Содержание к диссертации
Введение
Глава 2. Материалы и методы исследования 29
2.1. Клиническая характеристика больных 29
2.2.Методы клинического исследования 31
2.3. Методология исследований по изучению эффективности препарата «спленопид» в лечении язвенной болезни 32
2.4. Исследования показателей имунной системы 34
2.5. Морфологическое исследование биоптатов 39
2.6. Статистическая обработка полученных результатов 39
Глава 3. Характеристика апоптоза и функциональной активности лимфоцитов у больных язвенной болезнью 41
Глава 4. Особенности продукции цитокинов у больных язвенной Болезнью 50
4.1 Биологическая активность и уровень цитокинов в сыворотке крови больных яб 50
4.2 Уровень спонтанной и лпс-индуцированной продукции цитокинов в культурах цельной крови больных язвенной болезнью 56
4.3 Феномен t-клеточной ареактивности и возможности цитокиновой коррекции 65
Глава 5. Клинико-иммунологическая оценка эффективности спленопида в комплексной терапии больных язвенной болезнью 76
5.1 Клиническая эффективность цитокинотерапии спленопидом 76
5.2 Иммунокорригирующие эффекты спленопида 79
Обсуждение полученных результатов
Исследования 88
Выводы 96
Литература 97
- Методология исследований по изучению эффективности препарата «спленопид» в лечении язвенной болезни
- Морфологическое исследование биоптатов
- Характеристика апоптоза и функциональной активности лимфоцитов у больных язвенной болезнью
- Уровень спонтанной и лпс-индуцированной продукции цитокинов в культурах цельной крови больных язвенной болезнью
Введение к работе
Актуальность темы. Необходимость исследований патогенеза язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки связана с высокой распространенностью этой патологии, недостаточной изученностью вопросов этиологии, патогенеза язвенной болезни, развитием осложнений, которые приводят к временной, а иногда и стойкой утрате трудоспособности и даже летальным исходам (Комаров Ф И, 1990, Ивашкин В Т, 2006) Так, например, только в США ежегодно регистрируется более 500 000 первичных случаев и около 4 миллионов рецидивов заболевания (Луняков А С , 1998)
В настоящее время известно, что развитие гастродуоденальной патологии в целом и пептических язв, в частности, четко ассоциируется с инфекцией, вызванной грамотрицательной бактерией Helicobacter pylon По данным Marshall (1994) 70 % и 92 % больных соответственно с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстноіі кишки инфицированы Helicobacter pylon Схожие эпидемиологические данные получены и в исследованиях, проведенных в Западно-Сибирском регионе (Решетников О В , 2001)
Открытие инфекционного агента в качестве причинного фактора язвенной болезни позволило совершенно с новых позиций подойти к патогенезу данного заболевания, в частности, высветило важную роль иммунной системы в развитии и исходе язв При этом одним из новых направлений исследований стало изучение механизмов формирования адекватного иммунного ответа и их нарушений, как причины развития и хронизации инфекции и неблагоприятного течения язвенной болезни
Действительно, несмотря на высокую инфицированность населения Н pylon, у большинства людей отмечается бессимптомное носительство, и только в 10 % случаев хеликобактерная инфекция приводит к развитию язвенного дефекта (В Marshall, 1994) Именно поэтому высказывается предположение, что патогенное действие Н pylon на слизистую оболочку желудка и двенадцатиперстной кишки во многом определяется дополнительными факторами, среди которых особое значение придается иммунным нарушениям Изменения в иммунной системе могут существовать исходно и являться «предрасполагающим» фоном для клинического проявления инфекции Кроме того, иммунные дисфункции на фоне хронического течения инфекции, могут быть результатом как патогенного действия самого Н pylon, так и индуцированного бактерией воспалительного процесса
Несмотря на интенсивные исследования особенностей функционирования иммунной системы при индуцированной Н pylon инфекции, в имму-нопатогенезе язвенной болезни остается еще много нерешенных вопросов До настоящего времени не ясно, какие иммунологические дефекты на местном и системном уровнях приводят к ослаблению контроля над хелико-бактерной инфекцией и способствуют последующему язвообразованию
Показано, что при язвенной болезни и ее рецидивах выявляется снижение количества и функциональной активности лимфоидных клеток (Мягкова Л П, 1991, Луняков А С 1998, Циммерман Я С , 2000) Однако показатели иммунитета у больных язвенной болезнью характеризуются крайней неоднородностью При этом до сих пор не выявлено четких ассоциаций определенных параметров иммунитета с клиническими особенностями заболевания, что естественно затрудняет осмысление патогенетической значимости иммунной системы в ульцерогенезе Наконец, еще один важный аспект заключается в том, что поскольку при хеликобактерной инфекции наблюдается неадекватный иммунный ответ, методы иммунокоррекции должны быть неотъемлемой составляющей частью патогенетической терапии заболеваний желудочно-кишечного тракта, вызванных Н pylon Однако иммунотерапевтические подходы к лечению язвенной болезни и гастро-дуоденитов хеликобактерной этиологии разработаны недостаточно
Цель исследования. Исследование клеточно-молекулярных механизмов нарушения иммунитета при язвенной болезни для изучения взаимосвязи иммунологических и клинических параметров и оптимизации терапии
Задачи исследования:
-
Изучить взаимосвязь состояния иммунитета с особенностями клинического течения у пациентов с язвенной болезнью
-
Оценить показатели апоптоза и функциональной активности лимфоцитов у больных язвенной болезнью
-
Исследовать биологическую активность, спонтанную и индуцированную продукцию про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке и цельной крови у лиц с язвенной болезнью
-
Оценить влияние цитокин-с о держащих препаратов на функциональную реактивность Т-клеток больных язвенной болезнью, клиническое течение, частоту осложнений и рецидивирования
Научная новизна работы. Впервые выявлено, что у пациентов с обострением язвенной болезни выявляется усиление спонтанного апоптоза лимфоцитов и активационного апоптоза Т-клеток Программированная гибель циркулирующих лимфоцитов у больных является одним из механизмов иммуносупрессии, поскольку ассоциирована с угнетением пролифера-тивной активности Т-лимфоцитов и снижением количества лимфоцитов в периферической крови При этом выявлена взаимосвязь между усилением апоптоза и неблагоприятным характером течения заболевания
Установлено, что нарушение функциональной активности лимфоцитов у больных язвенной болезнью ассоциировано с изменением продукции Thl/провоспалительных и іЬ2/противовоспалительньіх цитокинов В частности, впервые выявлено снижение уровня ТЫ и Th2 цитокинов в сыворотке крови и уровня их спонтанной продукции в культурах клеток цель-
ной крови, что является еще одним подтверждением нарушения функциональной активности Т-клеток С другой стороны, у исследуемых пациентов обнаружен повышенный уровень липополисахарид-индуцированной продукции IL-10, что сопровождается резким снижением индекса соотношения TNF-ct/IL-ІО, характеризующего баланс про- и противовоспалительных цитокинов
Впервые изучены эффекты комплексного цитокин-содержащего препарата спленопид in vitro и in vivo у больных язвенной болезнью В результате экспериментально обоснована целесообразность применения препарата спленопид для коррекции иммунных дисфункций при язвенной болезни Показано, что применение спленопида в подгруппе больных с лабораторно подтвержденным снижением Т-клеточной реактивности оказывает заметный иммунокорригирующий эффект, который проявлялся 2-кратным усилением уровня пролиферации Т-клеток Кроме того, впервые установлено, что применение спленопида в комплексном лечении язвенной болезни оказывает иммуномодулирующий эффект на продукцию цитокинов и приводит к более быстрому купированию болевого синдрома и удлинению продолжительности ремиссии
Полученные данные о наличии иммунных дисфункций при язвенной болезни, сопряженности их с тяжестью заболевания, возможности коррекции нарушений иммунитета с помощью цитокинов и достижения при этом клинического эффекта в целом свидетельствуют о значимости иммунных нарушений в патогенезе язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки у пациентов с хеликобактерной инфекцией
Научно-практическая значимость работы. Выявленное развитие вторичной иммунной недостаточности у пациентов с длительным и осложненным течением язвенной болезни свидетельствует о необходимости проведения иммунокорригирующей терапии
Эффективность применения спленопида позволяет рекомендовать его для включения в схему лечения больных с длительным и тяжелым течением заболевания при налігши лабораторного подтверждения дисбаланса системного иммунного ответа
Показано, что применение цитокинотерапии фармакоэкономически оправданно, так как позволяет увеличить продолжительность безрецидивного периода
Внедрение результатов в практику. Полученные результаты исследования внедрены в лекционный курс для ординаторов и аспирантов ГУ НЦКЭМ СО РАМН, а также в практику работы клиники ГУ НЦКЭМ СО РАМН, Окружного военного госпиталя № 333
Апробация работы. Результаты исследования доложены на 6-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург -
Гастро-2004» (Санкт-Петербург, 2004), на 5-ой Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием (Красноярск, 2005)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ, 3 из которых в журналах, включенных в список периодических научных изданий, рекомендованных ВАК РФ для опубликования материалов кандидатских диссертаций
Положения, выносимые на защиту:
-
В патогенезе язвенной болезни большое значение имеет усиление апоптоза циркулирующих мононуклеарных клеток, а также выраженный сдвиг цитокинового баланса в сторону провоспалительных медиаторов (IFN-y, TNF-a) на местном и системном уровне Уровень IL-10 значительно повышается
-
У больных с длительным и осложненным течением заболевания выявлена взаимосвязь между функциональной недостаточностью Т-клеток иммунной системы и клинической картиной болезни
-
Включение в комплекс терапевтических мероприятий Спленопида позволяет ускоріпь процесс рубцевания язвенного дефекта, быстрее купировать болевой синдром и увеличить продолжительность ремиссии у пациентов
Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка цитируемой литературы, состоящего из 71 работы отечественных и 117 иностранных авторов Работа изложена на 120 страницах, иллюстрирована 23 таблицами
Методология исследований по изучению эффективности препарата «спленопид» в лечении язвенной болезни
В работах В.И. Шумакова и соавт. (1984); А.Б. Цыпина и соавт. (1995); А.В. Васильченкова (1996) показано, что эффектом иммуномодуляции обладают цитокины ксеноселезенки свиньи. В НИИ Трансплантологии и Искусственных органов в 1996 году на основе спленоперфузата разработан новый иммуномодулятор Спленопид (Splenopid). Рег.№ р№001938/01-2002. Состав: пептидная фракция, выделенная из ткани селезенки свиней. Содержит: IL-1, IL-2, ylFN, TNFa, GMCSF. Фармакологическая группа: иммуномодулятор. Производитель: НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗСР РФ. Это послужило патогенетической основой включения спленопида в схему лечения ЯБ.
Для оценки эффективности иммунотерапии с использованием препарата Спленопид нами были проведены пилотные клинические исследования. В исследование включались лица обоего пола в возрасте от 18 до 64 лет, с длительным (более 1 года) и часто рецидивирующим течением язвенной болезни желудка или двенадцатиперстной кишки в стадии обострения. Критериями исключения являлись: наличие сопутствующей аутоиммунной патологии, аллергические реакции на чужеродный белок в анамнезе, спленэктомия в анамнезе, прием иммуномодулирующих препаратов в течение 1 мес. перед включением больного в исследование.
С учетом критериев включения/исключения для клинического исследования были отобраны 21 человек (14 мужчин и 7 женщин, средний возраст 49 лет), которым проводилось комплексное лечение в условиях стационара по поводу обострения ЯБ желудка (п=9) или 12-перстной кишки (п=12). У всех пациентов была выявлена инвазия Helicobacter pylori. Стандартное клиническое обследование больных было дополнено двукратным (до и через 10-14 дней от начала лечения) исследованием показателей иммунного и цитокинового статуса. Комплексное лечение больных, включенных в клиническое исследование, состояло из стандартной эрадикационной (антисекреторной) терапии, дополненной внутримышечным введением Спленопида (140 мг, 1 р/день, в первые 4 дня). Спленопид разводили непосредственно перед применением в 2-3 мл физиологического раствора для инъекций. При оценке эффективности предложенной схемы терапии оценивалось время купирования болевого синдрома, а также состояние язвенного дефекта по данным контрольного ФГС-обследования, частота развития осложнений ЯБ и продолжительность ремиссии. Иммунологическое обследование больных осуществлялось совместно с сотрудниками лаборатории клеточной иммунотерапии ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН (руководитель лаборатории д.м.н., профессор Е.Р. Черных). Для исследования из венозной цельной или гепаринизированной крови выделяли стандартными методами леиковзвесь, сыворотку, мононуклеарные клетки (МНК). МНК культивировали в планшетах для иммунологических исследований при температуре 37С во влажной атмосфере, содержащей 5% СОг- Полная культуральная среда состояла из среды RPMI-1640, дополненной 10% инактивированной сыворотки доноров АВ (IY) группы, 2мМ HEPES-буфера, 0,3 мг/мл глютамина (все реактивы фирмы Sigma) и гентамицином (100 мкг/мл). Количество МНК, вносимых в лунку, составляло 0,1 х 10" клеток в 0,15 мл культуральной среды.
Для стимуляции клеток использовали конканавалин А (КонА, Sigma) в концентрации 15 мкг/мл или моноклональные анти-СБЗ антитела ICO-90 (анти-СБЗ, «Медбиоспектр», Москва) в концентрации 1 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч по включению в нуклеопротеидные фракции клеток Н-тимидина, вносимого за 18 ч до окончания культивирования в дозе 1 мкКю/лунку. Подсчет радиоактивности материала производили в жидкостном сцинциляционном счетчике SL - 30 (Intertechnic, Франция). Результаты представляли в виде среднего счета (имп/мин) из трех идентичных культур.
Рассчитывали индекс влияния (ИВконл или ИВантн_Сш) который представлял собой отношение уровня пролиферативного ответа клеток в стимулированных культурах к уровню спонтанной пролиферации.
В отдельных сериях экспериментов исследовали влияние Спленопида и рекомбинантного интерлейкина-2 человека (rhIL-2, препарат «Ронколейкин», номер государственной регистрации Р №000122/01-2000; производство ООО «БИОТЕХ», Санкт-Петербург) на пролиферацию МНК в культуре in vitro. С этой целью в культуры интактных и анти-СОЗ-стимулированных клеток добавляли Спленопид (140 мг) в конечном разведении 1/100 или Ронколейкин в конечной дозе 100 МЕ/мл, и оценивали уровень пролиферативного ответа через 72 ч культивирования. Рассчитывали индекс влияния Спленопида или IL-2, как было описано выше.
Уровень апоптоза оценивали среди свежевыделенных клеток лейковзвеси (апоптоз лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов), а также среди лимфоцитов, культивированных in vitro в течение 24 ч в безмитогенной среде (спонтанный апоптоз) или при стимуляции КонА (активационно-индуцированный апоптоз). Относительное содержание апоптотических клеток определяли методом проточной цитофлуориметрии по окрашиванию пропидиумом йодидом. Для этого клетки однократно отмывали забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,02% ЭДТА и 1% азида натрия (раствор А) и фиксировали в течение 30 минут холодным 1% раствором парафармальдегида. Фиксированные клетки центрифугировали, осадок ресуспендировали в 1 мл раствора А, содержащего пропидиум йодид (Propidium iodide, Sigma) в конечной концентрации 50 мкг/мл и РНКазу в концентрации 20 мкг/мл, после чего образцы клеток инкубировали в темноте в течение 30 минут при 37С. Процентное содержание апоптотических клеток рассчитывалось по одномерной гистограмме оранжевой флуоресценции клеток (FL2-A), отнесенных соответственно к лимфоцитарному, моноцитарному или гранулоцитарному региону. Апоптотические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный гиподиплоидный пик.
Наличие в сыворотке супрессорной активности определяли по степени снижения КонА-индуцированной пролиферации МНК здоровых доноров (п=3).в присутствии 10% интактной сыворотки обследуемых больных (опыт) в сравнении с уровнем митогенного ответа в присутствии 10% интактной сыворотки доноров (контроль). Полученные результаты выражали в виде индекса супрессорной активности (ПСА), рассчитанного по следующей формуле: ИСА = О - - К. Значения ИСА менее 0,85 расч.ед. свидетельствовали об иммуносупрессорной активности сывороточных факторов.
О суммарной активности медиаторов, контролирующих воспалительную реакцию, судили по способности исследуемых образцов сыворотки стимулировать (воспалительная активность) или ингибировать (противовоспалительная активность) интенсивность продукции перекиси водорода лейкоцитами здоровых доноров. Для этого клетки лейковзвеси доноров инкубировали в течение 45 мин при 37С с исследуемыми образцами сыворотки больных (опыт) или сывороткой здоровых доноров (контроль) в объемном соотношении 1:2 и определяли активность нейтрофилов по продукции Н2О2. Кратко, клетки лейковзвеси от 3 тест-доноров, ресуспендировали в забуференном физиологическом растворе в концентрации 5,0 х 106/мл. Исследуемые образцы сыворотки и контрольную донорскую сыворотку (пулированную от 10 здоровых доноров) разносили по 100 мкл в плоскодонные лунки пластиковых 96-луночных планшетов (по три лунки на каждый образец сыворотки). Затем в лунки добавляли по 50 мкл (0,25 х 10 ) клеток лейковзвеси: в каждую из трех лунок - лейкоциты от разных доноров, так что каждая сыворотка тестировалась с помощью клеток трех доноров (в триплете). Планшет инкубировали 45 мин при 37С, затем в лунки добавляли по 150 мкл холодного ЗФР, и планшет центрифугировали (5 мин, 1000 об/мин). Надосадочную жидкость удаляли, а клетки ресуспендировали в 200 мкл р-ра Хенкса с 0,5% желатином и добавляли 25 мкл ортофенилдиамина (1 мг/мл). После инкубации (1ч при 37С) реакцию останавливали, добавляя 25 мкл 10% раствора серной кислоты.
Морфологическое исследование биоптатов
Пациентам в ходе фиброгастроскопии проводилась биопсия фрагментов слизистой желудка и луковицы двенадцатиперстной кишки с последующим микроскопическим анализом биоптата. Для этого биоптаты фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, после обезвоживания заливали по общепринятым методикам [Д.С. Саркисов, Ю.Л. Перов, 1996] в парафин и готовили срезы толщиной 7-8мкм. Для изучения гистологического строения срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Морфологические изменения слизистой оболочки желудка (СОЖ) оценивали с учетом наличия и степени выраженности воспалительных изменений (хроническое воспаление -инфильтрация СОЖ лимфоцитами, плазматическими клетками, макрофагами и активность - инфильтрация СОЖ нейтрофилами). Степень обсемененности СОЖ HP оценивалась полуколичественно по 4-балльной шкале: отсутствие бактерий обозначали «-», до 20 микроорганизмов в поле зрения - «+», 20-50 - «2+»,более 50 - «3+».
Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 5.0». Таблицы и рисунки содержат информацию в виде средних арифметических величин (М) и "стандартных ошибок средних (SE), медианных значений, а также в отдельных случаях представлены диапазоны минимальных и максимальных значений. Сравнение вариационных рядов осуществлялось с помощью непараметрического U критерия Манна-Уитни. Достоверность различия частоты встречаемости признака определяли, используя точный метод Фишера (ртмо)- Корреляционный анализ проводился методом ранговой корреляции Спирмана.
В главе дана клиническая характеристика пациентов, описано распределение больных по степени тяжести заболевания, выраженности болевого синдрома и наличию осложнений. Приведены схемы использованной патогенетической терапии, направленной на снижение желудочной секреции и эрадикацию HP. Охарактеризована группа больных, получавших цитокинотерапию Спленопидом. В разделе перечислены методики параклинических исследований: фиброгастродуоденоскопия с прицельной биопсией, определение Нр-статуса гистологическим методом и быстрым уреазным тестом, рентгеноскопия (по показаниям). Выполнены методики для оценки состояния иммунитета пациентов: определение уровня апоптоза свежевыделенных клеток лейковзвеси (апоптоз лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов) и лимфоцитов, культивированных in vitro в течение 24 ч в безмитогенной среде (спонтанный апоптоз) или при стимуляции КонА (активационно-индуцированный апоптоз). Оценивали супрессорную активность сыворотки, содержание в ней цитокинов и в 24-часовых супернатантах цельной крови. Определяли 9 цитокинов (TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, GM-CSF) методом проточной флюориметрии. Части больным по показаниям проводилась биопсия фрагментов слизистой желудка и луковицы двенадцатиперстной кишки с последующим микроскопическим анализом биоптата.
Для оценки полученных данных, их сравнения и выявления статистически значимых различий между группами и в динамике лечения нами был использован пакет программ STATISTICA 5.0 в среде Windows.
Из данных литературы известно, что развитие ЯБ и ее рецидивов сопровождается снижением количества и функциональной активности лимфоидных клеток [97, 125, 135]. При этом обращает на себя внимание гетерогенность показателей иммунного статуса. Этот факт, а также отсутствие четкой взаимосвязи между характером и выраженностью иммунных нарушений и клиническими особенностями заболевания во многом затрудняет понимание роли иммунной системы в ульцерогенезе.
Одной из причин иммунной недостаточности может быть усиление гибели иммунокомпетентных клеток через механизм апоптоза [74, 96, 111]. Экспериментальными исследованиями Lembo А. с соавт. установлено, что инкубация мононуклеарных клеток крови человека с Н. pylori приводит к усилению экспрессии на их поверхности Fas рецепторов (CD95 молекул), через которые медиируется запуск программы апоптоза [135]. В культуре in vitro показано также, что H.pylory (но не Campylobacter jejuni) способна усиливать апоптоз Т-лимфоцитов, при этом моноклональные анти-Fas антитела и препараты ингибиторы каспаз эффективно блокируют H.pylory-индуцированную гибель клеток [89]. Однако насколько механизмы апоптоза реализуются in vivo и приводят к неспецифическому угнетению функций циркулирующих лимфоцитов у больных с ЯБ, остается во многом неисследованным. Исходя из этого, целью первого этапа работы явилось изучение особенностей клинического течения и оценка функциональной активности и уровня апоптоза иммунокомпетентных клеток у больных с гастродуоденальными язвами.
Характеристика апоптоза и функциональной активности лимфоцитов у больных язвенной болезнью
Частотный анализ показал, что в 59% случаев (у 16 из 27 пациентов) регистрировалось наиболее выраженное усиление спонтанного и активационного апоптоза лимфоцитов in vitro, при котором исследуемые параметры выходили за верхнюю границу доверительного интервала нормативных значений ( 9 и 11% соответственно). Следует отметить, что у 2/3 этих больных (11/16, 69%) программа гибели клеток через механизм апоптоза реализовывалась и в условиях in vivo, что проявлялось значительным увеличением среди свежевыделенных клеток крови апоптотических лимфоцитов, количество которых варьировало от 10 до 18% и составляло в среднем 12,7 ± 0,7%. В то же время уровень апоптоза в популяции нейтрофилов и моноцитов достоверно не отличался от аналогичных показателей здоровых доноров.
Повышенная готовность лимфоцитов больных ЯБ к апоптозу ассоциировалась с нарушением их функциональной активности, о чем свидетельствует достоверное снижение пролиферативного ответа в культурах МНК, стимулированных КонА (альтернативный путь активации Т-клеток) или aHTH-CD3-антителами (классический путь активации Т-клеток). При этом между уровнем апоптоза свежевыделенных лимфоцитов и интенсивностью спонтанной, КонА- и анти-СБЗ -индуцированной пролиферации была выявлена обратная корреляционная зависимость (соответственно rs= -0,46; rs= -0,34; rs= -0,49; р 0,01).
Чтобы четко оценить характер взаимосвязи между выраженностью иммунных нарушений и уровнем апоптоза циркулирующих лимфоцитов был проведен сравнительный анализ больных, оппозитных по величине данного показателя. В первую подгруппу были выделены пациенты (п=16), у которых индивидуальные значения апоптоза свежевыделенных лимфоцитов сохранялись в границах диапазона нормы (2-10%). Из таблицы 4 видно, что по сравнению со здоровыми донорами у больных этой группы не обнаруживалось значимых изменений исследуемых параметров. Таблица 4 Особенности показателей иммунитета в подгруппах больных ЯБ оппозитных по уровню апоптоза лимфоцитов Показатель Доноры (п=25) Подгруппы больных ЯБ Подгруппа №1 (п=16) Подгруппа №2 (п=11) Лимфоциты (х 109/L) 1,85 + 0,09 2,3 + 0,16 1,7 ±0,17 Пролиферация (имп/мин):СпонтаннаяКонА-индуцированнаяA-CD3-индуцированная 1400 ±90 57110 ±4860 34720 ±1950 1600+170 43950 + 4680 28520 ±2480 1300 ±190 30420 ±3030 і 18520 ±1920 і Апоптоз лимфоцитов(%):Спонтанный КонА-индуцированный 6,2 ± 0,5 7,4 ± 0,6 7.7 ±1,09.8 ±1,1 15,0 ± 0,9 Т 19,2 ±1,1 Т Апоптоз лимфоцитов (%) 4,2 ± 0,4 3,8 ±0,4 12,7 ± 0,7 Т Апоптоз моноцитов(%) 13,9 ±1,7 11,3 + 1,7 21,3 ± 3,2 Т Апоптоз нейтрофилов(%) 5,4 ± 0,9 3,6 ± 0,7 5,9 ±1,4 Примечание. - ри 0,05; - ри 0,01, достоверность различий между подгруппами больных, Т4- - достоверные изменения показателей по сравнению с группой здоровых доноров (ри 0,01). Во вторую подгруппу вошли 11 пациентов с высокими значениями апоптоза лимфоцитов ( 10%). По сравнению с больными из оппозитной подгруппы у них регистрировалось достоверное снижение абсолютного количества лимфоцитов, глубокое угнетение их пролиферативной активности и усиление спонтанного и активационного апоптоза в культуре in vitro, а также повышенная гибель клеток не только среди свежевыделенных лимфоцитов, но и среди моноцитов. При этом нарушения исследуемых параметров были столь выраженными, что даже на уровне средних значений находились либо на границе нормативного диапазона, либо выходили за его пределы. В то же время, нейтрофилы больных из обеих подгрупп характеризовались резистентностью к апоптогенным сигналам.
Из полученных данных следует, что иммунологические сдвиги при ЯБ, выявленные ранее при анализе функциональной активности лимфоцитов у больных ЯБ в целом по группе (таблица 3), связаны исключительно с пациентами с высоким уровнем апоптоза лимфоцитов. Таким образом, выраженная гибель циркулирующих лимфоцитов у больных гастродуоденальными язвами в фазе обострения может являться лабораторным критерием развития количественных и функциональных нарушений в системе иммунитета.
Значимость иммунных дисфункций в патогенезе ЯБ подтверждается результатами сравнительного анализа клинических особенностей заболевания у больных, оппозитных по уровню апоптоза лимфоцитов (таблица 5). Из таблицы видно, что выделенные подгруппы были однородны по полу и возрасту больных, а также по локализации язвенных дефектов. В то же время среди пациентов с выраженными нарушениями в системе иммунитета в 1,5 раза чаще встречались больные с хроническим, часто рецидивирующим и осложненным течением ЯБ.
Высокая ассоциированность гастродуоденальной патологии, включая ЯБ желудка и двенадцатиперстной кишки, с хеликобактерной инфекцией послужила толчком для пересмотра существовавшей ранее концепции ульцерогенеза. В настоящее время признается, что развитие и исход ЯБ во многом зависит от эффективности работы иммунных механизмов, обеспечивающих, с одной стороны, противоинфекционную защиту от Н. pylori и, с другой стороны, участвующих в процессах репарации и заживления язвенных дефектов, а также контролирующих сохранение гомеостатического равновесия между микро - и макроорганизмом.
Ранее высказывалось мнение [176], что иммунные процессы не являются определяющими на начальных стадиях развития ЯБ, поскольку у больных с впервые выявленной ЯБ, с коротким анамнезом, неосложненным течением и редкими рецидивами отмечается сохранность показателей иммунитета. Лишь по мере хронизации и утяжеления заболевания происходит снижение количества и функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Такая точка зрения представляется нам спорной. По-видимому, набор традиционных тестов, использованных для иммунологического скрининга, не позволил автору обнаружить каких-либо заметных нарушений местного и системного иммунитета у больных ЯБ в начале заболевания.
По нашим данным, высокий уровень апоптоза циркулирующих лимфоцитов и ассоциированные с ним иммунные дисфункции действительно встречались в 1,5 раза чаще у больных с длительным и осложненным течением заболевания. Тем не менее, аналогичные иммунные нарушения регистрировались в 27% случаев впервые выявленной ЯБ, а также примерно у половины пациентов с неосложненным течением заболевания. В свою очередь, апоптоз, количество и функциональная активность иммунокомпетентных клеток оставались на уровне нормы у части (31-50%) больных даже при длительном, часто рецидивирующем и осложненном течении ЯБ. Таким образом, нарушения в системе иммунитета могут выявляться при различных клинических вариантах развития заболевания, и, по-видимому, зависят от индивидуальных особенностей больного (наследственная предрасположенность, степень выраженности исходной иммунокопроментации, и т.д.).
Уровень спонтанной и лпс-индуцированной продукции цитокинов в культурах цельной крови больных язвенной болезнью
Использование цельной крови имеет, на наш взгляд, несколько очевидных преимуществ по сравнению с оценкой уровня продукции цитокинов в культурах МНК in vitro. Во-первых, этот метод не требует выделения и подготовки мононуклеарных клеток к культивированию, что соответственно устраняет вероятность неспецифической активации МНК на этапах сепарации. Во-вторых, оценка цитокин-продуцирующей функции клеток происходит в их естественном микроокружении, при котором сохраняется существующий in vivo баланс, как различных типов клеток крови, так и гуморальных факторов. Следовательно, оценка продукции цитокинов в экспериментальных условиях максимально приближается к условиям in vivo. И, наконец, исследования цельной крови требуют меньше времени для их проведения, а также более доступны в экономическом отношении.
Из данных таблицы 9 видно, что в условиях суточной инкубации клетки крови здоровых доноров продуцируют цитокины на уровне сопоставимом с их сывороточной концентрацией. Запуск продукции цитокинов в нестимулированных культурах цельной крови реализуется, очевидно, через механизмы ауто - и паракринной регуляции [154].
Анализ спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокинов в цельной крови здоровых доноров показал (таблица 10), что суточная инкубация цельной крови с ЛПС приводит к достоверному увеличению уровня как Thl/провоспалительных (IFN-y, IL-2, TNF-a, IL-12), так и Тп2/противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10, IL-13, GM-CSF).
В отличие от вышеперечисленных цитокинов интенсивность секреции IL-5 в стимулированной цельной крови сохранялась на уровне спонтанной продукции и значимо не менялась в ответ на активацию эндотоксином. Можно предположить, что пик накопления IL-5 приходится на более поздние сроки культивирования (48-72 ч).
Выявленное нами увеличение уровня продукции цитокинов в митоген-стимулированных культурах показывает, что клетки крови здоровых доноров функционально полноценны и через 24 ч культивирования с ЛПС активно продуцируют IFN-y, IL-2, TNF-a, IL-12, IL-4, IL-10, IL-13 и GM-CSF в концентрациях, значимо превышающих уровень спонтанной продукции. Таким образом, сравнительный анализ уровня базальной и стимулированной продукции позволяет оценить функциональный резерв системы цитокинов и секреторную активность клеток-продуцентов.
Поскольку в культурах клеток цельной крови здоровых доноров регистрировалась активная продукция цитокинов из различных функционально значимых групп, для оценки исходного состояния баланса Thl/Th2 и про-/противовоспалительных цитокинов и его изменения при антигенной нагрузке (стимуляции эндотоксином) представлялось важным просчитать индексы соотношения ключевых цитокинов из этих оппозитных групп (соответственно, IFN-y/IL-4 и TNF-c L-lO). Из данных таблицы 11 видно, что в норме баланс цитокинов характеризуется преобладанием Thl/провоспалительных медиаторов. Такая ситуация характерна как для интактных нестимулированных клеток крови, так и в условиях их активации эндотоксином. При этом в ответ на ЛПС в большей степени усиливается продукция TNF-a, чем IL-10, и индекс соотношения TNF-a/IL-Ю увеличивается в 10 раз (с 7,4 до 74, медианные значения). Функциональная активность ТЫ-клеток в ЛПС-стимулированных условиях также является доминирующей, и индекс соотношения IFN-y/IL-4 увеличивается в 5 раз (с 2,6 до 13,2, медианные значения).
Анализ содержания цитокинов в 24-часовых супернатантах цельной крови больных ЯБ, обследованных в период обострения заболевания и до начала проведения комплексной терапии, показал, что по сравнению со здоровыми донорами в группе больных регистрируется критически низкий уровень спонтанной продукции большинства из анализируемых цитокинов, относящихся как к Thl/пров о спалите льным (IFN-y, IL-2, IL-12), так и Тп2/противовоспалительным медиаторам (IL-4, IL-13, GM-CSF). Исключением являлись только TNF-a и IL-10, первый из которых спонтанно продуцировался в количествах сопоставимых с нормативными значениями, а второй — в значимо больших концентрациях (таблица 12).
Несмотря на то, что клетки крови больных характеризуются низкой исходной цитокин-секреторной активностью, тем не менее, они сохраняют свою чувствительность к митогенной стимуляции, т.е. не находятся в состоянии функциональной анергии. Однако спектр и уровень цитокинов, продуцируемых в ответ на активацию эндотоксином, имеет ряд принципиальных отличий по сравнению с клетками здоровых доноров. Так, цитокины из группы Thl/провоспалительных медиаторов секретируются в концентрациях сопоставимых с физиологическим уровнем. Также как и у здоровых доноров клетки больных ЯБ в ответ на ЛПС усиливают продукцию IL-4. Дефицит продукции IL-13 и GM-CSF, выявленный у больных ЯБ на базальном уровне, сохранялся и в ЛПС-стимулированных культурах. Однако наиболее характерной цитокин-секреторной особенностью клеток больных ЯБ оказалась их способность к активной продукции IL-10, который таюке относится к группе Тп2/противовоспалительных цитокинов. Достоверно высокий уровень IL-10 обнаруживался в спонтанных культурах и еще больше увеличивался в ответ на стимуляцию бактериальным эндотоксином (до 1220 ± 227 vs. 92 ± 62 пкг/мл у доноров, ри 0,01). Важно отметить, что среди обследованных нами пациентов в подавляющем большинстве случаев (17/21, 81%) уровень ЛПС-стимулированной продукции IL-10 варьировал от 216 до 3402 пкг/мл, т.е. в 2 и более раза превышал верхнюю квартальную границу диапазона нормативных значений (100 пкг/мл).
С целью более четкой визуализации изменений внутри регуляторной цитокиновой сети у больных ЯБ дополнительно были просчитаны индексы соотношения Thl/Th2 (IFN-y/IL-4) и про-/противовоспалительных цитокинов (TNF-a/IL-10). Из данных, представленных в таблице 13 видно, что у больных с гастродуоденальными язвами в стадии обострения выявляется выраженный дисбаланс в системе про- и противовоспалительных цитокинов. По сравнению с донорами, в культурах интактных нестимулированных клеток крови больных ЯБ регистрировалось 3-хкратное снижение индекса соотношения TNF-a/IL-10 (Median 2,5 vs. 7,4 расч.ед.; ри 0,01). При этом важно отметить, что выявленный дисбаланс продукции про- и противовоспалительных цитокинов (в основном, обусловленный гиперпродукцией IL-10) сохранялся и при стимуляции клеток липополисахаридом. Индекс соотношения TNF-a/IL-10 в этих условиях оставался чрезвычайно низким (Median 1,9 расч.ед.), тогда как у доноров отмечалось его 10-кратное увеличение (таблица 13).
![Эффективность комбинированного (медикаментозного в сочетании с лазерным излучением) лечения язвенной болезни желудка (ЯБЖ) и двенадцатиперстной кишки (ЯБДПК) [Электронный ресурс]](/i/i/4307/179586.png "Эффективность комбинированного (медикаментозного в сочетании с лазерным излучением) лечения язвенной болезни желудка (ЯБЖ) и двенадцатиперстной кишки (ЯБДПК) [Электронный ресурс] Ануфриев Роман Николаевич")
