Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Туберкулез в современном мире 16
1.2. Туберкулез легких и сопутствующие заболевания 17
1.3. Антибактериальная терапия больных туберкулезом легких 21
1.4. Осложнения антибактериальной терапии у больных туберкулезом 22
1.5. Побочные реакции на препараты у больных туберкулезом с сопутствующими заболеваниями 26
1.6. Биотрансформация, фармакокинетика и фармакогенетика противотуберкулезных препаратов 28
1.6.1. Метаболизм и фармакокинетика противотуберкулезных препаратов 28
1.6.1.2. Метаболизм и фармакокинетика изониазида 29
1.6.1.3. Метаболизм и фармакокинетика пиразинамида 30
1.6.2. Влияние лекарств на ферментативную систему метаболизма ксенобиотиков и лекарственные взаимодействия при комбинированной терапии 30
1.6.3. Механизмы развития токсических реакций на изониазид ипиразинамид 31
1.6.4. Фармакогенетика противотуберкулезной терапии 33
Глава 2. Материал и методы исследования 38
2.1. Характеристика групп больных 38
2.2. Клинические и лабораторные методы обследования больных туберкулезом 40
2.2.1. Клинико-рентгенологическое обследование 41
2.2.2. Лабораторные методы обследования 41
2.3. Биохимические методы исследования 42
2.3.1. Реактивы и оборудование 42
2.3.2. Хроматографическое определение изониазида и пиразинамида в сыворотке крови больных туберкулезом 43
2.3.3. Оценка полиморфизма NAT2 44
2.4. Статистическая обработка результатов 47
Глава 3. Результаты исследований 49
3.1. Анализ частоты, характера и особенностей проявлений побочных реакций на противотуберкулезные препараты при разной кратности их приема у больных 49
3.2. Фармакокинетика изониазида и пиразинамида у больных туберкулезом легких. Взаимосвязь с развитием гепатотоксических реакций 68
3.2.1. Фармакокинетика изониазида 68
3.2.2. Анализ ассоциации фенотипов ацетилирования с гепатотоксическими и другими побочными реакциями на прием противотуберкулезных препаратов 72
3.2.3. Фармакокинетика пиразинамида 73
3.2.4. Соотношение биохимических маркеров развития гепатотоксических реакций с показателями фармакокинетики изониазида у больных I группы 76
3.3. Генетический полиморфизм NAT2 у больных туберкулезом легких и анализ ассоциаций полиморфных вариантов с гепатотоксическими реакциями у больных I и II групп 80
3.3.1. Связь биохимических показателей гепатотоксических реакций у больных I группы в динамике лечения с генотипами NAT2 86
3.3.2. Биохимические показатели лекарственного поражения печени у больных туберкулезом II группы в динамике лечения с учетом генотипов NA Т2 95
3.4. Сравнение активности биохимических маркеров лекарственного поражения печени у больных I и II групп 101
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 106
Выводы 118
Практические рекомендации 120
Список используемой литературы 121
- Туберкулез в современном мире
- Биотрансформация, фармакокинетика и фармакогенетика противотуберкулезных препаратов
- Клинические и лабораторные методы обследования больных туберкулезом
- Фармакокинетика изониазида и пиразинамида у больных туберкулезом легких. Взаимосвязь с развитием гепатотоксических реакций
Введение к работе
Актуальность проблемы. Длительный и непрерывный прием противотуберкулезных препаратов (ПТП), помимо лечебного эффекта, нередко оказывает отрицательное воздействие на организм человека [Соколова Г. Б. и соавт., 1998; Мишин В. Ю. и соавт., 2004, 2005; Ungo J. R. et al., 1998]. Это затрудняет лечение, заставляет прерывать его, а порой отказываться от него. Частота лекарственных осложнений у больных туберкулезом легких колеблется в широких пределах от 3-5 % до 80 % и более [Колпакова Т. А., 2002; Муминов Т. А. и соавт., 2002; Benabdelghaffar Н., 2005]. Большой диапазон частоты развития побочных реакций на ПТП объясняется различием наблюдаемых больных по возрасту, полу, сопутствующим заболеваниям, методикам лечения [Стадникова А. В., 2000; Шилова М. В. и соавт., 2005].
По выражению Н. В. Элыптейна [2001], современный пациент стал по-лиморбидным. Туберкулез часто развивается на фоне целого ряда хронических заболеваний, в частности, желудочно-кишечного тракта, бронхо-легоч-ной, эндокринной систем, алкоголизма, наркомании, у лиц, длительно принимающих кортикостероиды, цитостатики, а также у ВИЧ-инфицированных [Фролова О. П., 2001; Карачунскии М. А., 2002, 2004, 2006; Павлова Е. С, 2005; Свистунова А. С. и соавт., 2005; Halpern А. V. et al., 2003; Man М. et al., 2003].
В последние годы все чаще появляются сообщения о сочетании туберкулеза с хроническими вирусными гепатитами (ХВГ), что связано с непрерывным возрастанием частоты этих заболеваний [Толоконская Н. П., 1999; Убай-дуллаев А. М. и соавт., 2004, 2005; Петренко Т. И. и соавт., 2006].
По данным В. А. Краснова и соавт. [2003], специфические маркеры вируса гепатита в сыворотке крови больных туберкулезом выявляются в 25-30 раз чаще, чем у населения в целом. Лобзин Ю. В. и соавт. [2005], свидетельствуют, что ХВГ минимальной или слабовыраженной активности нередко сопровождаются поражением желудка и 12-перстной кишки, дисфункцией желчного пузыря и протоков, протекающими бессимптомно.
8 Взаимно отягощающее воздействие заболеваний, необходимость длительного использования ПТП, каждый из которых и их метаболиты могут привести к изменениям в системе детоксикации и метаболизма, создают условия для развития лекарственных осложнений [Колпакова Т. А., 2002; Гиль-берг И. С. и соавт., 2003; Мишин В. Ю. и соавт., 2004]. Данные большинства клинических исследований свидетельствуют о высокой частоте лекарственных осложнений у больных туберкулезом с клинически выраженной сопутствующей патологией [Новикова Т. И. и соавт., 2001; Чуканов В. И. и соавт., 2004; Мишин В. Ю. и соавт., 2004; Мусабекова Г. А., 2006]. Побочные эффекты ПТП в 2-3 раза чаще проявляются у больных туберкулезом с заболеваниями желудка и 12-перстной кишки, дисфункцией желчного пузыря и протоков, что представляет большую сложность их лечения, чем у больных без сопутствующих заболеваний [Кобак М. Э и соавт., 2003; Павлова Е. С, 2005; WadaM.etal., 1999].
Переносимость ПТП больными туберкулезом с сопутствующими латентно протекающими, хроническими вирусными гепатитами, заболеваниями пищеварительного тракта, желчевыделительной системы остается мало изученной.
В настоящее время в лечении больных туберкулезом используется как традиционный ежедневный прием ПТП, так и интермиттирующий 2-3 раза в неделю, с различными способами введения препаратов, разработанный сотрудниками Новосибирского НИИ туберкулеза и кафедры туберкулеза ФПК и ППВ НГМУ под руководством члена корреспондента РАМН, профессора И. Г. Урсова [Урсов И. Г. и соавт., 1979, 1983, 1994, 2001; Кононенко В. Г., 1975, 1998; Боровинская Т. А., 1983; Краснов В. А. и соавт., 2004]. Результаты клинических исследований В. Г. Кононенко [1998], И. Г. Урсова и соавт. [2001], свидетельствуют о более частом развитии побочных реакций на ПТП при их ежедневном приеме, чем при интермиттирующем у больных туберкулезом с сопутствующими заболеваниями, имеющими клинико-лабораторные проявления. Однако, частота развития, особенности проявлений лекарствен-
9 ных осложнений у больных туберкулезом с латентно протекающими хроническими вирусными гепатитами, заболеваниями пищеварительного тракта и желчевыделительнои системы ежедневном и интермиттирующем приеме противотуберкулезных препаратов остаются неизученными.
Данные об особенностях фармакокинетики ПТП при разной кратности их приема в неделю — при ежедневной и интермиттирующей, а также о роли генетических факторов в развитии лекарственных осложнений у больных туберкулезом легких с сопутствующими скрыто протекающими хроническими заболеваниями освещены в литературе недостаточны и противоречивы [Parkinson А., 2001; Huang Y. S., 2003]. Достигнутые успехи в изучении присутствия лекарств в организме человека свидетельствуют о важной роли метаболизма лекарств, его сильном влиянии на фармакокинетику [Parkinson А., 2001; WormhoudtL. W., 1999].
Активность ферментов метаболизма лекарств вариирует в пределах не-скольких порядков (10 -10 ) вследствие полиморфизма кодирующих их генов [Guengerich F., 2004]. Такая широкая межиндивидуальная вариабельность приводит к различиям в терапевтическом эффекте и в развитии лекарственных осложнений [Johnson J., 2003].
Изониазид — базовый препарат в лечении больных туберкулезом. N-ацетилтрансфераза 2 (NAT2) играет важную роль в метаболизме изониази-да, ген NAT2 является высокополиморфным. В последние годы, в связи с развитием высокопроизводительных методов выявления полиморфных вариантов генов, интенсифицировались работы, направленные на изучение возможности индивидуализации фармакотерапии больных туберкулезом на основе оценок генетического полиморфизма генов, участвующих в метаболизме противотуберкулезных препаратов [Ohno М. et al., 2000; Huang Y. S. et al., 2002; Kinzig-Schippers M. et al., 2005]. Получены результаты, порой противоречивы [Ohno М. et al., 2000; Huang Y. S. et al., 2002; Eichelbaum M. et al., 1992]. В литературе имеются указания на частое развитие побочные реакций на пиразинамид при его ежедневном приеме у больных туберкулезом с со-
10 ігутствующими заболеваниями [Wada M. et al., 1999; Wada M., 2001; Hest N. A. et al., 2002; Kukavica D. et al., 2005].
Однако, результаты цитированных выше работ не могут быть просто перенесены в целях прогнозирования лекарственных осложнений, на больных туберкулезом Западно-Сибирского региона. Для этого необходимы подобные оценки именно в этом контингенте, несущем все регионально-специфические особенности основного и сопутствующих заболеваний, генетической структуры популяции этого региона, и внешних воздействий.
Изучение роли фармакогенетических факторов, особенностей фарма-кокинетики ПТП при ежедневной и интермиттирующей терапии, сопутствующих скрыто протекающих хронических вирусных гепатиты и заболеваний пищеварительного тракта в развитии лекарственных осложнений в реальном потоке больных туберкулезом легких внесет вклад в обоснование индивидуализированного лечения, расширит возможности прогнозирования и профилактики лекарственных осложнений при проведении антибактериальной терапии.
Цель исследования
Обосновать возможность прогнозирования и предупреждения лекарственных осложнений у больных туберкулезом легких с сопутствующими скрыто протекающими хроническими вирусными гепатитами, заболеваниями пищеварительного тракта и желчевыделительной системы при ежедневном и интермиттирующем приеме противотуберкулезных препаратов на основе изучения их индивидуальных фармакокинетических и фармакогенетических характеристик.
Задачи исследования
1. Провести анализ частоты развития, характера и особенностей клинических проявлений побочных реакций на противотуберкулезные препараты при их ежедневном и интермиттирующем приеме у больных туберкулезом
11 легких с сопутствующими латентно протекающими хроническими вирусными гепатитами, заболеваниями пищеварительного тракта и желчевыдели-тельной системы.
Охарактеризовать генетический полиморфизм NAT 2 у больных туберкулезом с сопутствующими хроническими бессимптомно протекающими заболеваниями и оценить связь полиморфных вариантов с развитием побочных реакций на изониазид.
Оценить фармакокинетику изониазида у больных туберкулезом лёгких со скрыто протекающими хроническими заболеваниями и ассоциацию показателей элиминации препарата с развитием побочных реакций.
Оценить соответствие генотипов NAT2 с фенотипами ацетилирова-ния, сравнить силу ассоциации генетических и фармакокинетических показателей у наблюдаемых больных с развитием побочных реакций.
Оценить фармакокинетику пиразинамида у больных туберкулезом лёгких с сопутствующими скрыто протекающими хроническими заболеваниями и ассоциацию показателей элиминации с развитием лекарственных осложнений на препарат.
Научная новизна
Установлено, что больные туберкулезом легких с сопутствующими латентно протекающими хроническими вирусными гепатитами, заболеваниями желудочно-кишечного тракта и желчевыделительной системы являются группой риска по развитию побочных реакций, чаще токсических, в частности, гепатотоксических, как при ежедневном, так и при интермиттирующем приеме препаратов.
Показано, что гепатотоксические реакции чаще диагностируются у больных с ежедневным приемом противотуберкулезных препаратов, развиваются в ранние сроки от начала лечения, протекают более тяжело, длительно, требуют отмены препаратов и проведения комплексной корригирующей терапии, чем у больных с приемом препаратов 2 раза в неделю. Как при ежедневном, так и при
интермиттируїощем приеме антибактериальных препаратов, гепатотоксические реакции чаще развиваются на прием пиразинамида и на его сочетания с изониа-зидом и рифампицином. В обследованной выборке больных туберкулезом легких — европеоидов г. Новосибирска установлено следующее соответствие между генотипами NAT2 и фармакокинетическими показателями элиминации изо-ниазида. Генотипам NAT2*4/NAT2*4, NAT2*4/NAT2*7 в 100 % соответствует фенотип быстрого ацетилирования, а генотипам NAT2*5/NAT2*5, NAT2*5/NAT2*7 и NAT2*6/NAT2*6 — фенотип медленного ацетилирования. Генотипы NAT2*4/NAT2*5, NAT2*4/NAT2*6, NAT2*5/NAT2*6 распределены между фенотипами быстрого и медленного ацетилирования в соотношениях 8:2; 3:7; и 6:4, соответственно.
Установлено, что в клинических подгруппах более чувствительными к токсическому воздействию комплекса противотуберкулезных препаратов являются медленные ацетиляторы изониазида — носители аллелей NAT2*5 и NAT2*6. Повышенная чувствительность медленных ацетиляторов выявляется как посредством оценки генетического полиморфизма NAT2, так и фармако-кинетических оценок элиминации изониазида. Показано, что медленные ацетиляторы изониазида имеют более высокие уровни сывороточных активностей трансаминаз, даже если эти уровни находятся в границах клинической нормы.
Показано, что аллергические реакции чаще диагностируются у больных с заболеваниями пищеварительного тракта и желчевыделительной системы в обеих группах. Установлено, что отношение шансов (ОШ) для аллеля 857А имели высокие значения для аллергических (ОШ = 3,25; р = 0,381) и токсико-аллергических реакций (ОШ = 4,33; р = 0,374). Это указывает более высокий риск развития аллергических и токсико-аллергических реакций у носителей аллеля 857А в сравнении с носителями аллеля 857G.
Практическая значимость
Больные туберкулезом легких с сопутствующими скрыто протекающими хроническими вирусными гепатитами и заболеваниями пищеваритель-
13 ного тракта являются группой риска по развитию лекарственных осложнений независимо от кратности приема противотуберкулезных препаратов — ежедневно или 2 раза в неделю. Однако у больных с латентно протекающими хроническими вирусными гепатитами даже при приеме препаратов 2 раза в неделю регистрируется более частое лекарственное поражение печени, чем у больных с заболеваниями пищеварительного тракта. Наиболее высокий риск развития тяжело и длительно протекающих гепатотоксических реакций уже на первом месяце лечения отмечается у больных — медленных ацетиляторов по сравнению с быстрыми, при ежедневном приеме препаратов. Часто развивающиеся в процессе лечения больных туберкулезом с сопутствующими хроническими заболеваниями, токсические, в частности, гепатотоксические реакции, делают необходимым и перспективным применение методик генетического и фармакокинетического тестирования с целью возможного прогнозирования и предупреждения развития побочных реакций на ПТП.
Установленный высокий риск развития аллергических реакций у больных туберкулезом с сопутствующими скрыто протекающими заболеваниями пищеварительного тракта — носителей аллеля 8 57А, независимо от кратности приема препаратов в неделю, свидетельствует о необходимости индивидуального подхода к обследованию и лечению этой категории пациентов с целью предупреждения развития побочных реакций на препараты.
Применение пиразинамида и его сочетания с изониазидом и рифампи-цином связано с высоким с риском развития гепатотоксических реакций. Лечение больных туберкулезом легких с сопутствующими бессимптомно протекающими хроническими вирусными гепатитами, заболеваниями пищеварительного тракта требует индивидуализированного подбора препаратов.
Положения, выносимые на защиту
1. Латентно протекающие хронические вирусные гепатиты и заболевания пищеварительного тракта у больных туберкулезом легких являются факторами риска развития лекарственных осложнений в процессе лечения как
14 при интермиттирующем, так и при ежедневном приеме противотуберкулезных препаратов.
Токсические реакции, и из них гепатотоксические, наблюдаются чаще, чем аллергические и токсико-аллергические у больных туберкулезом легких с сопутствующими скрыто протекающими хроническими вирусными гепатитами, заболеваниями пищеварительного тракта независимо от кратности приема препаратов в неделю. При этом ежедневный прием противотуберкулезных препаратов, в сравнении с интермиттирующим, характеризуется наиболее высоким риском развития тяжело протекающего лекарственного поражения печени в течение первых трех недель лечения.
У больных туберкулезом с сопутствующими скрыто протекающими заболеваниями пищеварительного тракта аллергические реакции диагностируются чаще, чем у больных с хроническими гепатитами. Наиболее высокий риск развития аллергических и токсико-аллергических реакций определяется у носителей аллеля 857А в сравнении с носителями аллеля 857 G.
Комбинациям аллелей NAT2*4 и NAT2*7 соответствует фенотип быстрого, а аллелям NAT2*5 и NAT2*6 — медленного ацетилирования изониа-зида. Медленные ацетиляторы более подвержены гепатотоксическим реакциям по сравнению с быстрыми независимо от ежедневного или интермитти-рующего приема лекарств, что выявляется ассоциациями генотипов и фенотипов медленных ацетиляторов с более ранним и выраженным увеличением показателей биохимических маркеров гепатотоксических реакций.
Гепатотоксические реакции чаще развиваются на прием пиразина-мида и на его сочетание с изониазидом и рифампицином.
Внедрение в практику
Разработанные автором в диссертационном исследовании положения используются в практике клинических подразделений ФГУ Новосибирского НИИ туберкулеза. Результаты проведенного исследования используются в педагогическом процессе на кафедрах туберкулеза ФПК и ППВ и фтизио-
15 пульмонологии лечебного факультета Новосибирского государственного медицинского университета.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на девятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» [г. Санкт-Петербург, 2006], ежегодных конференциях студентов и молодых ученых «Авиценна 2006», «Авиценна 2007» [г. Новосибирск, 2006, 2007], научно-практической конференции с международным участием «3 International Conference Basic Science for Medicine September 2-8» [Novosibirsk 2007], «4th International Workshop on the Arylamine N-Acetyltrans-ferases, September 14-16» [Alexandropolis, Greece, 2007], на VIII Российском съезде фтизиатров [г. Москва, 2007].
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 1 — в центральной печати.
Структура и объем диссертации
Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 46 таблица, 9 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 273 источников: 156 отечественных и 117 иностранных авторов. Весь клинический материал, данного исследования собран, обработан и проанализирован лично автором.
Туберкулез в современном мире
В XXI век человечество вступило с высокой заболеваемостью туберкулезом [WHO Geneva 1999; 2007]. После благополучного периода 70-80-х годов распространенность этого заболевания возросла во всем мире [Хоменко А. Г., 1997; Хоменко А. Г. и соавт., 1999; Урсов И. Г., 1997; Урсов И. Г и соавт., 2003; Coldschmidt R. В., 2000; Nunn Paul., 2001]. Вновь диагностируются генерализованные, остропрогрессирующие формы, значительно возросла смертность от этого заболевания [Соколова Г. Б. и соавт., 1998; Баласанянц Г. С, 2000; Сафа-рян М. Д. и соавт., 2002; Галиуллин А. Н. и соавт., 2006; Михайлова Ю. В. и соавт., 2004; Кибрик Б. С. и соавт., 2004; Шилова М. В. и соавт., 2005; Цыбико-ва Э. Б. и соавт., 2007; Hopewell Р. С, 2002; Borgdorff М. W. et al., 2002]. Этому способствует ряд социально-экономических и медико-биологических факторов [Соколова Г. Б. и соавт., 2000; Стрелис А. К. и соавт., 2004; Шилова М. В. и соавт., 2005; Щепин О. П. и соавт., 2005]. Экономические потрясения, снижение жизненного уровня, психо-эмоциональные перегрузки, экологическое неблагополучие, интенсивные миграционные процессы приводят к развитию целого ряда хронических заболеваний, которые приводят к снижению защитных сил человека и повышению восприимчивости к любой инфекции, в том числе — туберкулезной [Шилова М. В., 2001; Стародубов В. И. и соавт., 2002; Онищенко Г. Г., 2003, 2005; Горбач Н. Н. и соавт., 2004; Ка-люкина А. С. и соавт., 2005; Dixie Е. et al., 1998; Arnadottir Thuridur., 2001].
В настоящее время разработаны и внедрены в практику здравоохранения разных стран мира глобальные и национальные программы по контролю за туберкулезом [Борисов С. Е., 2001; Жангиреев А. А. и соавт., 2000; Мишин В. Ю., 2000; Ерохин В. В. и соавт., 2004; Петренко В. П. и соавт., 2005; Левашев Ю. Н. и соавт., 2006;. Neurenberger Е. et al., 2005; Zaleskis R., 1999; Lixia W., 2004; Marica C. D. et al., 2005]. Они предусматривают раннее выявление туберкулеза среди населения, комбинированный подход к лечению больных, строгий контроль за приемом ПТП и меры профилактики [Корецкая Н. М., 2002; Иванова Л. А. и соавт., 2003; Мишин В. Ю. и соавт., 2005; Weil D. Е. С, 2000]. Однако, несмотря на предпринимаемые меры тенденции к значительному улучшению состояния по туберкулезу не отмечается. По наблюдениям специалистов в 2005-2006 гг., как и в предыдущие годы, пик заболеваемости туберкулезом приходился на молодые возрастные группы населения 25-45 лет независимо от пола [Шилова М. В. и соавт., 2006; Сазыкин В. Л. и соавт., 2006;. Цыбикова Э. Б. и соавт., 2007].
Немаловажную роль в распространении туберкулезной инфекции играют условия взаимодействия возбудителя, изменившего во многом свои свойства, и человека [Степашина В. Н. и соавт., 2000; Ерохин В. В., 2000; Саркисов Д. С, 2000; Перельман М. И. и соавт., 2001; Barry R. Bloom et al., 1998]. Все большее распространение получают штаммы микобактерий, устойчивых к противотуберкулезным препаратам [Мишин В. Ю. и соавт., 2002;. Норкина О. В. и соавт., 2003; Самойлова А. Г. и соавт., 2005; Ariel Pablos-Mendez, et al., 1998; Dixie E. et al., 1998; Mitarai S. et al, 2004], агрессивные, высоко вирулентные [Перельман М. И. и соавт 2001; Севастьянова Э. В. и соавт., 2002; Самойлова А. Г. и соавт., 2005], которые способны ускользать от защитного действия иммунного контроля организма [Новицкий В. В. и соавт., 2006]. Это ведет к накоплению контингентов больных лекарственно-устойчивым туберкулезом легких, и создает условия для формирования качественно нового резервуара резистентной к препаратам инфекции [Мишин В. Ю. и соавт., 2002; Press Release WHO, 2001].,
Значительная часть взрослых больных туберкулезом имеет сопутствующие заболевания [Шилова М. В., 2001; Шилова М. В. и соавт., 2005; Yamagishi F., 2001; Rajnjveanu R. М. et al., 2005]. Их частота колеблется от 16 % до 97 % и зависит от возрастно-полового, социального состава пациентов, краевой патологии [Гаврильев С. С. и соавт., 2001; Кобак М. Э. и соавт., 2003;
Карачунский М. А. и соавт., 2004; Елышн А. В. и соавт., 2005; Павлова Е. С, 2005]. Ситуация усугубляется ростом сочетанной инфекции: туберкулез и ВИЧ, туберкулез и хронические гепатиты [Фролова О. П. ,2001; Щелканова А. И. и соавт., 2002; Уварова Т. Е.,2003; Бабаева И. Ю. и соавт., 2006; Рахманова А. Г. и соавт., 2006; Евстигнеева И. С.,2007].
Структура сопутствующей туберкулезу патологии разнообразна, нередко у больных выявляется целый ряд заболеваний [Колпакова Т. А., 2002]. У больных туберкулезом старше 40 лет среди сопутствующих заболеваний значительное место занимают хронические неспецифические заболевания легких, патология сердечно-сосудистой системы [Дворецкий Л. И., 2000].
Возрастает число больных туберкулезом с сопутствующим сахарным диабетом [Jandrik К. et al., 2005]. По материалам последних эпидемиологических исследований заболеваемость туберкулезом у больных сахарным диабетом в пять раз, а болезненность в 15 раз выше, чем у остального населения [Карачунский и соавт., 2006]. Наиболее часто выявляемой патологией является язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, хронические гастриты [Павлова Е. С, 2005; Мусабекова Г. А., 2006; Wada М., 2001; Man М. et al., 2003].
По данным М. Э. Кобак и соавт. [2003], среди эндоскопически обследованных 495 больных с различными локализациями туберкулеза у 96 % была выявлена патология верхних отделов пищеварительного тракта. Чаще всего определялись воспалительные изменения слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки. В последние годы отмечается рост числа больных туберкулезом с сопутствующими хроническими гепатитами В и С, а также алкогольной и токсической болезнью печени, лечение которых представляет особую сложность [Шевченко А. А. и соавт., 2001; Лобзин Ю. М. и соавт., 2005; Петренко Т. И. и соавт., 2006; Bothamley G. et al., 1999; Iravani Y. M. et al., 2001; Pop С. M. et al., 2005].
Биотрансформация, фармакокинетика и фармакогенетика противотуберкулезных препаратов
Исторически качественные представления о пребывании лекарств и любых других ксенобиотиков в организме (disposition) сформировались ранее, чем количественные. Согласно современным представлениям, пребывание лекарства в организме включает следующие взаимосвязанные этапы: абсорбцию, распределение, воздействие на мишень, биотрансформацию и экскрецию/реаб-сорбцию [Rozman К. К., Klaassen С. D., 2001, Parkinson А., 2001, Gregus Z., Klaassen С. D., 2001]. Количественное описание всех этих этапов в их временной динамике применительно к концентрации химического соединения обозначается в клинической фармакологии термином «фармакокинетика». Фар-макокинетические оценки в настоящее время стали мощным инструментом исследования активности биологических систем организма человека.
Начиная с пятидесятых годов, клинические наблюдения [Biehl J. P., 1957, Mitchell R. S., Bell J. C, 1957] выраженных межиндивидуальных различий в эффектах изониазида у больных туберкулезом (а затем и других лекарств) и последовавшие вслед за этим генетические исследования выявили значительный вклад наследственности в контроль их диспозиции и эффектов.
В результате научного осмысления фактов, показывающих связь биохимической индивидуальности с необычными реакциями на продукты питания и лекарства, начатые еще в 1959 году, был предложен термин «фармакогенетика» для описания исследований роли генетических факторов в ответ на лекарственное воздействие [Garrod A., Vogel R, 1959]. Согласно данным Kalow W. et al. [1998], наследственность контролирует от 20 до 90 % вариабельности ответа на лекарственное воздействие. С клинической точки зрения среди перечисленных выше этапов диспозиции, каждый из которых влияет на выраженность токсического ответа, большой интерес представляет биотрансформация ксенобиотиков, потому что с ней связаны драматические индивидуальные различия в эффектах воздействия многих лекарств. В их основе лежит генетический полиморфизм ферментов данной системы [Wormhoudt L. W. et al., 1999, Parkinson A., 2001]. Поэтому именно система биотрансформации стала объектом нашего исследования.
Изониазид является базовым противотуберкулезным препаратом. В метаболизме препарата участвуют: N-ацетилтрансфераза 2 (NAT2) [Hickman D., 1995], амидаза [Sendo Т., 1984] и, по-видимому, цитохромы Р450 [Ono Y., 1998]. Ацетилирование является главным путем биотрансформации и резко снижает фармакологическую активность исходного лекарства [Evans D. А. Р., 1989]. Основной токсической активностью обладает гидразин, он образуется в результате гидролиза амидазой амидной связи непосредственно изониазида, либо ацетилизониазида и затем ацетилгидразина [Richards V. Е., 2004]. Ацети-лизониазид является ингибитором амидазы [Sendo Т. et al., 1984]. Цитохром Р450-зависимое окисление изониазида остается малоизученным. В пользу окисления свидетельствуют данные о наличии спектров связывания лекарства и его ингибиторные эффекты в метаболизме высокоспецифичных субстратов ряда индивидуальных форм цитохрома Р450 в микросомах печени человека: конкурентное ингибирование CYP2C19 (КІ = 25,4 ± 6,2 and 13 ± 2,4 мкМ), неконкурентное ингибирование CYP3A (Ki = 51,8 ± 2,5 до 75,9 ± 7,8 мкМ с разными субстратами, слабое неконкурентное ингибирование CYP2E1 (Ki = ПО ± ± 33 мкМ) и конкурентное ингибирование CYP2D6 (Ki = 126 ± 23 мкМ), CYP2C9, CYP1A2 (Ki более 500 мкМ) [Desta Z. et. al., 2001], CYP2C9 и CYP2E1 [Nishimura Y. et al., 2004], CYP 2A6 [Wen X. et. al., 2002]. Показатели элиминации изониазида сильно зависят от скорости основного пути метаболизма препарата — ацетилирования. Поскольку NAT2 является полиморфной, индивидуальные различия по периоду полувыведения (tl/2) варьируют в широких пределах, у быстрых ацетиляторов от 0,5 до 1,6 час, а у медленных ацетиляторов от 2 до 5 часов. Медианное значение tl/2 у быстрых ацетиляторов составляет 1,5 часа, а у медленных — 4 часа [Peloquin С. А., 2002].
3. Метаболизм и фармакокинетика пиразинамида
Другим препаратам, обязательным в лечении больных туберкулезом, является пиразинамид. В организме препарат превращается в 3 основных метаболита — пиразиновую кислоту и 5-гидроксипиразиновую кислоту под действием микросомальной амидазы и 5-гидроксипиразинамид и 5-гидроксимочевую кислоту (минорный метаболит) под действием ксантиноксидазы. Скорость лимитирующей является амидазная реакция [Lacroix С. et. al., 1989]. Фармакологически активной является 5-гидроксипиразиновая кислота, она образуется также в результате микобактериальной пиразинамидазы, никотинамидазы [Du X. et al., 2001]. Отмечены существенные возрастные различия в элиминации пиразинамид. У детей tl/2 составляет в среднем 3,5, а у взрослых — 6 час. [Zhu М. et al., 2002] или 9 часов [Peloquin С. А., 1997]. В популяции взрослых этот показатель варьирует в пределах 7,15 — 13,08 час. [Peloquin С. А., 1997].
Таким образом, для изониазида и пиразинамида этап метаболизма оказывает существенное влияние на фармакокинетику. В результате метаболизма либо исчезает изониазид, либо возникает фармакологическая активность пиразинамида, либо продуцируется токсичный метаболит гидразин и ацетил-гидразин из изониазида. Поэтому оценка генов и ферментов, участвующих в их метаболизме, имеет важное значение как для эффективности, так и безопасности терапии.
Клинические и лабораторные методы обследования больных туберкулезом
Для решения поставленных задач проводилась обследование больных, представленное в табл. 4. В работе представлены результаты исследований, выполненных в 2 этапа. Первый — клинический характеризуется анализом частоты развития, выявлением особенностей клинико-лабораторных проявлений лекарственных осложнений у больных туберкулезом легких с сопутствующими бессимптомно протекающими хроническими вирусными гепатитами, заболеваниями пищеварительного тракта и желчевыделительной системы при ежедневном и интермиттирующем (2 раза в неделю) приеме противотуберкулезных препаратов. Второй этап — биохимический характеризуется определением генетического полиморфизма NAT2 у наблюдаемых больных и выявлением связи полиморфных вариантов с развитием побочных реакций на изониазид, изучением фармакокинетики изониазида и пиразинами да во взаимосвязи с развитием побочных реакций, выявлением соответствия генотипов NAT2 фенотипам ацетилирования и определением силы ассоциации фармакокинетических и генетических показателей с биохимическими маркерами гепатотоксических реакций.
Клиническое обследование больных включало сбор анамнестических данных. Особое внимание уделялось сопутствующим туберкулезу заболеваниям — желудочно-кишечного тракта, гепато-билиарной, сердечно-сосудистой, бронхо-легочной, центральной и периферической нервной системы, ал-лергологическому статусу, приверженности к употреблению алкоголя, наркотических средств. При осмотре оценивалось состояние кожных покровов, слизистых. Осмотр, физикальное обследование и рентгено-томографическое исследование проводилось по общепринятой схеме.
Лабораторное обследование включало: общепринятые — общий анализ крови, мочи, мокроты, стандартная бактериологическое исследование материала на выявления микобактерий туберкулеза. Биохимические исследования — определение общего белка, его фракций, общего билирубина, ферментов сыворотки: АЛТ, ACT, ГГТП, а также ЩФ. проводились в биохимической лаборатории НИИ туберкулеза Росмедтехнологий на автоматизированном анализаторе Konelab 20 (Thermo Clinical Labsystems, Финляндия). Использовались биохимические наборы и контрольные материалы, реактивы фирмы Termolabsystem (Thermo Clinical Labsystems, Финляндия). Все пациенты были обследованы на наличие маркеров вирусных гепатитов В и С методом имму-ноферментного анализа (HBsAg, aHBsIgG, aHBsIgM, aHCVIgG, aHCVIgM) в лаборатории иммунологической диагностики НИИ туберкулеза (старший научный сотрудник, к. м. н. В. В. Романов). Дизайн исследования представлен в табл. 4.
В работе использовали ЭДТА, глицерин, трис-(оксиметил) аминометан, бромфеноловый синий («Sigma Chemical Co.», США); тритон Х-100, броми стый этидий («Merck», ФРГ); Р-меркаптоэтанол, формамид («Serva», ФРГ), хлористый магний, акриламид, N-метилен-бисакриламид, персульфат аммония, бычий сывороточный альбумин («Пика», Швейцария); агароза («Chemapol», Чехословакия); остальные реактивы производства «Реахим», квалификации ХЧ, ОСЧ, ЧДА. Ферменты: Taq ДНК-полимераза («Сибэнзим», Россия), про-теиназа К (Merk, ФРГ). Эндонуклеазы рестрикции BamHI, Bst2UI, Kpnl, TaqI, («Сибэнзим»). Олигонуклеотиды были синтезированы в ООО Лаборатория «Медиген».
С пациентами проводилось предварительное собеседование, разъяснение методики. При интермиттирующей схеме терапии обследуемый в 9 ч 30 мин утра после завтрака принимал пиразинамид, внутрь, запивая 0,5 стакана воды. В 10 часов утра больному проводили венепункцию и отбирали 5 мл крови из вены, после чего внутривенно капельно в течение 40 минут вводили изониазид в дозе 12 мг/кг. Дальнейший забор крови проводился в 10 ч 40 мин после прекращения введения препарата через 40 мин, 3 час 20 мин, 7 час 20 мин и 24 час утра следующего дня. При ежедневном приеме препаратов в 9 часов больному проводили венепункцию и отбирали 5мл крови из вены. Через 1 час после завтрака, в 10 часов утра, больной принимал изониазид, пиразинамид, рифампицин, этамбутол, запивая 0,5 стакана воды. Дальней-ший забор крови проводился в 11ч, 12 ч, в 14 часов, в 16 часов, 18 часов, в 22 часа и через сутки — в 10 часов утра следующего дня.
Хроматографические измерения проводились на базе лаборатории метаболизма лекарств и фармакокинетики ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН с участием сотрудников Полянской Е. В. и Кудряшова А. В. В работе использовали автоматизированный хроматографический комплекс Gilson (США), который включал два насоса Gilson 304 и 305, автосэмплер LS 3200, детектор с переменной длиной волны Linear UVIS 200 (США). Управление комплексом и обработка хроматографических данных осуществлялись компьютерной программой GME 712. Нами был применен метод градиентной ион-парной обращенно-фазовой хроматографии, разработанный для разделения INH и AcINH, пиразинамида и пиразиноевой кислоты к. х. н., с. н. с. Кожановой Л. А. (Институт хроматографии «Эконова»). Аналитической колонкой служил Нуклеосил Cis 5 мкм 100 х 2 мм. Мобильная фаза А включала 0,06 % трифторуксусную кислоту и 5,5 мМ гептилсульфонат, фаза Б — 0,06 % трифторуксусную кислоту, 5,5 мМ гептилсульфонат и 54 % аце-тонитрил. Подготовку проб сыворотки крови к хроматографии осуществляли следующим образом. В пробирку типа Эппендорф помещали 250 мкл сыворотки и добавляли 125 мкл 15 % трихлоруксусной кислоты, тщательно встряхивали на вихревом смесителе «Vortex» и центрифугировали 10000 об/мин х5 мин на центрифуге MiniSpin (Eppendorf). Отбирали 250 мкл супернатанта и добавкой 14-16 мкл 10N КОН устанавливали рН пробы в интервале 3-6. Затем пробы вновь центрифугировали 12000 об/мин х5 мин на центрифуге MiniSpin и 230 мкл супернатанта загружали в виалы автосэмплера. На колонку наносили 5 мкл пробы. Типичная хроматографиче-ская картина проб сыворотки крови представлена на рис. 1-2. Можно видеть, что имеет место базовое разделение исходных лекарств — изониазид и пиразинамида.
Фармакокинетика изониазида и пиразинамида у больных туберкулезом легких. Взаимосвязь с развитием гепатотоксических реакций
Предварительная оценка выявила несоответствие распределения величин многих фармакокинетических показателей нормальному типу как в подгруппах, так и во всей группе I. Поэтому в их анализе применяли непараметрические методы статистической обработки. Показатели описательной статистики представлены в табл. 16.
Сравнение величин фармакокинетических показателей в подгруппах не выявило статистически достоверных различий ни во множественных сравнениях с использованием критерия Краскела-Уоллеса, ни в парных сравнениях с использованием критерия Манна-Уитни. Поэтому были рассчитаны показатели для всей группы 1 в целом (табл. 17). Как и в подгруппах, они отличались от нормального распределения у всех показателей, за исключением Со Распределение величин показателей элиминации изониазида (Kel, tl/2, СІ) имело бимодальный характер, поэтому были определены положения ан-тимод (на рисунках обозначены стрелками) для классифицирования пациентов как быстрых и медленных ацетиляторов. Границами между медленными и быстрыми ацетиляторами являлись значения Kel 0,2 час"1 (рис. 6), tl/2 3,2 часа (рис. 7) и О 3,5 мл/мин/кг (рис. 8).
Доля медленных ацетиляторов изониазида в группе I составила 63,5 % (33 чел), быстрых — 36,5 % (19 чел). Фармакокинетические параметры элиминации изониазида в этих подгруппах имели статически достоверные различия (табл. 18).
Таким образом, фармакинетика изониазида у обследованных больных І группы позволяла выделить фенотипы МА и БА, которым соответствовали имевшие статически достоверные различия показатели элиминации изониазида, что делало возможным поиск фенотипов связи индивидуальных особенностей метаболизма изониазида с развитием гепатотоксических реакций.
На основании полученных границ между модами больные были разделены на быстрых и медленных ацетиляторов по величинам клиренса и проанализирована ассоциация этих фенотипов с развитием побочных реакций у больных в процессе приема ПТП. Результаты оценки свидетельствуют о том, что в данной группе больных эффекты статуса ацетилирования являются слабыми и не достигают статистической достоверности (табл. 19).
Известным побочным эффектом изониазида является нейротоксич-ность, особенно у медленных ацетиляторов [Evans D. А. Р. 1989]. Однако анализ риска развития этого осложнения в обследованной группе не выявил достоверных ассоциаций. Вероятно, ослабление эффекта фенотипа МА может объясняться как профилактическим назначением витаминов группы В, так и режимом дозирования ПТП. Еще одним видом побочных реакций, с которым может быть ассоциирован статус ацетилирования, являются аллергические осложнения. Результаты анализа показывают, что среди обследованных они чаще возникали у медленных ацетиляторов, ассоциация была близка к статистической достоверности (табл. 20).
Таким образом, анализ фармакокинетики изониазида в интермитти-рующим режиме у больных туберкулезом легких выявил 63,5 % медленных и 36,5 % быстрых ацетиляторов, что находится в близком соответствии с данными литературы об их распределнии в популяциях европеоидов [Kalow W. 1991]. Анализ ассоциации этих фенотипов с гепатотоксическими реакциями, диагностированными по совокупности клинических симптомов и лабораторных показателей, не обнаружил достоверных связей.
Предварительная оценка фармакокинетических показателей пиразинамида выявила несоответствие распределения величин нормальному типу в подгруппах, поэтому в анализе применяли непараметрические методы статистической обработки. Сравнение величин фармакокинетических показателей в подгруппах не выявило статистически достоверных различий ни во множественных сравнениях с использованием критерия Краскела-Уоллеса, ни в парных сравнениях с использованием критерия Манна-Уитни.
Поэтому фармакокинетические показатели были объединены для всей I группы и после повторной проверки распределения на нормальность произведены расчеты соответствующих показетелей (табл. 21).
Полученные величины показателей отражают более высокую скорость элиминации пиразинамида в сравнении с той, что наблюдалась в работе [Peloquin С et al., 1997]. Различия, возможно, обусловлены тем, что в работе этих авторов концентрации пиразинамида определялись в течение 36 час, а не 24 час, как в нашей работе.
