Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. 11
1 .Виды клеток предшественников гемопоэза используемых для трансплантации
1.1 .Костный мозг как источник КПГ 11
1.2. Клетки предшественники гемопоэза периферической крови 12
2. Виды мобилизации КПГ ПК 17
2.1. Сбор КПГ ПК без предшествующей мобилизации 17
2.2. Использование химиотерапии для мобилизации и сбора КПГ ПК 18
2.3.Использование цитокинов для мобилизации и сбора КПГ ПК 22
2.4.Использование для мобилизации и сбора КПГ ПК комбинации химиотерапии и колониестимулирующих факторов
3 . Факторы влияющие на эффективность сбора КПГ ПК 24
3.1 .Влияние возраста на эффективность сбора КПГ ПК 24
3.2.Влияние массы тела на эффективность сбора КПГ ПГ 26
3.3 .Влияние вида колониестимулирующих фактора и режима его введенияна результативность мобилизации и сбора
3.3.1 . Влияние вида КСФ на эффективность мобилизации и сбора 27
3.3.2.Влияние режима введения КСФ на эффективность мобилизации и сбора 31
3.4. Влияние предшествующей химиотерапии на результативность мобилизации сбора
4.. Повторные попытки сбора КПГ ПК 34
5. Лабораторные показатели предсказывающие результативность сбора 35
5.1.Использование уровня лейкоцитов в периферической крови для выбора времени начала сбора КПГ ПК 38
5.2.Использование уровня CD34+ клеток в периферической крови для выбора времени начала сбора КПГ ПК
ГЛАВА II. Материалы и методы 40
Методика мобилизации 43
Определение содержание CD34+ клеток в периферической крови и гемопоэтическом материале
Повторные процедуры мобилизации и сбора 50
Криоконсервация 51
Отбор больных для проведения трансплантации 51
Трансплантация 52
Контроль за восстановлением гемопоэза и трансфузионная тактика 52
Статистический анализ 53
Глава III. Результаты исследования и их обсуждение 54
Глава IV. Обсуждение полученных результатов 74
Выводы 80
Практические рекомендации 81
Список литературы 83
- Клетки предшественники гемопоэза периферической крови
- Использование химиотерапии для мобилизации и сбора КПГ ПК
- Влияние вида КСФ на эффективность мобилизации и сбора
- Контроль за восстановлением гемопоэза и трансфузионная тактика
Введение к работе
Актуальность работы.
Одной из основных причин смертности в настоящее время являются опухолевые заболевания, важнейшим методом лечения которых остается системная химиотерапия [130; 132]. Использование современных схем цитостатической терапии позволяет излечить или продлить жизнь значительному количеству больных со злокачественными новообразованиями. Однако несмотря на достигнутые успехи, в ряде случаев проведение стандартной химиотерапии не позволяет добиться длительного противоопухолевого эффекта, что связано с первичной или приобретенной резистентностью опухоли к цитостатикам [4; 44; 41; 51; 59; 98].
Исследования на моделях животных и in vitro показали, что эскалация дозы цитостатиков пропорционально увеличивает противоопухолевый эффект и позволяет в ряде случаев преодолеть лекарственную резистентность [119]. Однако это сопровождается и ростом числа осложнений, обусловленных воздействием химиопрепаратов на нормальные органы и ткани [43].
Для многих цитостатиков (алкилирующие препараты, препараты нитрозомочевины и т.д.) дозолимитирующей токсичностью является подавление кроветворной функции костного мозга. Лейкопения и тромбоцитопения -наиболее опасные проявления гемодепрессии. Они значительно повышают риск развития инфекционных и геморрагических осложнений, которые даже в условиях адекватной сопроводительной терапии могут приводить к гибели пациента.
В 1950-х годах Jacobson и Lorenz впервые показали, что донорский (аллогенный) костный мозг (КМ), реинфузированный мышам, которым было проведено облучение в миелоаблативных дозах (полностью подавляющих собственное кроветворение), способен в течение нескольких недель полностью
восстановить гемопоэз и спасти жизнь экспериментальных животных [61; 106]. Данное наблюдение послужило основой для разработки метода аллогенной трансплантации КМ, при которой пациентам, получившим миелоаблативные дозы облучения или цитостатиков по поводу злокачественных новообразований, инфузия донорского костного мозга позволяет восстановить гемопоэз [123; 124].
В дальнейшем была разработана технология, позволяющая длительно сохранять гемопоэтические клетки при низких температурах, что сделало возможным использование для трансплантации гемопоэтические клетки, полученные до проведения высокодозной химиотерапии от самого больного [40; 68].
Использование для восстановления гемопоэза после высокодозной химиотерапии или радиотерапии гемопоэтических клеток, полученных от самого больного, получило название аутологичной трансплантации. Внедрение данного метода в клиническую практику привело к значительному расширению показаний к высокодозной химиотерапии, а также позволило увеличить контингент больных, которым такое лечение может быть проведено.
В начале 1980-х годов в мире производилось лишь 100 аутологичных трансплантаций в год. В настоящее время по данным Европейской организации по трансплантации клеток предшественников гемопоэза (ЕВМТ) ежегодное количество аутотрансплантаций превышает 15 тысяч [7].
Однако трансплантация гемопоэтической ткани (как аутологичной, так и донорской) не позволяет полностью избежать периода глубокой нейтропении и тромбоцитопении и связанного с ними риска развития инфекционных и геморрагических осложнений [21]. Это объясняется необходимостью миграции реинфузированных клеток предшественников гемопоэза в костномозговое пространство, установления их связи с микроокружением, пролиферации и дифференцировки в зрелые форменные элементы крови. На длительность интервала между трансплантацией и восстановлением адекватного кроветворения во многом влияет комитированность реинфузированных клеток
предшественников кроветворения. Более "зрелым" клеткам требуется меньше времени для пролиферативного ответа и конечной дифференцировки, что, в итоге, приводит к ускорению восстановления гемопоэза.
В 1971 году было показано, что в крови здоровых людей циркулируют клетки, способные образовывать гемопоэтические колонии. Эти клетки обладают такими же свойствами, что и гемопоэтические клетки костного мозга. Однако в популяции периферических стволовых клеток содержится относительно большее число зрелых предшественников гемопоэза. В норме (без дополнительных воздействий) количество этих клеток ничтожно мало [86], но оно значительно возрастает в период восстановления кроветворения после стандартной миелосупрессивной химиотерапии [103]. В 80-х годах была доказана возможность увеличения числа циркулирующих КПГ ПК и под влиянием рекомбинантных колониестимулирующих факторов [121]. В дальнейшем это позволило получать КПГ из периферической крови в достаточных для трансплантации количествах. Разработка современных методов мобилизации и сбора гемопоэтических стволовых клеток из периферической крови позволяет в настоящее время получать кроветворный материал, использование которого делает проведение высокодозного лечения более безопасным за счет уменьшения длительности посттрансплантационной цитопении и, соответственно, снижает риск инфекционных и геморрагических осложнений, по сравнению с трансплантацией КМ [62].
Однако результативность мобилизации и сбора КПГ ПК и, соответственно, возможность их использования для последующей трансплантации, зависит от многих факторов, и получить достаточное для трансплантации количество КПГ ПК удается не у всех больных. Все это делает задачу оптимизации методов мобилизации и сбора КПГ ПК крайне актуальной. Кроме того, с учетом значительной ресурсоемкости процедуры мобилизации и сбора, необходимым является выявление факторов, способных предсказать возможность получения достаточного для трансплантации количества КПГ ПК у конкретного пациента и
время, оптимальное для проведения процедуры сбора КПГ ПК.
Цель исследования:
Оптимизация методов мобилизации и сбора клеток предшественников гемопоэза для последующей аутологичной трансплантации у больных со злокачественными новообразованиями и определение факторов прогноза результатов мобилизации сбора.
Задачи исследования:
Оценка современных методик стимуляции и сбора КПГ ПК у больных с прогностически неблагоприятными вариантами течения гематологических и солидных новообразований.
Оценка влияния биометрических показателей, предлеченности больного, основного заболевания на результативность мобилизации и сбора КПГ ПК.
Оценка влияния количества лейкоцитов, CD34+ клеток периферической крови на момент начала" афереза на результативность мобилизации и сбора КПГ ПК.
Анализ влияния режима мобилизации (в покое, после проведения цитостатической терапии) на эффективность сбора КПГ ПК.
Оценка влияния различных схем химиотерапии, предшествующих мобилизации и сбору КПГ ПК, на его эффективность.
Определение роли введения высоких доз циклофосфамида до начала стимуляции гемопоэза КСФ на эффективность сбора КПГ ПК.
Научная новизна: В работе впервые в России на большом собственном материале проанализированы факторы, оказывающие влияние на результативность сбора аутологичных КПГ ПК. Показано отсутствие факторов, способных полностью исключить возможность получения достаточного для трансплантации количества КПГ ПК и целесообразность проведения процедуры
мобилизации и сбора у всех больных, нуждающихся в проведении трансплантации. Доказано, что содержание CD34+ клеток в периферической крови на момент начала сбора КПГ ПК (в отличие от содержания лейкоцитов в аналогичное время) обладает высокой прогностической значимостью в отношении суммарной эффективности сбора КПГ ПК. Выявлено, что использование циклофосфамида с последующим назначением Г-КСФ (ГМ-КСФ) обладает наилучшим мобилизирующим эффектом по сравнению с другими режимами мобилизации. Показано влияние основного заболевания на результативность мобилизации и сбора КПГ ПК. Показано, что трансплантация <2х106/кг CD34+ (с или без добавления костного мозга) может приводить к восстановлению кроветворения в приемлемые сроки у большинства пациентов.
Практическая значимость: Полученные в работе данные позволили выявить наиболее эффективный режим мобилизации (высокие дозы циклофосфамида) для пациентов, у которых достижение дополнительного противоопухолевого эффекта от мобилизационной химиотерапии не является основной целью. Показано, что режимы с высокой противоопухолевой активностью, но содержащие препараты токсичные для КПГ (мелфалан, препараты нитрозомочевины) при клинической необходимости могут использоваться без значимой потери эффективности мобилизации и сбора. Показано, что содержание лейкоцитов в периферической крови является неадекватным ориентиром для начала сбора КПГ ПК и с этой целью необходимо использовать только абсолютное содержание CD34+ клеток. Содержание CD34+ клеток в периферической крови на первый день сбора КПГ ПК также позволяет рационально планировать необходимость продолжения мобилизации и сбора. Основываясь на анализе полученных результатов, даны приведенные ниже практические рекомендации по проведению мобилизации и сбора КПГ ПК.
Клетки предшественники гемопоэза периферической крови
Во взрослом организме большинство КПГ постоянно находится в костном мозге, но очень небольшая их часть (2-4% от содержания в КМ) в норме может мигрировать в периферическое сосудистое русло [23]. В 1960-х годах было доказано, что КПГ ПК, также как и клетки предшественники гемопоэза из костного мозга, способны восстанавливать полноценный гемопоэз у смертельно облученных животных [64; 74]. Клинические исследования показали, что КПГ ПК способны приводить к более раннему (по сравнению с КМ) восстановлению кроветворения. Это закономерно сопровождается снижением частоты и тяжести осложнений высокодозной химиотерапии, снижает затраты на проведение лечения, а по данным некоторых исследований приводит и к снижению смертности в раннем посттрансплантационном периоде. В связи с этим в последние годы КПГ ПК стали основным источником кроветворных стволовых клеток для аутологичной трансплантации пациентам с различными гематологическими и онкологическими заболеваниями [13]. Как в костном мозге, так и в периферической крови популяция КПГ является неоднородной и представлена как ранними плюрипотентными клетками, так и более зрелыми предшественниками [144; 47]. Скорость и стабильность восстановления гемопоэза зависит от соотношения в трансплантате КПГ различной степени зрелости и дифференцировки. Ранние (не коммитированные) клетки предшественники гемопоэза ответственны за стабильность восстановления гемопоэза, а более зрелые КПГ, способные к быстрой пролиферации, определяют скорость восстановления кроветворения. (Рисунок 1). Одним из преимуществ КПГ ПК является относительно большее содержание в них более зрелых предшественников, что и обеспечивает уменьшение сроков восстановления гемопоэза по сравнению с КМ. Важно отметить, что эта закономерность не меняется при использовании гемоцитокинов после трансплантации [29; 75; 112]. Так в исследовании Seattle group [79] было показано, что у пациентов, получивших КПГ ПК после проведения ВДХ, среднее время восстановления уровня нейтрофилов более 0,5x109/л составило 9 дней, а при трансплантации КМ - 12 дней. Достижение уровня тромбоцитов более 20 х 10 /л заняло 11 и 22 дня соответственно (различия статистически значимы). Так же статистически значимое сокращение времени до достижения безопасного уровня тромбоцитов в группе КПГ ПК по сравнению с КМ (16 и 23 дня соответственно) и времени до восстановления нейтрофилов (11 и 14 дней соответственно) было показано в рандомизированном исследовании Schmitz К. et al. [108]. Важно отметить, что все больные, включенные в исследование, получали после трансплантации Г-КСФ. Схожие данные были получены и в ряде других исследований [3; 54; 84; 115; 136; 140].
Одновременно КПГ ПК содержат и достаточное количество ранних предшественников, что позволяет данному типу трансплантата приводить к стабильному «пожизненному» восстановлению кроветворения после высокодозной химиотерапии. В то же время содержание КПГ в периферической крови гораздо более вариабельно, чем в КМ. Это делает необходимым использование специальных методов их определения.
В настоящее время с этой целью наиболее часто используется метод проточной иммуноцитометрии, позволяющий косвенно оценить количество полученных (или циркулирующих в периферической крови) КПГ ПК по количеству клеток, несущих антиген CD34 [28]. Этот антиген представляет собой гликопротеин, который характерен для большинства предшественников кроветворения, но прекращает экспрессироваться в процессе созревания.
Изначально (в 1984 г.) антиген CD34 был выделен на культуре клеток острого нелимфобластного лейкоза, а позднее было доказано его присутствие на всех колониеобразующих клетках предшественниках гемопоэза [31]. Принадлежность CD34+ клеток к классу предшественников гемопоэза была успешно подтверждена в эксперименте, где трансплантированные CD34+ клетки успешно восстановили гемопоэз у обезьян, получивших летальную дозу облучения. Позднее, это получило подтверждение в клинических исследованиях [20]. Обнаружение антигена CD34, как маркера стволовых клеток, способствовало дальнейшему развитию методик мобилизации и сбора КПГ ПК.
Использование иммуноцитометрии с моноклональными антителами к CD34 позволяет выявить КПГ ПК среди морфологически неотличимых от них зрелых клеток крови (мононуклеаров) и, соответственно, определить результативность сбора КПГ ПК и и/или оптимальное время начала их сбора [2]. Иммуноцитометрия является быстрым (2-3 часа) и весьма надежным методом оценки содержания КПГ ПК [2].
Благодаря возможности получать данные о количестве CD34+ клеток в периферической крови в тот же день, пик мобилизационного эффекта и, соответственно, время начала афереза может быть определено достаточно быстро и точно, без необходимости ориентироваться на такие суррогатные маркеры, как уровень или скорость прироста уровня лейкоцитов. Возможность быстрого подсчета CD34+ клеток в собранном гемопоэтическом материале позволяет рассчитать и количество требуемых процедур афереза. Фактически, у пациентов с успешной мобилизацией КПГ в периферическую кровь, может потребоваться лишь 1-2 процедуры сбора КПГ ПК, в то время как у других больных — значительно больше. Наличие данных о числе собранных CD34+ клеток позволяет проводить оптимальное количество процедур сбора.
Оценка количества полученных CD34+ клеток позволяет достаточно точно прогнозировать длительность посттрансплантационной цитопении и шанс на восстановление кроветворения в приемлемые сроки. Трансплантация более 2x106 CD34+ клеток/кг приводит к быстрому (в течение 1-3 недель) и стабильному восстановлению безопасного уровня лейкоцитов и тромбоцитов у большинства пациентов [113]. Увеличение этой дозы до 3,5-5x10 CD34+ клеток/кг, по некоторым данным, способно еще больше увеличить вероятность быстрого восстановления гемопоэза [129] Дальнейшее увеличение количества CD34+ клеток не укорачивает время восстановления кроветворения.
Использование химиотерапии для мобилизации и сбора КПГ ПК
По данным Национального Института по исследованию Рака США (NCI) к 2030 году до 70% пациентов, страдающих опухолевыми заболеваниями, будет старше 65 лет, и таким образом увеличится количество пожилых пациентов, нуждающихся в высокодозной химиотерапии с последующей трансплантацией КПГ ПК [120; 145].
Возраст является одним из предполагаемых факторов, способных отрицательно повлиять на результативность мобилизации и сбора КПГ ПК, т.к. существует данные о том, что у пожилых пациентов отмечается снижение резервов кроветворения [89; 134; 49; 48; 111]. Кроме того, предполагалось, что с возрастом может изменяться качественный состав КПГ и их функциональные способности, что, соответственно, может отразиться на динамике восстановления кроветворения после трансплантации.
В тоже время в исследовании на модели животных, в котором мобилизация проводилась с включением Г-КСФ, было показано, что в более старшей группе результативность сбора была в 5 раз лучше, по сравнению с молодыми особями [131]. Авторы объясняли этот факт наступающим с возрастом ослаблением связи между КПГ и стомальным окружением.
Клинические исследования в данной области проводилось Boiret et al. [22], которые сравнили иммунофенотипические профили и способность к колониеобразованию полученных при помощи мобилизации Г-КСФ КПГ ПК у детей и взрослых. При этом в исследовании значительное внимание уделялось сопоставлению способности КПГ ПК к восстановлению долговременного гемопоэза (косвенно оцениваемой по наличию клеток с Thy-1 иммунофенотипом и способности образовывать LTCIC колонии). Авторы не выявили существенных различий по исследуемым показателям в зависимости от возраста пациентов, однако основные заболевания (и соответственно предшествующее лечение) в исследуемых популяциях различались. Если у пациентов детского возраста превалировали солидные новообразования, то большинство взрослых больных страдали гемобластозами. В связи с этим данные исследования должны интерпретироваться с осторожностью. Тем не менее, авторы сделали вывод, что, долговременная репопуляционная способность трансплантированных стволовых клеток не зависит от возраста пациента.
В исследовании Guba S. at al., были проанализированы 225 пациентов с диагнозом множественная миелома, которым проводилась мобилизация циклофосфамидом в высоких дозах с последующим назначением КСФ. Среди всей группы пациентов 57 были старше 60 лет. Статистически значимых различий в результативности мобилизации и сбора, а также в скорости восстановления гемопоэза после трансплантации в зависимости от возраста больных отмечено не было. Эти данные подтвердили эффективность мобилизации и безопасность проведения трансплантации полученного гемопоэтического материала у пациентов старше 60 лет[52].
В работе Jantunen Е., at al. было проведено сравнение эффективности мобилизации у пациентов с диагнозом множественная миелома в старшей возрастной группе ( 65 лет) в сравнении с более молодыми пациентами. Различий в эффективности мобилизации получено не было. Авторы сделали вывод о том, что возраст не должен быль критерием исключения для проведения высокодозной химиотерапии у пациентов старше 65 лет [63].
Таким образом, в настоящее время связь между возрастом и эффективностью мобилизации и сбора не показана, и пожилой возраст (сам по себе) не должен рассматриваться как противопоказание для выполнения высокодозной химиотерапии.
Как было сказано выше, в большинстве случаев число необходимых для трансплантации клеток оценивают исходя из массы пациента (количество CD34+ клеток или мононуклеаров на килограмм массы тела). Также на килограмм массы тела рассчитывается и доза КСФ, используемая для мобилизации. В тоже время, у пациентов, имеющих значительное отклонение массы тела от идеальной, возможно, как изменение фармакокинетики/фармакодинамики КСФ (за счет изменения соотношения жировой/мышечной тканей), так и расхождение между расчетной (исходя из реальной массы тела) и оптимальной дозой CD34+ клеток, необходимых для адекватного восстановления кроветворения. В большинстве исследований (а также и в рутинной практике) для оценки трансплантата [87; 17; 30] расчет собираемых и трансплантируемых КПГ ПК осуществлялся из ктического веса пациента. В недавно проведенном исследовании, включившем 63 пациента, было показано, что использование идеальной массы тела для расчета дозы CD34+, необходимой для трансплантации, позволяет лучше прогнозировать восстановление, чем оценка аналогичного показателя исходя из реальной массы тела [114], это подтверждается и в других исследованиях [83]. Данных о сопоставлении эффективности мобилизации и сбора при использовании идеальной или реальной массы тела для расчета дозы КСФ в доступной нам литературе обнаружить не удалось.
Влияние вида КСФ на эффективность мобилизации и сбора
К сожалению, несмотря на доступные в настоящее время возможности мобилизации, у 20-40% больных не удается получить достаточного по современным критериям количества КПГ ПК. Однако у ряда из них возможно проведение повторной процедуры мобилизации и сбора. В одном из исследований 108 пациентов, у которых не удалось получить достаточного количества КПГ ПК после первой мобилизации химиотерапией и КСФ, подверглись повторной мобилизации [88]. При повторной мобилизации авторы использовали монотерапию Г-КСФ либо в дозе 5 (17 пациентов) либо 10 (91 пациент) мкг/кг/день через 5-7 дней после первой попытки мобилизации. Вторая попытка была успешной в 80,5% случаев и среднее количество CD34+ клеток составило 3,6x106 клеток/кг. Существенной разницы в результативности сбора между группами, получавшими различные дозы Г-КСФ, не отмечалось.
В исследовании Watts et al. принимали участие 21 пациент после неудачной мобилизации с использованием режима химиотерапия + Г-КСФ [139]. Повторная мобилизация у 18 из них была проведена таким же режимом химиотерапии, но с более высокой дозой Г-КСФ. Благодаря повторной мобилизации у 71% больных было получено достаточное количество стволовых клеток, чтобы при объединении гемопоэтического материала (от первого и второго сбора) его количества хватило для безопасного выполнения трансплантации. Полученный в результате сборов трансплантат, позволил добиться восстановления уровня нейтрофилов в приемлемые сроки у большинства пациентов, однако у части пациентов наблюдалась задержка восстановления тромбоцитов. Таким образом пациентам, первая мобилизация у которых оказалась неудачной, возможно проведение повторной мобилизации, которая может позволить получить достаточное количество КПГ ПК.
На основании многочисленных исследований, в настоящее время сформировался вполне определенный практический подход к избранию режима мобилизации КПГ ПК для аутотрансплантации. В случае, если перед проведением мобилизации пациенту необходимо цитостатическое лечение (с целью циторедукции и/или определения химиочувствительности опухоли), то используется мобилизация комбинацией химиотерапии и Г-КСФ. В подобных случаях режим химиотерапии зависит от типа опухоли, т.е. в первую очередь служит именно для достижения противоопухолевого эффекта, а его мобилизирующая способность является желательной, но не обязательной. Комбинированная мобилизация (химиотерапия + Г-КСФ) проводится и в случае, если необходимо увеличение эффективности сбора (по сравнению только с Г-КСФ). Однако в таком случае используется режим химиотерапии, показавший наибольшую мобилизационную активность, а возможность достижения дополнительного противоопухолевого эффекта от химиотерапии является желательным, но не обязательным условием. Остальным пациентам (находящимся в состоянии ремиссии и не требующим дополнительной химиотерапии для контроля опухоли перед мобилизацией, пациентам с прогнозируемым хорошим сбором КПГ ПК) может проводиться мобилизация с использованием только КСФ.
Однако при любом виде мобилизации крайне важным является выбор оптимального времени начала сбора КПГ ПК, так как было сказано выше, срок в течение которого эти клетки в достаточном количестве находятся в периферической крови, ограничен несколькими днями. Наиболее изученными факторами предсказания времени начала сбора при комбинированной мобилизации являются уровень лейкоцитов, их прирост в течение 24 часов от предыдущего определения, количество CD34+ клеток в периферической крови. Однако и в случае использования мобилизации в покое, когда сбор обычно начинается через фиксированное время от начала стимуляции, определение данных параметров может позволить более точно спрогнозировать время начала афереза.
Данный метод прогнозирования времени начала сбора является наиболее технически простым в исполнении, т.к. клинический анализ крови является рутинным в большинстве клиник и не требует дополнительного оборудования.
При использовании для мобилизации только миелосупрессивной химиотерапии большинство авторов придерживается мнения, что время начала сбора КПГ ПК должно совпадать с достижением уровня лейкоцитов 1,0х109/л, особенно если одновременно наблюдается и быстрый рост числа тромбоцитов [128]. При мобилизации с использованием химиотерапии и КСФ в большинстве случаев сбор рекомендуют начинать при достижения уровня лейкоцитов 2-5х109/л [53], хотя ряд авторов считает, что оптимальный уровень лейкоцитов для начала афереза - 10х109/л и более [45]. При проведении мобилизация с использованием только Г-КСФ сбор обычно начинают на фиксированный день стимуляции (сбор проводят на 5-7 сутки от начала мобилизации) без ориентировки на уровень лейкоцитов [112; 19; 14].
Как показали некоторые исследования, скорость восстановления лейкоцитов на фоне мобилизации химиотерапией+Г-КСФ способна предсказывать "пик" мобилизации и позволяет улучшить результативность сбора КПГ ПК по сравнению с методиками, когда сбор осуществляется на фиксированный день после мобилизационной химиотерапии. Так Krieger et al. были опубликованы результаты многоцентрового исследования, в котором больным множественной миеломой (п=190) проводился сбор КПГ ПК после мобилизации с использованием циклофосфамида, преднизолона и Г-КСФ [77]. Процедура сбора начиналась когда отмечался прирост количества лейкоцитов 1000 в микролитре за 24 часа, на фоне восстановления количества тромбоцитов до уровня 30,000 в микролитре. По сравнению с началом сбора на фиксированный день после окончания химиотерапии (день 15) при ориентировке на скорость прироста уровня лейкоцитов первые два дня проведения сбора КПГ ПК значительно чаще совпадали с пиком мобилизации (ежедневный прирост числа CD34+ клеток в периферической крови на 100% и более по сравнению с предыдущим днем). При использовании данной методики число пациентов, у которых в продукте сепарации за первый день сбора содержалось более 1% CD34+ клеток, увеличилось с 47% до 70% (р=0,005). Таким образом, скорость прироста лейкоцитов периферической крови (при условии восстановления уровня тромбоцитов) может быть использована в качестве суррогатного маркера пика мобилизации КПГ ПК.
Следует заметить, что методы прогнозирования начала сбора, основанные на определении уровня лейкоцитов крови, хотя и обладают некоторой предсказательной способностью однако весьма неточны: уровень лейкоцитов, при котором рекомендуется начинать сбор КПГ ПК, варьирует от исследования к исследованию в очень широких пределах (от 2 до 10х109/л). В то же время в большинстве исследований все же отмечается некоторая корреляция между уровнем CD34+ клеток и уровнем лейкоцитов. В связи с этим уровень лейкоцитов может использоваться в качестве ориентира для времени начала определения содержания CD34+ клеток, но не как самостоятельный показатель для определения оптимального времени начала сбора КПГ ПК.
Контроль за восстановлением гемопоэза и трансфузионная тактика
Учитывая крайне вариабельное содержание КПГ в периферической крови и отсутствие морфологических отличий этих клеток от зрелых мононуклеаров, проводилось их специальное определение в периферической крови и продукте сепарации. Для определения содержания CD34+ клеток использовался метод проточной иммуноцитометрии. Анализ осуществлялся на проточном цитометре (FACScan Becton Dickinson USA). Определение стволовых клеток проводилось цитометрически, в реакции прямой иммунофлюоресценции, с использованием различных флюорохромных коньюгатов моноклональных антител (МКА) к антигену CD34. В качестве флюорохрома предпочтение отдавалось фикоэритриновой метке (РЕ), как более чувствительной по сравнению с флюоресцином (FITC).
В определении количества CD34+ клеток использовался протокол SIHON, при этом определялось абсолютное количество стволовых клеток, и требовалось определение двух величин: процент CD34+ ядерных клеток (цитометрия) и числа лейкоцитов крови (гемограмма). Клетки лейкоконцентрата освобождались от эритроцитов стандартным методом лизиса (FACS Lysing solution, Becton Dickenson) и окрашивали прямыми коньюгатами моноклональных антител к антигену CD34 и к панлейкоцитарному антигену CD45 (при использовании тройной флюоресцентной метки). После получения результатов анализа абсолютное количество CD34+ в продукте сепарации и периферической крови подсчитывали с использованием следующих формул: 1. количество CD34+ клеток в продукте сепарации = [количество мононуклеаров в литре сепарата] [объем контейнера в литрах]/[масса пациента вкг] 100 2. содержание CD34+ клеток в периферической крови (/мкл.) = ([количество лейкоцитов в периферической крови/мкл.] [%С034+ в периферической крови]) Повторные процедуры мобилизации и сбора КПГ ПК. Повторные процедуры мобилизации и сборы КПГ ПК были проведены у 20 больных. Поводами для выполнения повторных сборов являлись: 1. неудовлетворительные результаты первого сбора (невозможность получить 2х101 CD34+ клеток/кг на каждую из планировавшихся трансплантаций); 2. выявление прогрессирования заболевания в процессе сбора или непосредственно после его окончания (в таком случае гемопоэтический материал от первого сбора для трансплантации не использовался). Повторные процедуры мобилизации и сбора КПГ ПК проводились по тем же принципам, что и первые. В пределах 24 часов после получения гемопоэтический материал подвергался криоконсервации в парах жидкого азота по методике Мхеидзе Д.М. [авторское свидетельство N1635332 от 15 ноября 1990 года] До момента криоконсервации, материал хранился при комнатной температуре не более 24 часов. Отбор больных на проведение трансплантации. Как минимум один курс высокодозной химиотерапии с трансплантацией аутологичных КПГ ПК (в комбинации с КМ или без) был проведен 198 (75%) больных, 66 не проводилась в связи с прогрессированием или отказа от лечения. Необходимыми условиями для выполнения высокодозной химиотерапии с последующей трансплантацией КПГ являлись: 1. наличие медицинских показаний; 2. получение достаточного количества гемопоэтического материала; 3. согласие больного. Больным со сбором более 2x106 CD34+/Kr трансплантация выполнялась либо только с использованием КПГ ПК, либо с добавлением костного мозга (комбинированный трансплантат). Комбинированный трансплантат в данной группе больных использовался только в начале 1990-х, когда существовали сомнения в способности КПГ ПК к стабильному, длительному восстановлению гемопоэза. Невыполнение трансплантации в данной группе было обусловлено только исчезновением медицинских показаний (прогрессирование заболевания, значительное ухудшение состояния; или отсутствие рецидива у больных, которым КПГ собирались заранее с целью трансплантации в случае рецидива), или отказом самого больного от высокодозной химиотерапии. У больных с меньшим сбором (менее 2x10 CD34+ клеток/кг) решение вопроса о проведения высокодозной химиотерапии и/или использование комбинированного трансплантата принималось индивидуально. Трансплантация КПГ ПК После окончания высокодозной химиотерапии, через временной интервал, необходимый для выведения цитостатиков, производилась трансплантация (реинфузия) ранее полученного гемопоэтического материала. Контейнер с трансплантатом размораживался в воде при температуре 37-38 С непосредственно перед введением больному. После полного размораживания трансплантат без дальнейшей обработки вводился больному внутривенно (через центральный венозный катетер) при помощи инфузионной системы без фильтра или шприца. От момента начала размораживания до окончания введения содержимого контейнера больного проходило не более 15 минут. Контроль за восстановлением гемопоэза и трансфузионная тактика.
В пострансплантационном периоде у больных определялся клинический анализ крови не реже 5 раз в неделю. При дальнейшем анализе временем до восстановления нейтрофилов более 0,5x109/л считался интервал от трансплантации до достижения указанного уровня нейтрофилов после прохождения надира (при условии, что данный уровень нейтрофилов не снижался при последующих определениях). Подавляющее большинство больных (92,4%) с 3-7 дня после проведения трансплантации, получали Г-КСФ в дозе 5 мгк/кг ежедневно до устойчивого восстановления уровня нейтрофилов 1х109/л.. Трансфузии тромбоцитов производились при их уровне менее 20x109/л. Под восстановлением уровня тромбоцитов понимался интервал времени от трансплантации КПГ до достижения уровня тромбоцитов более 20x109/л (при условии, что предыдущая трансфузия была произведена не менее чем за 48 часов от определения и уровень тромбоцитов не снижался в дальнейшем). Больные, не достигшие указанных уровней нейтрофилов и тромбоцитов до момента смерти или прекращения наблюдения, считались не восстановившими кроветворение при дальнейшем анализе.
