Содержание к диссертации
Введение
І.Обзор литературы 16
1.1 Современные представления о механизмах развития хронического гломерулонефрита у человека 16
1.2 Роль нейтрофилов в развитии гломерулонефритов 19
1.2.1. Роль медиаторов воспаления в модуляции функций нейтрофильных гранулоцитов при гломерулонефрите 20
1.2.2. Рецепторы нейтрофильных гранулоцитов при гломерулонефрите 26
1.2.3. Элиминация иммунных комплексов из почечной ткани нейтрофильными гранулоцитами 33
1.2.4. Деструктивная роль нейтрофильных гранулоцитов в почечной ткани при гломерулонефрите 34
1.2.4.1 Окислительные механизмы поражения почечной ткани 35
1.2.4.2. Неокислительные механизмы поражения почечной ткани 37
1.2.5. Динамика инфильтрации почки нейтрофильными гранулоцитами при гломерулонефрите 38
1.3. Методы лечения гломерулонефрита, основанные на представлении об активном участии нейтрофильных гранулоцитов в патогенезе заболевания 39
CLASS 2. Материалы и методы исследования 4 CLASS 4
2.1. Условия получения образцов крови и почечной ткани у больных хроническим гломерулонефритом 44
2.2. Иммунофлюоресцентные методы исследования почечного биоптата 47
2.3. Иммунохимические методы исследования сыворотки крови 48
2.3.1. Определение уровня комплемента в сыворотке крови
гемолитическим методом титрования по 50% гемолизу 48
2.3.2. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови 49
2.3.3. Определение циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови методом осаждения полиэтиленгликолем 49
2.4. Субпопуляционная характеристика мононуклеаров периферической крови 50
2.4.1. Выделение фракции мононуклеаров периферической крови в градиенте плотности фиколл-верографин 50
2.4.2. Определение субпопуляции Т-лимфоцитов в периферической крови методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) 51
2.4.3. Определение субпопуляций Т-лимфоцитов с рецепторами к Fc-фрагментам иммуноглобулинов IgG, IgM (Тр, Ту) 51
2.4.4. Определение содержания В-лимфоцитов (ЕАС-РОК) в периферической крови 52
2.5. Изучение функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов 53
2.5.1. Лизосомалъно-катионный тест 53
2.5.2. Субпопуляционная характеристика нейтрофильных гранулоцитов периферической крови 54
2.5.2.1.Выделение суспензии лейкоцитов из периферической крови 54
2.5.2.2. Определение уровня экспрессии рецепторов к СЗЬ-компоненту комплемента на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови 55
2.5.2.3. Определение нейтрофильных гранулоцитов с рецепторами к эритроцитам барана (Е+-рецептор)
и к Fc-фрагменту IgG (Fсу-рецептор) 56
2.6 Статистическая обработка результатов 57
CLASS 3. Результаты исследования 5 CLASS 8
3.1. Показатели лизосомально-катионного теста нейтрофильных гранулоцитов и уровень экспрессии Е+-, СЗЬ+- и Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных хроническим гломерулонефритом и у здоровых доноров 58
3.2. Корреляционная взаимосвязь активности нейтрофильных гранулоцитов и уровня иммунохимических показателей сыворотки крови и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у больных с изученными формами хронического
гломерулонефрита 65
3.3 Корреляции уровня функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов при хроническом гломерулонефрите у человека с показателями функционального состояния почек и биохимического состава крови 71
3.3.1 Корреляции количества и степени функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов у пациентов с хроническим гломерулонефритом с уровнем протеинурии, лейкоцитурии и эритроцитурии 72
3.3.2. Корреляционные зависимости показателей функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, скорости клубочковой фильтрации иуровнем суточной протеинурии 75
3.3.3. Корреляции функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови с определенными изменениями биохимических показателей сыворотки крови у больных с МПГН1 типа, IgA-нефропатией и МезПГН. 81
4. Обсуждение результатов 92
5. Выводы 104
6. Список литературы 106
- Современные представления о механизмах развития хронического гломерулонефрита у человека
- Рецепторы нейтрофильных гранулоцитов при гломерулонефрите
- Условия получения образцов крови и почечной ткани у больных хроническим гломерулонефритом
- Показатели лизосомально-катионного теста нейтрофильных гранулоцитов и уровень экспрессии Е+-, СЗЬ+- и Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных хроническим гломерулонефритом и у здоровых доноров
Введение к работе
Актуальность проблемы
Гломерулонефрит - обобщенное название заболеваний почек, при котором происходит первичное вовлечение в патологический процесс клубочков с последующим поражением канальцев и интерстиция, что приводит к прогрессированию заболевания, а в итоге - к развитию хронической почечной недостаточности (Рябов СИ., 2000).
В группе заболеваний почек и мочевыводящих путей гломерулонефрит (ГН) занимает 3-4-е место, уступая по распространенности только пиелонефриту и мочекаменной болезни (Григорьев Е.А., 1988; Рябов СИ., 2000; Храйчик Д.Е., 2001; Арутюнян В.М. и соавтр., 2002). В связи с распространением хронических форм болезни, доля пациентов с ГН среди больных почечной недостаточностью, направленных на гемодиализ и трансплантацию, постоянно возрастает (Григорьев Е.А., 1988; Рябов СИ., 2000).
В настоящее время патофизиологические механизмы, ведущие к прогрессированию хронического гломерулонефрита (ХГН), принято разделять на иммунные и неиммунные - гемодинамические и метаболические. Ранее считалось, что основную роль в развитии ХГН играют иммунные комплексы и антитела к базальной мембране клубочков. Сейчас этим факторам повреждения отводят важную роль скорее в индукции процесса (Тареева И.Е., 1996). При исследовании пролиферативных форм ХГН у людей особое внимание уделяется гуморальным (системе комплемента, кининам, вазоактивным аминам, метаболитам арахидоновой кислоты) и клеточным (нейтрофилы, тромбоциты, моноциты, макрофаги, лимфоциты) медиаторам воспаления в почечной ткани (Шилов Е.М., 2000).
Известно, что нейтрофильные гранулоциты участвуют в развитии патофизиологических процессов при многих заболеваниях, высвобождая комплекс различных агентов, нарушающих нормальную деятельность клеток и разрушающих соединительную ткань (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Не является исключением и ХГН (Johnson R. et al., 1997), хотя роль нейтрофильных гранулоцитов при этой форме патологии исследовалась мало. Так как нейтрофилы являются первыми эффекторными клетками, поступающими в очаг воспаления, изучение их функциональной активности при развитии и прогрессировании пролиферативных форм ГН является актуальной задачей.
Перемещение нейтрофильных гранулоцитов из кровеносных сосудов в ткань почки - важный фактор развития многих почечных заболеваний (Segerer S. et al., 2000). Однако большинство исследований, подтверждающих активное участие нейтрофильных гранулоцитов в поражении почечной ткани, выполнено на экспериментальных моделях нефрита, патогенез которых значительно отличается от патогенеза первичных ХГН у человека. В этих исследованиях обнаружено, что динамика развития клинико-морфологического синдрома связана с количеством и активностью нейтрофильных гранулоцитов, инфильтрирующих почечную ткань (Linas S.L. et al., 1995; Huang X.R. et al., 1997).
Полученные на экспериментальных моделях данные свидетельствуют о том, что нейтрофилы привлекаются в почечную ткань иммунными комплексами и различными медиаторами воспаления (Noris М., Remuzzi G.G., 1995; Donovan K.L., et al., 1995; Kitching A.R. et al., 2002). Активную роль при поступлении нейтрофилов в ткань играют различные адгезионные молекулы, экспрессирующиеся как на нейтрофильных гранулоцитах так и на эндотелии капилляров почечного клубочка (Tipping P.G. et al., 1994; Lefkowith J.B., 1997; Lai К. N., 2002).
В настоящей работе проведено исследование функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови пациентов, страдающих ХГН, а именно IgA-нефропатией, мезангиально-пролиферативным гломерулонефритом (МезПГН) и с мембранозно-пролиферативным гломерулонефритом 1 типа (МПГН 1 типа). Исследованы изменения уровня экспрессии рецепторов к СЗЬ-компоненту комплемента на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных с ХГН, что позволило установить связь изменений данного показателя с изменением функций почек у пациентов с исследованными морфологическими формами пролиферативных ГН.
Известно, что рецепторы нейтрофильных гранулоцитов к СЗЬ-компоненту комплемента (Мас-1) функционально связаны с экспрессируемыми на мембране этих же клеток Fcy-рецепторами (Tang Т. et al., 1997), которые участвуют в утилизации отложившихся в почечной ткани иммунных комплексов. При использовании экспериментальной модели ГН установлено, что продукция активных форм кислорода нейтрофильными гранулоцитами инициируется через активацию Fcy-рецепторов (Suzuki Y. et al., 2003). Исследования изменения уровня экспрессии Fcy-рецепторов на мембране нейтрофилов периферической крови при ХГН у человека не проводились.
Попадая в почечную ткань и принимая участие в реализации защитных функций (Westerhuis R. et al., 2000), нейтрофильные гранулоциты могут поражать инфильтрируемую ткань, в результате высвобождения свободных кислородных радикалов (Poelstra К. et al., 1990; Baund L. et al., 1992; Shah S.V., 1995), или участия неокислительных механизмов (Matzner Y. et al., 1985; Lehrer R.I. et al., 1993; Janoff A. 1985). Катионные белки и пептиды (КБ), к которым относятся дефенсины, лизоцим, эластаза, катепсин G, лактоферрин, миелопероксидаза, обеспечивают антимикробный потенциал нейтрофилов, оказывая
комплексное воздействие на структуру и обменные процессы фагоцитированных микроорганизмов и обуславливают их киллинг (Кокряков В.Н., 1999). В то же время, КБ увеличивают проницаемость стенки кровеносных сосудов (Matzner Y. et al., 1985) и даже вызывают ее повреждение (Harlan J.M., 1987; Lehrer R.I. et al., 1993). Использованный в работе лизосомально-катионный тест (ЛКТ), позволил определить уровень содержания катионных белков в нейтрофильных гранулоцитах периферической крови пациентов, который характеризует функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов.
Поскольку повреждающая роль нейтрофильных гранулоцитов при ХГН не подвергается сомнению, актуальной задачей является поиск способов снижения их негативного влияния на инфильтрируемую почечную ткань (Ward К.Р. et al., 2000; Hruby Z. et al., 2000; Stambe C. et al., 2003). Поэтому информационно значимым представляется проведение корреляционного анализа показателей функциональной активности клеток нейтрофильно-гранулоцитарного звена периферической крови при пролиферативных формах хронического гломерулонефрита у людей с другими широко используемыми иммунологическими показателями и клинико-лабораторными данными, характеризующими функциональное состояние почек, полученными при обследовании госпитализированных пациентов. До настоящего времени подобные сведения в литературе отсутствуют.
Таким образом, изучение функциональной активности нейтрофилов
при различных морфологических формах ХГН у человека с одной стороны
позволяет расширить существующие представления о
патофизиологических механизмах развития этих заболеваний, а с другой -может иметь научно-практическое значение, позволяя определять тактику лечения больного и прогнозировать динамику развития процесса.
Цель и задачи исследования
Целью работы явилось исследование значения изменений
функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов
периферической крови в развитии ХГН у больных, страдающих различными формами этого заболевания (мезангиально-пролиферативный гломерулонефрит, мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит 1 типа, IgA - нефропатия).
В задачи работы входило:
1. Исследование содержания катионных белков в нейтрофильных
гранулоцитах периферической крови у больных с IgA-нефропатией,
МезПГН, МПГН 1 типа и здоровых доноров;
Изучение уровня экспрессии Е+-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных с IgA-нефропатией, МезПГН, МПГН 1 типа и здоровых доноров;
Изучение уровня экспрессии СЗЬ+-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных с IgA-нефропатией, МезПГН, МПГН 1 типа и здоровых доноров;
Изучение уровня экспрессии Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных с IgA-нефропатией, МезПГН, МПГН 1 типа и здоровых доноров;
Исследование следующих иммунологических показателей: содержания в периферической крови пациентов различных субпопуляций лимфоцитов, уровня гемолитической активности комплемента сыворотки крови, концентрации циркулирующих иммунных комплексов и иммуноглобулинов М, G и А классов в сыворотки крови, определение наличия отложений иммуноглобулинов М, G и А классов в ткани почечных биоптатов;
Определение корреляционных взаимосвязей между исследованными в работе функциональными показателями активности нейтрофильных
гранулоцитов и данными лабораторных исследований
госпитализированных больных.
Научная новизна исследования
Проведенное исследование позволило выявить ряд особенностей
изменения функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов
периферической крови при мембранозно-пролиферативном
гломерулонефрите 1 типа, IgA-нефропатии и мезангиально-пролиферативном гломерулонефрите у людей.
Впервые для этой цели была проведена комплексная оценка уровня экспрессии Е -, СЗЬ+- и Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, а также изучение содержания катионных белков и пептидов в нейтрофильных гранулоцитах при следующих пролиферативных формах ХГН: МПГН 1 типа, IgA-нефропатия и МезПГН. Использование ЛКТ позволило получить новые данные о снижении содержания КБ в нейтрофильных гранулоцитах периферической крови при изученных формах ХГН у людей. Впервые показано значительное повышение уровня экспрессии СЗЬ+-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных с изученными формами ХГН.
Приоритетный характер носят результаты корреляционного анализа исследованных показателей и лабораторных данных, полученных при обследовании госпитализированных пациентов. Они позволили выявить существенные различия в характере защитных реакций при МПГН 1 типа, IgA-нефропатии и МезПГН. Показано, что изменения уровня экспрессии Е+-, СЗЬ+- и Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, а также содержания в них катионных белков и пептидов, коррелирует с ухудшением функции почек при МПГН 1 типа, IgA-нефропатии и МезПГН.
Теоретическая и практическая значимость работы
Представленная работа, посвященная исследованию
функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов
периферической крови при мембранозно-пролиферативном
гломерулонефрите 1 типа, IgA-нефропатии и мезангиально-пролиферативном гломерулонефрите, носит фундаментально-прикладной характер. Результаты исследования расширяют и дополняют сложившееся в настоящее время представление о роли нейтрофильных гранулоцитов в прогрессировании изученных форм хронического гломерулонефрита. Основное значение работы состоит в установлении корреляции между изученными показателями функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови с активностью МПГН 1 типа, IgA-нефропатии, МезПГН, определенного по изменению показателей, характеризующих функции почек.
Комплекс проведенных исследований, а также их корреляционный анализ, выявили ряд взаимосвязей между изменениями показателей функциональной активности и показателями, характеризующими функцию почек, позволяющих предложить новые критерии для прогнозирования течения МПГН 1 типа, IgA-нефропатии, МезПГН у людей: исследование лизосомально-катионного теста, уровня Е+-, СЗЬ+- и Fcy-рецепторов, что может быть использовано в клинической практике.
Основные положения, выносимые на защиту
1. В нейтрофильных гранулоцитах периферической крови больных мембранозно-пролиферативным гломерулонефритом 1 типа, IgA-нефропатией и мезангиально-пролиферативным гломерулонефритом снижено содержание катионных белков и повышена экспрессия СЗЬ+-рецепторов на плазматической мембране этих клеток. Интенсивность
экспрессии Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов у этих больных сохраняется в пределах нормальных величин.
Уровень экспрессии Е+-рецепторов на плазматической мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных IgA-нефропатией и МезПГН ниже соответствующего показателя у здоровых людей. У больных Mill Н 1 типа этот показатель варьирует в пределах нормы.
Выявлены изменения коэффициентов корреляции функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови с иммунохимическими показателями сыворотки крови и субпопуляционным составом лимфоцитов периферической крови.
4. Определены корреляционные зависимости между показателями
функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и ряда
показателей, характеризующих функциональное состояние почек,
позволяющие предложить ряд новых прогностически значимых критериев
прогрессирования МПГН 1 типа, IgA-нефропатии, МезПГН.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 154 источников, из них 115 — зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 14 рисунками и 7 таблицами.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ в отечественных журналах, а также в сборниках по материалам Всероссийских и Международных конференций.
Материалы работы докладывались и обсуждались на заседаниях Отдела общей патологии и патофизиологии ГУ «НИИ ЭМ РАМН» совместно с НИИ нефрологии СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова (С. Петербург) в 2003 и 2004 гг, а также на Российских и Международных научных конференциях: 1-м съезде нефрологов России (Казань, Россия, 1994), 3-м ежегодном Санкт-Петербургском нефрологическом семинаре (СПб, Россия, 1995), 33-м Congress of EDTA (Amsterdam, the Netherlands, 1996), the Second Bantao Congress (Macedonia, Skopie, 1997), Научной конференции "Актуальные проблемы внутренней медицины и стоматологии", EDTA - ERA Annual Congress (Italy, Rimini, 1998), 2-м съезде нефрологов России (Москва, Россия, 1999), 9-ой Всероссийской конференции по физиологии и патологии почек и водно-солевого обмена (СПб, Россия, 2001), 5-м Конгрессе общества иммунологов и аллергологов (Москва, Россия, 2002).
Современные представления о механизмах развития хронического гломерулонефрита у человека
Гломерулонефрит (ГН) - генетически обусловленное иммунно-опосредованное воспаление с преимущественным исходным поражением клубочков и вовлечением в патологический процесс всех почечных структур, клинически проявляющийся почечными и (или) внепочечными симптомами (Арутюнян В.М. и соавтр., 2000). Гломерулонефрит доминирует в ряду паренхиматозных заболеваний почек, составляет 36-38% в группе нефрологических заболеваний (Арутюнян В.М. и соавтр., 2000).
Хронический гломерулонефрит (ХГН) - заболевание, характеризующееся неуклонным прогрессированием; начавшись, процесс постепенно приводит к склерозированию почечной ткани (Тареева И.Е., 1988). Случаи выздоровления больных при этом заболевании редки. Кроме того, даже острый ГН у половины больных не проходит бесследно и после периода кажущегося выздоровления, иногда многолетнего, может привести к функциональному нарушению почек и, соответственно, уремии (Тареева И.Е., 1988).
Причины, приводящие к возникновению гломерулонефрита, до настоящего времени остаются недостаточно изученными. В конце 50-х и начале 60-х годов 20-го века F.J.Dixon (1961) предложил два возможных механизма развития гломерулонефрита: 1) зависимый от антител и 2) иммунных комплексов. Для обоснования этих представлений F.G.Dixon использовал свои данные и данные, полученные другими авторами, в результате исследований нефротоксического нефрита (НТН) и изучения сывороточной болезни. При анализе с помощью световой микроскопии срезов почек, полученных у животных с вызванным НТН, в первый день наблюдений в почечной ткани выявлялась инфильтрация полиморфноядерными лейкоцитами (нейтрофильными гранулоцитами), которая в последствии сменялась лимфоидной. Эти данные трактовались авторами как показатели развития воспалительного процесса, протекающего в результате отложений иммунных комплексов (ИК) и активации системы комплемента по классическому или альтернативному пути. Лимфоидная инфильтрация объяснялась притоком В-лимфоцитов, которые дифференцировались в плазмоциты, и начинали синтезировать антитела к гломерулярной базальной мембране (ГБМ) in situ, переводя процесс поражения почек в аутоиммунную стадию (Альбини Б. и соавтр., 1982).
В результате проведенных исследований гломерулонефрит был отнесен к разряду аутоиммунных болезней. Полиморфноядерные лейкоциты стали рассматриваться, как важнейшая клеточная система, участвующая в повреждении почечной ткани при иммунокомплекснои или аутоиммунной патологиях, которая развивается в результате адгезии нейтрофильных гранулоцитов к поверхности, несущей эти комплексы, и экзоцитоза нейтрофильных гранул (Theofilopoulos A.N., Dixon F.J., 1979).
Несмотря на достижения современной биологической и медицинской науки, представления о механизме формирования ХГН в настоящее время не претерпели серьезных изменений. Сформировались представления о том, что первичными иммунными механизмами при развитии гломерулонефрита являются или локальное (in situ) взаимодействие антител с антигенами внутри клубочков, или связывание антител с растворимыми антигенами в циркуляции и последующим отложением иммунных комплексов внутри клубочков. Клетки иммунной системы также участвуют в процессе первичного поражения клубочков. Иммунные комплексы повреждают ткань почек, активируя многочисленные взаимодействующие между собой системы медиаторов воспаления: гуморальные (система комплемента, коагуляции, кининов, вазоактивных аминов, метаболитов арахидоновой кислоты) и клеточные (нейтрофилы, тромбоциты, моноциты, макрофаги, лимфоциты). По современным представлениям, среди клеточных медиаторов иммунного повреждения основная роль принадлежит нейтрофилам и тромбоцитам. Необходимо подчеркнуть, что основные сведения по механизму развития иммунокомплексного нефрита были получены при изучении экспериментальных моделей сывороточной болезни (Шилов Е.М., 2000).
Патогенез хронического гломерулонефрита до настоящего времени окончательно не расшифрован. Б.И.Шулутко предлагает рассматривать гломерулонефрит как генетически обусловленное заболевание. Автор также предполагает, что ХГН человека является полигенным заболеванием (Шулутко Б.И., 2002) и предлагает рассматривать гломерулонефрит, как инициальное заболевание сосудистой сети почек (Шулутко Б.И., 2004). Н.А. Мухин указывает на то, что ХГН представляет собой результат проявления индивидуальной реакции на тот или иной фактор и "...поэтому, неудивительна известная ситуация, когда одна и та же причина может вызвать разные клинико-морфологические варианты нефрита, и наоборот -один и тот же клинико-морфологический вариант нефрита может быть связан с разными этиологическими факторами." (Мухин Н.А., 2000). В литературе также имеется предположение о "...генетической неполноценности Т-клеточного звена иммунитета, что в конечном итоге приводит к нарушению процессов репарации отдельных частей нефрона с дальнейшим изменением их антигенной структуры и образования иммунных комплексов." (Рябов СИ., 2000).
Рецепторы нейтрофильных гранулоцитов при гломерулонефрите
Под влиянием определенных медиаторов воспаления значительно увеличивается способность эндотелия сосудов пропускать мигрирующие лейкоциты.
Лейкоцитарная инфильтрация при воспалении - стадийный процесс, разделяющийся для отдельной клетки на 3 этапа:
1. Краевое стояние лейкоцитов или маргинация, при которой эти клетки выходят из осевого кровотока и двигаются вдоль эндотелия (англ. rolling), затем прикрепляются к эндотелию и выстилают его изнутри (англ. pavementing).
2. Диапедез или проникновение лейкоцитов через стенку сосудов, которое занимает около 4 минут, начиная с момента остановки клетки у эндотелия. Все виды лейкоцитов способны к активному диапедезу. При этом нейтрофильные гранулоциты и моноциты проникают через межэндотелиальные щели амебоидным способом, выпуская псевдоподии. Этот процесс не сопровождается существенной экстравазацией жидкости, но требует от клетки больших энергозатрат. При преодолении базальной мембраны могут иметь значение лизосомальные коллагеназа и эластаза лейкоцитов. Пассивному диапедезу вместе с лейкоцитами может подвергаться некоторое количество эритроцитов. 3. Движение лейкоцитов к центру воспалительного очага происходит в результате хемотаксиса и рассматривается как первая фаза фагоцитоза.
Основным механизмом миграции лейкоцитов являются комплементарные лиганд-рецепторные взаимодействия между лейкоцитами и сосудистой стенкой, причем экспрессия рецепторов на взаимодействующих поверхностях индуцируется медиаторами воспаления. До клеточной активации молекулы адгезии располагаются во внутриклеточных гранулах и не функционируют. Часть из них распознает свои лиганды только после того, как первичная альтерация и/или медиаторы воспаления вызовут в последних конформационные изменения. При воспалении ряд медиаторов (фрагменты комплемент С5а и Вь; лейкотриен В4; фактор активации тромбоцитов; трансферрин; цитокины: ИЛ-1, ИЛ-8, у-интерферон, ФНО-а и ФНО-Р; пептидные хемотаксические факторы: мастоцитарные факторы хемотаксиса нейтрофилов, эозинофилов и базофилов, а также сами липополисахариды бактерий) вызывают высвобождение молекул адгезии и их лигандов из гранул, конформационные изменения, благоприятствующие их комплементарным взаимодействиям и, позже, синтез молекул de novo. При этом часть медиаторов индуцирует повышение адгезивных свойств только у лейкоцитов (лейкотриен В4 - на нейтрофилах, факторы комплемента - на полиморфонуклеарах и моноцитах), часть действует только на эндотелий (ИЛ-1, эндотоксин бактерий), а большинство стимулирует и адгезивность лейкоцитов, и эндотелия (ФНО-а и -(3). Большинство медиаторов-усилителей адгезивных свойств - синтезируется лимфоцитами и макрофагами, но и сам эндотелий, под влиянием липополисахаридов бактерий, тромбина и ФНО, способен вырабатывать, например, ИЛ-1 (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 1999).
Селектины опосредуют самую раннию стадию маргинации лейкоцитов - обратимую адгезию. Важным шагом в реализации процесса активации нейтрофильных гранулоцитов в очаге воспаления является его способность прикрепляться к поверхности эндотелия. Этот процесс осуществляется благодаря экспрессии на мембране эндотелиоцитов специальных адгезионных молекул, таких как Е-селектины, посредством которых нейтрофильный гранулоцит может закрепиться на эндотелиальном монослое, что и обеспечивает приток нейтрофилов в места воспаления (Bevilacqua М.Р. et al., 1988). Взаимодействие лейкоцитов с поверхностью эндотелия с участием селектинов приводит к тому, что лейкоциты покидают осевой кровоток, претерпевают краевое движение и краевое стояние. Так, при экспериментальном ГН у мышей возможно накопление нейтрофильных гранулоцитов в почечной ткани независимо от комплемента, а только благодаря Р-селектину (Tipping P.G. et al., 1994), который участвует в адгезии нейтрофильных гранулоцитов и тромбоцитов на эндотелии капилляров клубочков. Активную роль Р-селектина в инфильтрации гломерулы при экспериментальном гломерулонефрите подтверждают и другие авторы, которые наблюдали снижение нейтрофильной инфильтрации при использовании антител против Р-селектина (Zachem C.R. et al., 1997; Ito I. et al., 2001). Тем не менее, в литературе имеются данные об отсутствие эффекта синтетических блокаторов Р-селектина и L-селектина на адгезию нейтрофилов к эндотелию почечного клубочка при анти-ГБМ-гломерулонефрите у крыс (De Vriese A.S. et al., 1999). Кроме того, у мышей, нокаутных по гену Р-селектина, развивается более агрессивный гломерулонефрит с повышением клубочковой нейтрофильной аккумуляции (Mayadas T.N. et al., 1996; Rosenkranz A.R. et al., 1999). Однако эти Р-селектин нокаутные мыши демонстрируют более высокий уровень нейтрофилии и дефицит растворимой формы Р-селектина, который, как было показано, приводит к подавлению прикрепления нейтрофилов (Gamble J.R. et al., 1990).
Lai K.N. и соавтр. (1994) обнаружили, что уровень Е-селектина в плазме у пациентов с IgA-нефропатией даже в состоянии ремиссии значительно выше, чем у здоровых людей (Lai K.N. et al., 1994). Причем, чем выше был уровень Е-селектина в плазме, тем более выражено поражение почечной ткани у этих больных. Уровень Е-селектина в плазме также коррелировал с выраженностью протеинурии у больных IgA-нефропатией (Lai K.N. et al., 1994). Авторы предполагают, что высокий уровень Е-селектина в плазме является маркером степени интенсивности взаимодействия между активированными нейтрофилами и эндотелиоцитами при воспалительных процессах, что может привести к прогрессированию почечных поражений через высвобождение свободных кислородных радикалов нейтрофильными гранулоцитами (Lai K.N., 2002).
Условия получения образцов крови и почечной ткани у больных хроническим гломерулонефритом
В работе исследованы венозная кровь и почечная ткань 56 больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и венозная кровь 12 практически здоровых доноров. Все пациенты проходили обследование и лечение в нефрологических отделениях №1 и №2 клиники пропедевтики внутренних болезней СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова. Исследованых пациентов разделили на три группы согласно морфологическим формам ХГН, диагноз которых основывался на результатах морфологического исследования почечной ткани.
Первая группа (21 чел.) состояла из больных с мезангиопролиферативным ГН (МезПГН). Для МезПГН характерно расширение мезангия, связанное, прежде всего, с пролиферацией мезангиальных клеток. Она сопровождается очаговым накоплением мезангиального матрикса, очаговым утолщением базальных мембран в участках капиллярной стенки, прилежащих к мезангию. Иммуногистохимически в стенках капилляров и мезангии определяют отложения иммуноглобулинов и комплемента. Эти отложения комковатые или очагово-линейные. При электронно-микроскопическом исследовании отложения электронно-плотного материала находят в мезангии и под эндотелием; мезангиальные клетки активны, их количество увеличено. Изменение эндотелия и подоцитов не имеет каких-либо характерных черт (Серов В.В. и соавтр., 2000; Храйчик Д.Е., 2001).
Следующая группа (15 чел.) представлена пациентами с IgA-нефропатией. МезПГН, клинически проявляющийся возвратной гематурией и характеризующийся отложениями IgA в мезангии капилляров клубочков, J. Berger (1968) выделил в относительно самостоятельную форму - IgA-нефропатию, которая стала именоваться болезнью Берже. Структура отложений IgA при иммуногистохимичеком исследовании может быть гомогенной, иногда нежно-гранулярной или кляксоподобной. Электронно-микроскопически выявляют отложение электронно-плотного материала в мезангии, обычно под гломерулярной базальной мембраной (ГБМ), реже внутри мезангиального матрикса, изредка на периферии капиллярных петель, но, как правило, ближе к мезангию (Серов В.В. и соавтр., 2000; Храйчик Д.Е., 2001).
Третья группа (20 чел.) состояла из пациентов с мембранопролиферативным (мезангиокапиллярном) ГН I типа (МПГН 1 типа). При МПГН 1 типа наряду с выраженной пролиферацией мезангиальных клеток наблюдается неравномерное диффузное утолщение стенок капилляров. При проведении ШИК-реакции и серебрении срезов выявляют диффузную двухконтурность ГБМ капилляров клубочка, которая служит важным диагностическим признаком этого варианта ХГН. В патологический процесс вовлекаются все клубочки, они увеличены, сосудистый пучок имеет дольчатое строение, просветы капилляров сужены, в них иногда обнаруживаются полиморфноядерные лейкоциты. Иногда встречаются полулуния, синехии сосудистых долек с капсулой клубочка. При иммуногистохимическом исследовании в капиллярах клубочка находят отложения IgG и СЗ, иногда IgM и IgA, фибрин. Может определятся только СЗ или другие компоненты комплемента. Иммуноглобулины и комплемент распределены в виде гирлянд или лент по периферии капилляров, иногда имеют вид гранул (Серов В.В. и соавтр., 1983). На основании электронно-микроскопического исследования выделено три типа МПГН. Первый - МПГН с субэндотелиальными отложениями электронно-плотного материала. С отложениями иммунных комплексов под эндотелием в таких случаях сочетаются гиперплазия и интерпозиция мезангия, обусловливающие феномен двухконтурности ГБМ капилляров; собственно ГБМ капилляров клубочков при этом не изменены (Серов В.В. и соавтр., 2000; Храйчик Д.Е., 2001).
У всех обследованных больных функция почек была сохранная. Обследование проведено до начала патогенетической терапии. Всем больным для установления диагноза ХГН была проведена прижизненная нефробиопсия. Морфологическое исследование ткани нефробиоптата выполняли с помощью световой, иммунофлюоресцентной и электронной микроскопий. Анализ срезов ткани почки на световом уровне выполнила с.н.с. Клемина И.К., а электронно-микроскопическое исследование ткани нефробиоптата провела с.н.с. Титова В.А.. Забор крови производили из локтевой вены в стандартных условиях (утром, натощак), в сроки, максимально приближенные к нефробиопсии. Иммунофлюоресцентное исследование нефробиоптата и некоторые иммунологические исследования были проведены в лаборатории клинической иммунологии и морфологии НИО НИИ нефрологии. Изучение морфо-функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов периферической крови было осуществлено на базе Отдела общей патологии и патофизиологии ГУ «НИИ ЭМ РАМН».
Морфологически у 20 обследованных был выявлен мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит I типа (Mill Н I т) (подтвержден электронно-микроскопическим исследованием), у 15 - IgA-нефропатия (на основании наличия отложений IgA, Х- и к-легких цепей иммуноглобулинов в свежезамороженных срезах почечного биоптата) и у 21 пациента был выставлен Мезангиально-пролиферативный гломерулонефрит (МезПГН).
Показатели лизосомально-катионного теста нейтрофильных гранулоцитов и уровень экспрессии Е+-, СЗЬ+- и Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных хроническим гломерулонефритом и у здоровых доноров
У здоровых людей среднее значение и ошибка среднего цитохимического коэффициента лизосомально-катионного теста, характеризующего содержание катионных белков в нейтрофильных гранулоцитах периферической крови, составляло 1,47 ± 0,020. Максимальное значение цитохимического показателя ЛКТ у здоровых доноров - 1,58, минимальное -1,31.
У пациентов всех трех изученных морфологических формах ХГН выявлено снижение показателей ЛКТ по сравнению с теми же показателями у здоровых людей (Рис. 1). Показатели ЛКТ у больных с МПГН Ітипа, IgA-нефропатией и МезПГН не различались. Средние значения, ошибки среднего, минимальные и максимальные значения у обследованных пациентов были следующими: при МезПГН - 1,03 ± 0,044 (0,70 - 1,38); при IgA-нефропатии - 0,92 ± 0,070 (0,37 - 1,37); при МПГН 1 типа — 1,01 ± 0,055 (0,66 - 1,50).
При изучении уровня экспрессии Е+-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови получены данные, представленные на рис. 2. У здоровых людей относительное количество нейтрофильных гранулоцитов, экспрессирующих на своей мембране рецепторы к эритроцитам барана, колебалось от 29% до 58%. Среднее значение и ошибка среднего в группе здоровых людей составляла 39,8 ± 2,33 %.
Относительное количество нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, экспрессирующих на своей мембране рецепторы к эритроцитам барана, у больных с IgA-нефропатией составляло 19,6 ± 2,60 %, (выявленное минимальное значение - 7%, а максимальное - 48%) и было снижено по сравнению с их количеством у здоровых доноров. У больных с МезПГН этот показатель был также снижен по сравнению с показателем уровня экспрессии Е+-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов здоровых людей и составлял соответственно
- 28,9 ± 3,10% (минимальное значение - 10%, максимальное - 51). Снижения экспрессии Е+-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов не наблюдалось у больных с МПГН I типа, среднее значение и ошибка среднего относительного содержания нейтрофилов, экспрессирующих Е+-рецепторы, у этих пациентов составляли 34,7 ± 3,85% (минимальное значение - 6%, максимальное - 65%). Кроме того, установлено снижение экспрессии рецепторов к эритроцитам барана на мембране нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у больных с IgA-нефропатией по сравнению с больными с МезПГН и МПГН 1 типа. Обращает на себя внимание также более широкое варьирование величин исследованного показателя у больных с ХГН по сравнению с теми же показателями у здоровых людей.
Среднее относительное количество нейтрофильных гранулоцитов, несущих на своей мембране рецепторы к комплементу у пациентов с ХГН, превышало нормальные величины (8,1 ± 1,62%; минимальное значение -1%, максимальное - 19%) (Рис. 3). Между данными больных с исследованными морфологическими формами ХГН различий не было выявлено. Средние значения, ошибка среднего значения, минимальные и максимальные значения у больных ХГН соответственно составляли: у больных МезПГН - 18,9 ± 2,86%, (0 - 44); у пациентов с IgA-нефропатией - 19,6 ± 4,25%, (2 - 64); у пациентов с МПГН 1 типа - 16,8 ± 2,49%, (2 51). Обращает внимание на себя широкий размах колебаний уровня экспрессии этого рецептора у больных ХГН по сравнению с тем же показателем у здоровых людей.
Интенсивность экспрессии Fcy-рецепторов на мембране нейтрофильных гранулоцитов у больных с исследованными формами ХГН не отличалась от нормальных величин (Рис.4). Средние значения, ошибки среднего значения, минимальные и максимальные значения относительного содержания нейтрофилов периферической крови, несущих на своей мембране Fcy-рецепторы, соответственно составляли: в группе здоровых людей - 13,6 ± 2,84%, (0 - 34); у больных с МезПГН - 15,5 ± 2,36%, (1 - 51); у пациентов с IgA-нефропатией - 16,1 ± 2,64%, (0 - 31); у больных с МПГН 1 типа - 13,6 ± 2,62%, (1 - 46).
Таким образом, установлено, что при всех трех исследованных морфологических формах ХГН выявлено выраженное снижение СЦП ЛКТ. Снижение уровня экспрессии рецепторов к эритроцитам барана наблюдается только у пациентов с МезПГН и IgA-нефропатией, причем у больных с IgA-нефропатией это снижение более выражено. При МПГН 1 типа, IgA-нефропатии и МезПГН относительное содержание в периферической крови нейтрофильных гранулоцитов, экспрессирующих на своей мембране СЗЬ+-рецепторы, превышало нормальные величины. Интенсивность экспрессии Fcy-рецепторов на мембране циркулирующих нейтрофилов при изученных формах ХГН не отличалась от нормальных величин.
