Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные взгляды на процессы метаболизма железа и его регуляции, причины развития, диагностику и лечение дефицита железа у детей и подростков (обзор литературы) 18
1.1. Биологическая роль железа 18
1.2. Распределение железа в организме 20
1.3. Регуляция гомеостаза и передвижения железа 22
1.3.1. Регуляция абсорбции железа в кишечнике 23
1.3.2. Регуляция возвращения железа в рециркуляцию... 27
1.3.3. Регуляция передвижения железа (феррокинетика) и характеристика железорегулирующих белков 28
1.4. Причины дефицита железа у детей и подростков 38
1.4.1. Причины дефицита железа в раннем возрасте . 38
1.4.2. Запасы железа 41
1.4.3. Причины дефицита железа у подростков 42
1.5. Лабораторные маркеры дефицита железа 45
1.5.1. Общий анализ крови 46
1.5.2. Биохимические маркеры дефицита железа 47
1.5.3. Другие методы диагностики дефицита железа . 49
1.6. Дифференциальный диагноз железодефицитных состояний 50
1.7. Коррекция дефицита железа 52
1.7.1. Диетическая коррекция дефицита железа 52
1.7.2. Медикаментозная коррекция дефицита железа . 54
1.7.3. Профилактика дефицита железа 59
Глава 2. Материалы и методы исследования 62
2.1. Организация исследования и общая характеристика работы 62
2.2. Характеристика материала для исследования 64
2.3. Методики обследования и методы исследования 65
2.3.1. Анализ гемограммы 65
2.3.2. Методы определения показателей метаболизма железа, факторов гемопоэза, уровня цитокинов ... 68
2.3.3.Методы определения показателей окислительного стресса 71
2.3.4.Методики оценки речевых навыков, психомоторного развития, когнитивных функций у детей и подростков 73
2.4. Статистическая обработка результатов 74
Глава 3. Метаболизм железа и его регуляция в период антенатального развития 75
3.1. Метаболизм железа и его регуляция у здоровых плодов в период раннего онтогенетического развития 77
3.2. Метаболизм железа и его регуляция у плодов с инфекционно-воспалительными заболеваниями 95
Глава 4. Показатели метаболизма железа у здоровых детей и подростков 107
4.1. Показатели метаболизма железа у здоровых детей раннего возраста 107
4.2. Показатели метаболизма железа у здоровых подростков 110
Глава 5. Причины развития дефицита железа у детей и подростков 117
5.1. Причины дефицита железа у детей раннего возраста 118
5.1.1. Причины железодефицитных состояний у детей раннего возраста, живущих в семейном окружении 118
5.1.2. Причины развития дефицита железа у детей раннего возраста, оставшихся с рождения без опеки родителей 125
5.1.3. Причины развития дефицита железа у детей раннего возраста, находящихся в доме ребенка Учреждения ГУИН г. Можайска 130
5.2. Причины развития дефицита железа у подростков 138
5.2.1. Причины железодефицитных состояний у подростков, живущих в семейном окружении 138
5.2.2. Причины развития дефицита железа у мальчиков-подростков, находящихся вне семейного окружения 148
Глава 6. Метаболизм железа при железодефицитных состояниях и анемии, ассоциированной с инфекционно-воспалительными заболеваниями 154
6.1. Показатели метаболизма железа у детей и подростков при железодефицитных состояниях 155
6.2. Показатели метаболизма железа при инфекционно-воспалительных заболеваниях у детей и подростков 165
Глава 7. Показатели метаболизма железа при проведении ферротерапии 175
7.1. Общие принципы ферротерапии 175
7.2. Показатели метаболизма железа при проведении ферротерапии 179
7.2.1. Оценка эффективности лечения 191
Заключение 194
Выводы 214
Практические рекомендации 217
Приложение 220
Список литературы 221
- Регуляция абсорбции железа в кишечнике
- Методы определения показателей метаболизма железа, факторов гемопоэза, уровня цитокинов
- Метаболизм железа и его регуляция у здоровых плодов в период раннего онтогенетического развития
- Показатели метаболизма железа у здоровых детей раннего возраста
Введение к работе
Актуальность проблемы. Железодефицитные состояния (ЖДС) до сих пор остаются одной из актуальнейших проблем здравоохранения во всем мире в связи с их широкой распространенностью, особенно среди грудных детей, подростков, менструирующих женщин, которые и составляют группы высокого риска по развитию дефицита железа (ДЖ). Согласно данным ВОЗ, у каждого 5-6 жителя нашей планеты выявляется ДЖ той или иной степени выраженности (299, 315). В России у 30-75% детей различного возраста регистрируются ЖДС, причем в 10-38% случаев - в форме желсзодефицитной анемии (ЖДА) (7, 8, 27, 28, 31, 55). В Москве за последние 10 лет показатель заболеваемости ЖДА среди детей раннего возраста увеличился почти в 3 раза, составляя 8,2-10,4% (79, 80, 81). Столь высокая распространенность ЖДС в России обусловлена современными социально-экономическими условиями, приведшими к ухудшению материального состояния семей, что отразилось на количественной и, особенно, качественной характеристике питания (7, 87, 88, 92). У детей раннего возраста развитие ДЖ связано, в основном, именно с алиментарным фактором (39, 40, 44, 45, 69), а у подростков - с пубертатным спуртом, редуцированными диетами, хроническими заболеваниями, на фоне чего у девушек наступают менархе, регистрируются нарушения менструальной функции (10, 23, 26, 37, 38, 43), в то время как у юношей происходит стремительное нарастание мышечной массы (46, 47, 49, 72, 75, 291, 297, 300).
Дефицит железа возникает в результате длительно существующего отрицательного баланса железа, причинами которого являются либо его недостаточное поступление в организм, либо его повышенное расходование, иногда - сочетание обеих причин. Железо - незаменимый микроэлемент, присущий всему живому на земле, оно участвует в осуществлении основных функций жизнеобеспечения. Это, прежде всего, продуцирование железосодержащих молекул (гемоглобин, миоглобин и др.) и нормальное
функционирование железо-зависимых реакций (участвующих в продукции интерлейкинов, Т-киллеров, Т-супрессоров^ металлоферментов, поддержании прооксидантно-антиоксидатного баланса и т.д.). Запасы железа, являются; буфером^ предохраняющим организм от развития ДЖ при различных неблагоприятных ситуациях.
Становится очевидным, что ДЖ оказывает системное влияние на
жизненно-важные функции организма, особенно в критические периоды
роста и умственного развития: У детей раннего возраста это проявляется
задержкой психомоторного развития (запаздывание речевых навыков;
нарушения: координации движения, изменение поведенческих реакций и др.),
у подростков; - нарушениями когнитивных функций и умственных
способностей (снижение памяти, концентрации внимания и мотивации
обучения, эмоциональная лабильность, повышение уровня тревожности и
др.), у взрослых - ухудшением качества жизни (недостаточная жизненная
активность и апатия, отсутствие мотивации в достижении цели, низкая-
самооценка и др.) (131, 174, 192, 193, 194, 218, 219; 220, 221, 224, 230, 233),
Следует отметить, что во многих даже высоко развитых странах, где рацион
кормящих женщин содержит достаточное количество железа, у 4-6%
младенцев всё равно развивается ДЖ (141', 142), среди девочек-подростков
частота ЖДС достигает 13-14%, среди юношей -3-4% .'(4'6; 47, 50,.87, 291).
После лечения ферропрепаратами (ФП) и восполнения депо железа,
нарушенные функции быстро восстанавливаются, однако у части детей
последствия ДЖ могут сохраняться в; течение длительного времени и даже
пожизненно (219, 224, 227). ВОЗ придает этой проблеме глобальное значение
и требует всеобщего внимания, и действий, направленных на борьбу с
нехваткой железа (300; 315, 320). :
В то же время у нас в стране, несмотря напроведение диспансеризации детского населения и повсеместное внедрение лабораторных тестов^ оценивающих показатели обмена железа, многие аспекты патогенеза, диагностики, последствий и возможностей лечения ЖДС остаются
недостаточно изученными с позиций современной науки и практики. Не всегда четко понимается роль нарушений метаболизма железа при инфекционно-воспалительных заболеваниях (ИВЗ). С клинических позиций это серьезно тормозит понимание сущности патофизиологических процессов при ЖДА и анемии, ассоциированной с ИВЗ, мешает разработке и внедрению в широкую практику доказательных лабораторных маркеров ДЖ, препятствует выработке современных протоколов диагностики, лечения и профилактики ЖДС.
Решение указанных вопросов представляется необходимым, поскольку позволит обосновать новые современные подходы к диагностике железодефицитных состояний, разработать адекватную и наиболее оптимальную лечебную тактику, что будет способствовать снижению риска развития тяжелых последствий дефицита железа у детей и подростков.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось
установление возрастных особенностей метаболизма железа и состояния факторов гемопоэза в норме и при патологии, включая антенатальный период, и совершенствование лабораторно-клинической диагностики его нарушений для обоснования методов эффективного лечения и разработки оптимальных схем профилактики ЖДС на современном этапе.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
Изучить на протяжении раннего онтогенеза особенности становления метаболизма железа и факторов гемопоэза в сопоставлении с периодами развития плода и возрастом гестации.
Определить значения основных провоспалительных и противовоспалительных цитокинов у плодов в зависимости от гестационного возраста и этиологии инфекционно-воспалительных заболеваний.
3. Уточнить основные причины развития ЖДС у детей и подростков; находящихся в различных социальных' сегментах современного общества.
4: Оценить, состояние метаболизма железа на основании' современных
лабораторных тестов (уровни ферритина сыворотки; ферритина-
эритроцитов; растворимого трансферринового рецептора.,
эритропоэтина, гепсидина и др. показателей) в зависимости3 от стадии дефицита железа.
Провести сравнительный анализ „различных параметров^ оценивающих железный статус и состояние факторов; эритропоэза, при; острых инфекционных; заболеваниях и: хронических воспалительных процессах.
Обосновать на основании; полученных данных оптимальную тактику лечения и профилактики ЖЖС у детей'и подростков с учетом^ степени выраженности дефицита железа.
Научная новизна исследования:
Впервые в* мировой; практике на основании комплексного изучения содержания железосодержащих (ЩФ и; КФ) и железорегулирующих (Тф, рТфР, ЭПО; гепсидищ ЭФ) протеинов: и факторов гемопоэза (В 12, Фол) прослежены процессы, становления метаболизма железа в раннем онтогенезе, в, сопоставлении с. периодами развития и гестационным' возрастом (FB) плода. Для стадии эмбриогенеза и раннего фетогенеза характерны высокие значения ЩФ и КФ (1298 и 300 мкг/г белка соответственно);; ЭПО (321,5 мкЕД/г белка) и рТфР (10;6 мг/г белка), что указывает на эссенциальность железа и его непосредственное участие в пролиферативных и пластических процессах, органогенезе,, формировании структур ЦНС Обнаружена тесная взаимосвязь между уровнями ЩФ и рТфР (г=0,8824, р<0,00001), с «пиками» подъема на 7-11 нед (2265,0 мкг/г белка и 15,7 мг/г белка соответственно) и на 12г15 нед (1511,0 мкг/г белка и 12,0 мг/г белка), что позволяет
рассматривать ЩФ и рТфР в качестве индикаторов интенсивности пролиферативных процессов и важных прогностических факторов нарушений внутриутробного развития плода.
Установлено, что в тканях плодов уже на 5 нед содержание железа-достаточно высоко (16,3 мкг/г белка), а пик его накопления регистрируется между 35-й и 40-й нед гестации (35,9 мкмоль/л), при этом существует прямая корреляция, между уровнем железа и ГВ (г=0,9398, р<0,0001), а после 19-й нед - между железом и Тф (г=0,8827, р<0,0001). Определены значения витаминов В12 и фолатов и показано, что их содержание в течение всего антенатального периода остается стабильным (г=0,5328, р<0,0007), позволяя' плоду поддерживать синтетические процессы на неизменном уровне.
Впервые у развивающихся плодов,и новорожденных детей определены значения ЭФ и установлена его тесная корреляциях уровнем ЭПО (г=0,9691, р<0,0001), что. дает ценные сведения* об» эффективности эритропоэза и помогает в" оценке степени гипоксии.
Впервые в раннем онтогенезе исследовано содержание гепсидина, установившее его низкие значения* (22,4-27,4 пг) вне зависимости от ГВ, что позволяет плоду постоянно рекрутировать железо на протяжении всего внутриутробного развития.
Выявлена высокая событийная вероятность динамики содержания изученных показателей в зависимости от ГВ: для железа (R =0,8554), Тф (R2=0,9393), ЩФ (R2=0,9188), рТфР (R2=0,8694), ЭПО (R2=0,8527), гепсидина (R =0,9187), фолатов (R =0,7729), что свидетельствует об общих закономерностях и соподчиненности процессов метаболизма железа В' период раннего онтогенеза.
Впервые в мировой практике в процессе внутриутробного' развития' определены значения провоспалительных цитокинов (ИЛ-6 и ФНО-ос) и установлены закономерности их синтеза - высокая экспрессия* на ранних сроках гестации (375,9 и 55,8 пг/г белка соответственно) и резкое снижение после плацентации (17,5 и 6,1 пг/г белка соответственно, р<0,001)^ что,
весьма вероятно, на первых неделях гестации обеспечивает протективный эффект плоду, а в дальнейшем - его динамичное развитие. Событийная вероятность подобного сценария весьма высока как для ИЛ-6 (R =0,8749), так и ФНО-ос (R =0,8298), о чем также свидетельствует тесная корреляция между ФНО-ос, ЩФ и рТфР (г=0,9580, р<0,0001), что может служить важным инструментом в установлении нарушений внутриутробного развития плода.
Впервые у плодов (самопроизвольных выкидышей) определены значения железорегулирующих белков (ферритин, гепсидин) и цитокинов (ИЛ-6, ФНО-ос, ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-10) в зависимости от этиологии ИВЗ, а также выявлены механизмы, способствующие поломке иммунного ответа плода. Установлено, что в условиях инфекции у плодов 19-28 нед гестации происходит повышение содержания ферритина, гепсидина, ИЛ-6 и ИЛ-2 на фоне незначительного подъема уровней ИЛ-8 и ИЛ-10, стагнации ФНО-ос, причем более выраженные изменения происходят при бактериальных и микст-инфекциях. Полученные результаты говорят об активном участии железорегулирующих белков в воспалительных реакциях, ассоциированных с системой мононуклеарных фагоцитов, и свидетельствуют о незрелости лимфоидной системы и гранулоцитопоэза, что, вероятно, приводит к неспособности плода сформировать системную воспалительную реакцию и справиться с инфекцией.
На большом клиническом материале проведено исследование параметров метаболизма железа более чем у 2600 детей и подростков из различного социума и подтверждено, что у грудных детей ДЖ, прежде всего, связан с алиментарным фактором и социальным статусом семьи.,Так, у детей из дома ребенка ГУИН, в подавляющем большинстве случаев находившихся на грудном вскармливании, была обнаружена ЖДА в 50,9% случаев, что в 5 раз превышало частоту ЖДА по Москве у детей аналогичного возраста (10,4%). Выявлена зависимость развития ЖДС у детей первого года жизни от неадекватного вскармливания, раннего введения в рацион цельного молока.
В то время как у подростков ДЖ ассоциирован с пубертатным спуртом в сочетании с хроническими заболеваниями ЖКТ, редуцированными диетами, социальным окружением, а у девушек дополнительно — с наступлением менархе, нарушениями менструальной функции.
Определены лабораторные критерии нарушений метаболизма железа, позволяющие различить истинный ДЖ от анемии на. фоне острых и хронических ИВЗ, что важно для проведения дифференциального диагноза. Показано, что характерными лабораторными маркерами ЖДС являются низкие значения ФС (<15 мкг/л) и гепсидина (<8 пг/мл), сочетающиеся с повышением ЭПО (>80 мкЕд/л) и рТфР (>7 мг/л). Для анемий, протекающих на фоне острых ИВЗ, свойственно высокое содержание ФС (>300 мкг/л), гепсидина (>150 пг/мл), ЭПО (>60 мкЕд/л) и рТфР (>5 мг/л). В то время как анемии, ассоциированные с хроническими воспалительными процессами, характеризуются высоким содержанием ФС (>500 мкг/л), гепсидина (>200 пг/мл), рТфР (>5,0 мг/л) в сочетании с низким уровнем ЭПО (<3 мкЕд/л). Показано, что анемия на фоне острых ИВЗ в большинстве случаев (81,2%) купируется самостоятельно, в отличие от анемии, ассоциированной с хроническими инфекционными процессами, при которой 20-30% пациентов нуждаются в назначении специальной корригирующей терапии.
Впервые с позиций комплексной оценки показателей антиоксидантно-прооксидантного баланса и обмена железа определена эффективность применения препаратов железа различных фармакологических групп.
Разработана схема поэтапного ведения детей с железодефицитными состояниями и дано научно-практическое обоснование оптимальной тактики лечения и профилактики в зависимости от стадии дефицита железа.
Практическая значимость работы:
Показатели метаболизма железа и цитокинов могут служить ценными прогностическими критериями в оценке нарушений внутриутробного формирования и развития плода.
Комплекс биохимических тестов оценки параметров феррокинетики, основанный на определении в сыворотке крови уровней ферритина, гепсидина, ферритина эритроцитов, растворимого трансферринового рецептора, в сочетании с рутинными методами исследования содержания железа сыворотки, ОЖСС, НТЖ рекомендуется использовать для выявления ЖДС у детей, раннего возраста и подростков, составляющих группы высокого риска по развитию дефицита железа.
Разработанная схема поэтапного ведения пациентов с дефицитом железа, включающая несколько ступеней проведения обследования с целью уточнения генеза анемии и выявления факторов-релевантов, должна стать частью стандартного протокола обследования и лечения детей и подростков с железодефицитными состояниями.
Для повышения комплаентности к терапии и эффективности лечения детей, страдающих железодефицитными состояниями, следует использовать ферропрепараты, обладающие наиболее благоприятным профилем эффективность/ безопасность, химическую основу которых составляет гидроксид-полимальтозный комплекс трехвалентного железа.
С целью повышения мер по профилактике ЖДС у детей и подростков из различного социума необходимо активное привлечение государственных, социальных и медицинских учреждений, всего современного сообщества.
Положения, выносимые на защиту:
1. Комплексное изучение показателей обмена железа и факторов гемопоэза на протяжении раннего онтогенеза установило четкие закономерности становления феррокинетики, сопоставимые с периодами развития плода, что подтверждается достоверными взаимосвязями между основными железосодержащими и железорегуляторными протеинами (между ферритином и растворимым трансферриновым рецептором, железом и трансферрином, эритропоэтином и ферритином эритроцитов), а также прямой зависимостью уровня железа от срока гестации. Это указывает на
эссенциальную роль' железа в поддержании высокой активности пролиферативных и пластических процессов в период органогенеза и позволяет использовать ферритин, гепсидин и рТфР в качестве важных прогностических показателей нарушений внутриутробного развития плода, а показатели ферритина эритроцитов и эритропоэтина - для оценки степени гипоксии.
Высокий уровень провоспалительньтх цитокинов (ИЛ-6 и ФНО-а), обнаруженный на первых неделях гестации, обеспечивает плоду нормальный эмбриогенез и ассоциирован с протективным эффектом. После плацентации происходит резкое падение содержания ИЛ-6 (более чем в 20 раз) и ФНО-а (в 5 раз), конгруэнтное по срокам со снижением уровней ферритина и рТфР, что указывает на адаптивный характер выработки провоспалительных цитокинов и его соподчиненность с процессами пролиферации в различные периоды развития плода.
Впервые показано, что особенностью обмена железа и профиля цитокинов у самопроизвольных выкидышей 19-28 нед гестации, погибших вследствие инфекций, явилось повышение содержания железорегулирующих протеинов - ферритина (в 7-40 раз) и гепсидина (в 5-50 раз), что сочеталось с повышением уровней ИЛ-6 (в 10-15 раз) и ИЛ-2 (в 15-200 раз) и сопровождалось незначительным увеличением ИЛ-8 и ИЛ-10 (в 3-10 раз). Причем эти явления были более выражены при бактериальных и микст-инфекциях, что указывает на активное участие железорегулирующих протеинов в воспалительных реакциях, ассоциированных с макрофагальной системой, и свидетельствует о незрелости у плодов системы лимфо- и гранулоцитопоэза (стагнация ФНО-а и недостаточный подъем ИЛ-8). Полученные данные позволяют рассматривать железорегулирующие белки и цитокины в качестве филогенетически древних и адаптивных механизмов, формирующих иммунный ответ и участвующих в системной воспалительной реакции плода.
4: Комплексная оценка метаболизма железа и факторов гемопоэза позволила установить, что железодефицитные состояния характеризуются в 100% случаев снижением значений ферритина и гепсидина в сочетании с повышенным содержанием ЭПО и рТфР (в 89,3% и 86,1% случаев соответственно). Обнаружение высоких уровней ферритина сыворотки и гепсидина (в 100% случаев) в сочетании с повышенным содержанием ЭПО (у 84,5% больных) и рТфР (в 87,9% случаев) присуще для анемий, ассоциированных с острыми инфекционно-воспалительными заболеваниями, в то время как анемии, сопряженные с хроническими воспалительными процессами, характеризуются высоким содержанием ферритина сыворотки (в 100% случаев), гепсидина (у 100% больных), рТфР (у 80,8% детей), в сочетании с низкими значениями ЭПО (в 100% случаев). Полученные данные позволяют рассматривать эти показатели в качестве дифференциально-диагностических лабораторных тестов для верификации диагноза и определения тактики лечения пациентов, что делает перспективными дальнейшие научные исследования этого направления.
Апробация работы. Состоялась на научно-практической конференции кафедры детских болезней №1 ГОУ ВПО РГМУ совместно с сотрудниками клинических отделений Морозовской ДГКБ .и Российской ДКБ, научными сотрудниками Гематологического научного центра РАМН (Москва, апрель 2008 года).
Публикации и выступления. По теме диссертации опубликовано 65 научных работ, из них 22 — в центральной печати.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на V Международном конгрессе «Иммунореабилитация и иммунопрофилактика в медицине» (Тенерифе-1999), II Международном конгрессе педиатров (Иерусалим-2000), VI и VII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва-1999; Москва-2000), VII конгрессе и IX съезде педиатров
России (Москва-2003; Москва-2004), III конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии (Москва-2005), Российском форуме «Мать и дитя» (Казань-2007), региональных научно-практических конференциях (Новосибирск-2003, Тверь-2006, Чебоксары-2008), научно-практических конференциях для педиатров и гематологов различных административных округов г.Москвы (2001-2002гг.), научно-практических конференциях для врачей Морозовской ДГКБ (декабрь-1999, октябрь-2008).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 249 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, 7 глав, выводов, практических рекомендаций, одного приложения (схема поэтапного ведения пациентов), библиографического указателя; иллюстрирована 54 таблицами и 94 рисунками. Библиографический указатель включает 326 источников, 95 из них - работы отечественных авторов, 231 - зарубежных исследователей.
Регуляция абсорбции железа в кишечнике
Железо, поступающее с пищей, всасывается в тонком кишечнике и регулируется протеинами энтероцитов. Несмотря на то, что в этом процессе участвует небольшое количество Fe, его регуляция очень важна, поскольку как дефицит, так и избыток Fe, в основном, зависят от пищевого Fe. Для гомеостаза Fe наиболее важными являются энтероциты 12-перстной кишки — высокоспециализированные клетки, координирующие абсорбцию и транспорт Fe ворсинками (159). Поэтому гомеостаз.Fe связан с жизненным циклом энтероцита: от молодых клеток, находящихся в, крипте, до взрослого энтероцита в верхней части ворсинок происходят процессы, необходимые для , поддержания баланса Fe. Клетки кишечной крипты являются полипотентными клетками-предшественниками, мигрирующими- к ворсинкам, где они дифференцируются в энтероциты. В, энтероцитах происходит синтез новых необходимых организму белков, ответственных за абсорбцию, хранение и транспорт Fe пищи.
Регуляция абсорбции Fe происходит в двух слоях внутреннего эпителия: на апикальной и базолатеральной мембранах. Апикальная мембрана специализирована для транспорта гема и Fe , а базолатеральная -является медиатором перехода Fe во внутренние эпителиальные клетки для дальнейшего его использования организмом (194). Железо, которое не экспортируется в плазму, теряется при слущивании эпителия. Белки, ответственные за метаболизм Fe, экспрессируются энтероцитами, получающими сигналы от различных тканей организма в соответствии с запросами организма в Fe. Когда количество Fe в организме падает ниже критического уровня, энтероцит увеличивает его абсорбцию, пока не произойдет насыщения, после чего происходит восстановление внутреннего эпителия, и абсорбция Fe снижается (193).
В течение продолжительного времени искали претендента на роль гуморального регулятора метаболизма Fe, и в=разное; время кандидатами на эту роль, были сывороточный ферритин, трансферрин, трансферриновый рецептор (101, 152, 159): Помимо того, было установлено, что на захват Fe в кишечнике может оказывать влияние активность эритропоэза (283); а более поздние исследования установили, что гипоксия также может играть роль независимого регулятора увеличенного захвата Fe в кишечнике (193, 283): Однако в последние: годы пришли к заключению; что универсальным регулятором метаболизма Fe является гепсидин влияющий как на абсорбцию диетарного Fe,. так и на высвобождение ТЕе из макрофагов (283j. 258): Увеличение: уровня Fe. в организме: ведет к стимуляции синтеза гепсидина, что снижает абсорбцию Fe; в; кишечнике, и. уменьшает его транспорт в циркуляцию: Ш свою, очередь ; уменьшение абсорбции Fe в кишечнике снижает синтез гепсидина: в печени что (по принципу обратной связи) приводит к восстановлению захвата Fe из пищшв кишечнике (247, 250 322).
Железо,. поступившее с пищей,, находится, в окисленной; форме: Fet3. Оно захватывается апикальной поверхностью энтероцита и при помощи DcytBi восстанавливается в Fe+25 после чего движется к базолатеральной поверхности энтероцита с помощью ДМТ-1 (ранее этот белок обозначался как Nramp2): ДМТ-1 кодируется? геном Nramp, который экспрессирует две альтернативно сращенные mRNA, различающиеся, в своих З1-нетранслируемых. областях. Этот ген кодирует двеизоформы белка Nramp -Nrampl и Nramp2. ДМТ-1 является интегральным мембранным гликопротеином; и обладает способностью" переносить множество двухвалентных ионов, в том числе и токсичные металлы, и, таким образом, не, является специфичным транспортером»: только для Fe- (162;, 194, 215). Транспорт Fe в, энтероцит является временным и рН-зависимым процессом. Захват Fe ДМТ-1 осуществляется в соответствии с уровнем лабильного пула железа (ЛПЖ), после чего происходит транзит Fe в различные участки клетки. По мере, созревания и дифференцировки энтероцита, которое идет вдоль градиента крипта/ворсинка, разворачивается экспрессия вначале крипта-специфичных, а затем энтероцит-специфичных белков, отвечающих за захват Fe и его экспорт из энтероцита в кровоток. Синтез этих белков зависит от уровня запасов Fe и ЛПЖ. Механизмами, улавливающими это состояние, являются железо-регуляторный белок (IRP) и железо-регуляторные элементы (IRE s) (lOl, 215). При взаимодействии IRP с IRE s происходит увеличение экспрессии ТфР в дуоденальной крипте, что ведет к увеличению всасывания Fe в кишечнике при его низких запасах и, наоборот, при высоких запасах Fe IRP не связывается с IRE s, синтез ТфР уменьшается, и Fe не всасывается. В противоположность этому, уровень дуоденального ферритина уменьшается при увеличении всасывания Fe и повышается - при высоком внутриклеточном содержании Fe. Следует заметить, что IRE s имеет mRNA в З -нетранслируемой области, подобно белку ДМТ-1, т.е. оба эти белка - IRE s и ДМТ-1, деградируют при высокомЛПЖ (162).
В соответствии с современным пониманием проблемы, высокий ЛПЖ вызывает повышенную экспрессию гена,гепсидина в печени, что приводит к повышению его концентрации в плазме, а это, в свою очередь, подавляет синтез ДМТ-1, уменьшая степень абсорбции Fe клетками крипты. Данный уровень захвата Fe остается одинаковым в течение всей жизни эпителиальных клеток (4-5 дней) (283).
Еще один очень важный белок, ответственный за ограничение абсорбции Fe в кишечнике - трансмембранный протеин из семейства белков главного комплекса гистосовместимости I класса — HFE (ассоциированный наследственный гемохроматоз). HFE связывает ТфР с высокой аффинностью, близкой к Тф, тем самым, блокируя возможность соединения Тф с ТфР, что, естественно, препятствует возможности доставки Fe тканям. Локализован HFE на эндосоме, на базальной стороне предшественника энтероцита, т.е. в клетках крипты. Хотя до сих пор нет ясности в клеточной функции HFE, его значение для поддержания гомеостаза Fe неоспоримо. Уже давно известно, что мутации этого белка (Cys282Tyr и His63Asp) приводят к тяжелой перегрузке Fe и гемохроматозу вследствие неограниченного взаимодействия Тф с ТфР и постоянного накопления Fe в тканях (194). Т.о., регуляция абсорбции Fe происходит в клетках-предшественниках энтероцита, благодаря белкам ДМТ-1, HFE, IRE s и IRP, которые предотвращают неконтролируемое всасывание металла.
Методы определения показателей метаболизма железа, факторов гемопоэза, уровня цитокинов
Определение различных показателей метаболизма железа, состояния факторов гемопоэза и уровня цитокинов проводилось у плодов (абортусов, выкидышей, развивающихся плодов), новорожденных детей, детей различного возраста и подростков. При этом у плодов и здоровых новорожденных, детей и подростков показатели исследовались однократно.
У пациентов с анемиями на фоне ИВЗ и при МКПП исследование проводилось дважды: первое — при поступлении в стационар, повторное - в период реконвалесценции, как правило, через 2-4 нед лечения. У детей с ЖДС обследование проводилось трижды: 1) при поступлении в стационар, первом обращении по направлению из поликлиники или во время диспансерного осмотра; 2) через 4-8 нед ФТ; 3) после завершения курса ФТ (через 8-12 нед ФТ). У плодов, полученных в результате самопроизвольных выкидышей или искусственного прерывания беременности (абортусов), для определения всех изучаемых показателей мы использовали гомогенаты тканей. Для этого у погибших плодов отделяли мягкие ткани и гомогенизировали вначале в ручном, а затем в ультразвуковом гомогенизаторе (фирмы MSE, Дания) при 15000 об/мин на холоду в фосфатно-солевом буфере при рН=7,2. Полученные прозрачные гомогенаты использовали для анализа. Из кроветворных органов абортусов таким же образом получали раствор, который считали кровью. От абортусов первых 5-10 нед гестации получали только гомогенаты тканей, а от абортусов старше 10 нед гестации -гомогенаты тканей и гомогенаты кроветворных органов. Расчет показателей в гомогенатах проводили на 1 г белка. Белок определяли по Лоури (220) и спектрофотометрически при 280 нм при коэффициенте экстинкций 13,6. У развивающихся плодов и новорожденных детей из пуповинной крови получали сыворотку путем центрифугирования при 1800 об/мин в течение 5 . У детей и подростков различного возраста для исследования использовали избыточные остатки клинических образцов сыворотки крови. Оставшийся после отделения сыворотки кровяной сгусток трижды отмывали 0,9% раствором NaCl и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 , получая, таким образом, гемолизаты. Полученные для исследования сыворотку крови и гемолизаты подвергали анализу — либо сразу (in situ), либо замораживали и хранили при t -18С и в дальнейшем использовали для анализа, после предварительной разморозки при комнатной температуре. Железо сыворотки (ЖС), железо в тканях плодов (Жтк) и ОЖСС определяли стандартными коммерческими наборами (La Chema, Чехия) колориметрическим методом с батафенантролином (65). Трансферрин (Тф) определяли методом радиальной диффузии в агаре с моноспецифической антисывороткой, полученной в ГНЦ РАМН (64). Насыщение Тф железом (НТЖ) является расчетной величиной и выражается в процентах. Процент НТЖ может быть вычислен двумя способами: 1) как простое соотношение ЖС (Жтк) к ОЖСС, умноженное на 100; 2) с учетом молекулярной массы Тф и его способности связывать два атома железа, деленное на 100. Ниже приведены оба способа расчета: 1) ЖС (или ЖТк) : ОЖСС х Ю0% = НТЖ%; 2) [ЖС (или ЖТк) : Тф х 447] : 100% = НТЖ%. Ферритин сыворотки (ФС) и ферритин эритроцитов (ФЭ) определяли радиометрическим методом стандартными коммерческими наборами (ИРМА-ферритин, ИОХ, Республика Беларусь; «Immunotech», Чехия). В основе метода определения ФЭ (для чего из эритроцитов предварительно выделяют раствор НЬ) лежит связывание ферритина с антиферритиновыми антителами (AT), конъюгированными с I , с последующим разделением связавшегося и свободного йода на твердофазном носителе (сорбенте), которым в данном случае является метилцеллюлоза, соединенная с антиферритиновыми AT. Образовавшийся комплекс антиферритин-ферритин-антиферритин-1 определяется по уровню радиоактивной метки и пропорционален количеству ферритина в исследуемой пробе (87). В ряде случаев мы исследовали щелочной (ЩФ) и кислый (КФ) ферритин. ЩФ определяли радиоиммунным методом с использованием стандартных коммерческих наборов. (Immunotech, Чехия); КФ - методом иммуноферментного анализа (ИФА) с моноспецифической антисывороткой против ферритина сердца (там, в основном, и содержится. КФ). Антисыворотка против КФ получена, в ГНЦ РАМН. Конъюгат анти-КФ с пероксидазой хрена (ПХ) получали, соединяя антитела с ПХ по Nacone (241). Растворимый трансферриновый рецептор определяли методом ИФА с моноклональными антителами, полученными в МГУ им. Ломоносова (89).
Эритропоэтин (ЭПО) определяли методом ИФА с использованием стандартных коммерческих наборов ProConEPOplus (Протеиновый Контур, СПб.) В основе метода лежит связывание антител, фиксированных на планшете, являющейся в данном случае твердофазным носителем с антигеном, т.е. эритропоэтином; находящимся; в, исследуемых образцах. Затем в планшеты вносили вторые. AT (биотилизированные), которые применяются для усиления реакции. Индикатором является конъюгат ПХ.со стрептавидином, имеющим высокое сродство к биотину. В качестве субстрата применяли ортофенилендиамин или тетраметиленбензидин:
Метаболизм железа и его регуляция у здоровых плодов в период раннего онтогенетического развития
Материалом для определения показателей метаболизма железа, железорегулирующих белков и цитокинов у здоровых плодов различного гестационного возраста (ГВ) и новорожденных детей служили: 1) ткани здоровых плодов (одноплодных абортусов), полученные сразу после медицинских абортов на 5-15 нед гестации; 2) ткани печени и селезенки условно здоровых самопроизвольных выкидышей, погибших на 16-28 нед гестации в результате травматического воздействия (9) и тяжелой соматической патологии у матери (6); 3) кровь пуповины условно здоровых развивающих плодов в возрасте 22-35 нед гестации, полученная методом кордоцентеза1; 4) кровь пуповины условно здоровых новорожденных детей, полученная сразу после рождения. Для суждения о становлении обмена железа и его регуляции в течение антенатального периода развития, обследованные здоровые плоды (п=51) были разделены на группы в зависимости от срока гестации. В 1 группу включены 4 абортуса в возрасте 5-6 нед (период позднего эмбриогенеза); во 2 группу — 9 абортусов в возрасте 7-10 нед (перед плацентацией), в 3 группу -7 абортусов в возрасте 11-15 нед (период плацентации), в 4 группу — 15 выкидышей в возрасте 16-28 нед (период фетогенеза), в 5 группу - 16 развивающихся плодов в возрасте 22-35 нед (период позднего фетогенеза). В 6 группу были включены 13 недоношенных детей, родившиеся на 35-37 нед гестации, причинами преждевременных родов у которых были преждевременное отхождение вод (9) и цервикальная недостаточность (4). В 7 группу вошли 15 доношенных новорожденных детей, родившихся на 38-41 нед гестации. Характеристика обследованных условно здоровых плодов и новорожденных детей, а также исследованного материала представлена в табл. 3.1.2. От плодов 5-10 нед гестации получали и подвергали изучению только гомогенаты тканей (в совокупности, spp.), от плодов 11-15 нед и выкидышей 16-28 нед гестации - отдельно гомогенаты тканей печени и тканей селезенки. У развивающихся плодов 22-35 нед гестации, а также у доношенных и недоношенных новорожденных детей исследовали образцы крови пуповины.
Как видно из таблицы 3.1.3, уровень ЩФ оказался чрезвычайно высоким на всем протяжении внутриутробного развития, но особенно - на ранних этапах эмбрионального развития и в период формирования плаценты (у плодов 1, 2 и 3 групп соответственно). Его максимальные значения (более 2000 мкг/г белка) приходятся на возраст 7-10 нед гестации, причем ни у одного плода этого ГВ не было значений ЩФ ниже 1000 мкг/г белка. Вероятно, это обусловлено особой ролью ЩФ для данного периода развития, которая заключается в передаче Fe для синтеза железосодержащих белков и ферментов, которые жизненно необходимы для поддержания высокой интенсивности энергообеспечения, поскольку в период позднего эмбриогенеза идут наиболее напряженные процессы дифференцировки тканей, формирования органов и систем плода (второй «критический» период жизни плода). В дальнейшем, по мере развития плода, происходит постепенное снижение уровня ЩФ. И хотя этот процесс идет неравномерно, он, скорее всего, зависит от потребностей развивающегося плода в Fe, что диктуется высочайшей степенью активности пролиферативных процессов и интенсивностью синтетических реакций. У доношенных новорожденных, по сравнению с недоношенными детьми, содержание ЩФ при рождении несколько меньше (р 0,05), что, вероятно, связано с переключением процесса кроветворения в костный мозг. Таким образом, в раннем онтогенезе человека значения ЩФ претерпевают определенные и, по всей вероятности, закономерные изменения (рис. 3.1.1), которые находятся в обратной - зависимости от ГВ (г= -0,94987, р 0,0001).
Значения КФ оказались высокими (300 мкг/г белка) только в период позднего эмбриогенеза, на 5-6 нед гестации, а в дальнейшем, по мере развития плода, они невелики и остаются примерно на одном и том же уровне вплоть до рождения. Поскольку КФ является регуляторным белком и синтезируется, в основном, макрофагами; можно предположить, что его уровень может отражать степень развития макрофагальной системы, и в раннем онтогенезе его главной ролью, вероятнее всего, является поддержание стабильности синтетических процессов. Нами не было выявлено взаимосвязи между значениями КФ и гестационным возрастом плода (г-0,1733, р=1,8967).
За исключением периода позднего эмбриогенеза (5-6 нед гестации), на протяжении внутриутробного развития у плодов8 соотношение ЩФ и КФ очень высокое (59-29), которое постепенно снижается к рождению. Примечательно, что у доношенных новорожденных детей соотношение ЩФ/КФ составляет 11,1, что не отличается от такового у грудных детей-и взрослых (10,0), в то время как у недоношенных новорожденных оно вдвое выше 24,1 (р 0,01). Мы не обнаружили на протяжении внутриутробного периода развития плода взаимосвязи между щелочной и кислой изо формами ферритина (г=0,1361, р=1,2333) (рис. 3.1.2).
Показатели метаболизма железа у здоровых детей раннего возраста
Следует подчеркнуть, что среди этой группы не было детей со средними и тяжелыми формами ЖДА, что, безусловно, свидетельствует о должном контроле за состоянием здоровья и адекватностью пищевого рациона в домах ребенка города. Вероятность именно подобного распределения указанных форм ЖДС у детей данного социального сегмента чрезвычайно высока, на что указывают тренды полинома как ЛДЖ (R2=0,8070), так и ЖДА (R2=0,7966) (рис. 5.1.8). Причем «пиковые значения» риска развития ЖДС у детей-сирот приходятся на возраст 13-18 мес, в то время как у детей из семейного социума - на возраст 10-12 мес, что можно объяснить более низкими темпами роста и развития детей, находящихся в казенных приютах. При этом частота ЖДС у детей-сирот оказалась несколько выше, чем у детей из семейного окружения (13,1% и 10,4% соответственно), но выраженность ДЖ у первых, напротив, была значительно меньше. Так, среди детей-сирот преобладал ЛДЖ (56,5%), в то время как у «домашних» детей - легкая степень ЖДА (62,1%), а ЛДЖ встречался только в 20,6% случаев.
Следует однако признать, что хотя, возможно, дефицит железа и вносил свой вклад в задержку развития детей-сирот, но отнюдь не в той степени, в какой его «виновниками», на наш взгляд, служили генетические, биологические факторы и социальное окружение (отсутствие семьи, недостаток должного общения со взрослыми и др.), поскольку задержка ПМР в одинаковой степени встречалась у детей как с ЖДС, так и без него (рис. 5.1.9).
Справедливости ради следует также отметить, что постоянный контроль за состоянием здоровья детей, находящихся на попечении государства, включает активные превентивные мероприятия, направленные на предупреждение развития ЖДС. Среди превентивных мер постоянный мониторинг анализов крови и уровня гемоглобина, использование только адаптированных заменителей грудного молока, своевременное введение в рацион специальных детских продуктов, обогащенных железом, и др.
Таким образом, у детей данного социального сегмента, в подавляющем большинстве случаев оставшихся с рождения социальными сиротами, причинами развития ЖДС являлись: 1) неудовлетворительное состояние здоровья матерей (алкоголизм, табакокурение, наркомания, отсутствие контроля течения беременности, инфекционно-воспалительные заболевания и др.); 2) полное отсутствие грудного вскармливания. Указанные причины в большей степени причисляются к гуманитарным приоритетам и относятся к компетенции социальной сферы государства, в меньшей степени - к области здравоохранения (хотя по смыслу последнего слова - всё как раз должно быть наоборот).
Особую социальную группу составляют дети, родившиеся у осужденных женщин и воспитывающиеся в доме ребенка ГУИН (Главное Управление исполнения наказаний Минюста РФ). Уже в антенатальном периоде будущие дети этих женщин испытывают пагубные воздействия, нарушающие нормальное рост, развитие и жизнеобеспечение плода (предшествующие алкоголизм и наркомания, соматические и инфекционные болезни матери и др., в том числе, гестационная ЖДА). Как известно, биологический путь внутриутробного развития настолько значим для здоровья, что даже относительно умеренные отклонения на этой стадии в обеспеченности кислородом и нутриентами (в том числе, железом) могут привести к довольно значимым потерям в качестве развития и формирующегося здоровья, и даже в качестве и количестве последующей жизни (17). В год в женских колониях рождается около 10 000 детей, поэтому анализ причин развития ЖДС и их возможной профилактики в этом совершенно особом социальном сегменте, представленный в данном разделе, имеет, на наш взгляд, определенное социальное и медицинское значение.
В доме ребенка при женской колонии ГУИН (УУ-163/5 г. Можайска) дети находятся в одновозрастных группах, сформированных по типу ясель-сада, где они пребывают, как правило, до Зх лет. Обследование данной когорты детей проводилось по просьбе медицинского управления ГУИН, согласно специальному разрешению зам.министра Минюста РФ. Дети обследовались с частотой 1 раз в 4-6 месяцев выездной бригадой, в состав которой входили врачи-педиатры, невропатолог и оториноларинголог, и медицинские сестры, осуществлявшие забор крови для исследования.
В течение 2002-2004 гг. нами было осмотрено и обследовано 163 ребенка в возрасте от 4,5 мес до 3 лет, среди которых было 89 (54,6%) мальчиков и 74 (45,4%) девочки (табл. 5.1.6).
