы компанией Synthes (Швейцария) для подтверждения биобезопасности и перспектив использования производимого материала в области регенерации костной ткани.
Разработанная технология выделения и культивирования клеток СКЖТ, а также их заселения на матрицу позволяет совершенствовать и внедрять в клиническую практику методы улучшения течения репаративнои регенерации костной ткани (при переломах, дефектах костей и др.). Основные положения, выносимые на защиту
Разработанная технология пересадки тканеинженерного биотрансплантата на основе остеопластического материала ChronOs и клеток СКЖТ в область дефекта плоской кости ускоряет процесс формирования кости de novo и обеспечивает формирование функционально активной костной ткани.
Присутствие в трансплантате культуры клеток СКЖТ приводит к сокращению сроков образования костной ткани de novo в основном за счет улучшения формирования сосудистого русла и кровоснабжения в пересаженном биотрансплантате на ранних сроках.
Пересадка тканеинженерного биотрансплантата, моделированного in vitro на основе ChronOs и клеток СКЖТ является наиболее перспективной стратегией для последующего клинического использования, по сравнению с пересадкой носителя без клеточного материала.
Реализация работы
Результаты работы служат теоретическим обоснованием для дальнейшего развития клеточных биотехнологий и их внедрения в травматологическую и стоматологическую практику. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. На основе результатов диссертации планируется проведение ограниченных клинических испытаний в стоматологической практике.
Апробация работы Основные положения работы доложены на:
MGH-HKU-Nature China Forum: Molecular Medicine and Biopharma Opportunities. "Comparison of different stem cell sources and biomimetic scaffolds for bone tissue engineering." (2007, Hong Kong);
Международной конференции «Osstem Meeting 2007 Early and Esthetic» (2007, Москва);
V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (2008, Москва);
Российской конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (2008, Москва)
Структура и объем работы Материалы диссертации представлены на 112 страницах. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методик исследования, результатов исследований, заключения, выводов, и списка литературы. Работа содержит 34 рисунка и 9 таблиц. Список литературы включает 143 источника, из них 5 отечественных и 138 иностранных авторов.
