Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Распространенность ОКИ у детей 15
1.2. Вопросы этиологии ОКИ у детей 16
1.3. Вопросы патогенеза ОКИ условно патогенной этиологии у детей 18
1.4. Роль факторов патогенности К. pneumonia в развитии ОКИ 22
1.5. Антибиотикоустойчивость клинических штаммов К. pneumonia 27
1.6. Факторы патогенности и антибиотикоустойчивость S. aureus 28
1.7. Клинические особенности ОКИ у детей 29
1.8. Особенности нарушений микробиоценоза кишечника у больных ОКИ 34
1.9. Варианты иммунопатогенеза ОКИ у детей 35
1.10. Современные методы лечения ОКИ у детей 39
1.11. Формулировка вопросов, подлежащих исследованию 44
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Общая характеристика больных ОКИ 45
2.2. Методы исследования 46
2.2.1. Методы клинического и лабораторного исследования больных 46
2.2.1.1. Принципы отбора больных 46
2.2.1.2. Особенности сбора анамнеза и физикального обследования больных ОКИ первого года жизни 48
2.2.1.3. Лабораторные методы обследования больных ОКИ 49
2.2.1.4. Этиологические методы диагностики ОКИ у детей 50
2.2.1.4.1. Бактериологический метод диагностики ОКИ у детей 50
2.2.1.4.2. Диагностика вирусной этиологии ОКИ 51
2.2.1.4.3. Серологические методы диагностики ОКИ у детей 51
2.2.1.4.4. Бактериологическое исследование грудного молока матерей больных детей 51
2.2.1.5. Методы исследования факторов общего и местного иммунитета у больных ОКИ первого года жизни 52
2.2.1.5.1. Методы исследования факторов общего иммунитета у больных детей 52
2.2.1.5.2. Методы исследования факторов местного иммунитета у больных ОКИ первого года жизни 53
2.2.2. Микробиологические и молекулярно-генетические методы исследования патогенности К. pneumonia и S. aureus, вызывающих ОКИ у детей первого года жизни 53
2.2.2.1. Микробиологические методы исследования признаков, связанных с факторами патогенности К. pneumonia и S. aureus 53
2.2.2.1.1. Исследование скорости роста клинических штаммов Крпеитота на искусственных питательных средах 54
2.2.2.1.2. Исследование интенсивности капсулообразования клинических штаммов К. pneumonia на искусственных питательных средах 54
2.2.2.1.3. Методика оценки ауто- и гомоантагонистической активности клинических штаммов К. pneumonia 55
2.2.2.1.4. Исследование антибиотикочувствительности штаммов К.рпеитота, выделенных от больных ОКИ 55
2.2.2.1.5. Исследование способности клинических штаммов Kpneumoniae к экспрессии фимбрий 1-го типа 56
2.2.2.1.6. Исследование антибиотикочувствительности штаммов S. aureus, выделенных из фекалий больных ОКИ первого года жизни 56
2.2.2.2. Молекулярно-генетические методы исследования факторов патогенности К. pneumonia 57
2.2.3. Микробиологические методы оценки активности индигенной лактофлоры больных ОКИ и производственных штаммов пробиотиков на основе лактобацилл 59
2.2.3.1. Микробиологические методы оценки типа метаболизма клинических штаммов индигенной лактофлоры 59
2.2.3.2. Методика оценки ауто- и гомоантагонистической активности индигенной лактофлоры больных ОКИ и производственных штаммов пробиотиков на основе лактобацилл 59
2.2.3.3. Методика исследования антагонизма лактосодержащих пробиотиков и индигенной лактофлоры к клиническим изолятам К. pneumoniae 60
2.2.4. Микробиологические методы выбора бактериальных пробиотиков для повышения эффективности лечения больных ОКИ 60
2.2.5. Микробиологические методы исследования антибиотикоустойчивости пробиотиков на основе лактобацилл 64
2.3. Методы терапии больных ОКИ и оценка их эффективности 65
2.3.1. Традиционные схемы лечения больных ОКИ 65
2.3.2. Схемы лечения больных ОКИ с использованием пробиотиков на основе лактобацилл в остром периоде заболевания 66
2.3.3. Методы оценки эффективности терапии больных ОКИ 68
2.4. Методы простого и многомерного статистического анализа результатов исследования 68
Глава 3. Анализ этиологической структуры и клинических особенностей ОКИ у детей первого года жизни 70
3.1. Особенности этиологической структуры ОКИ у детей первого года жизни 70
3.2. Характеристика преморбидного фона и клинических особенностей ОКИ у детей первого года жизни 73
3.2.1. Характеристика преморбидного фона у больных ОКИ 73
3.2.2. Особенности клиники и лечения ОКИ у детей первого года жизни 78
3.3. Состояние микробиоценоза кишечника у больных ОКИ первого года жизни 106
3.4. Состояние неспецифической резистентности у больных ОКИ первого года жизни 110
3.5. Состояние местного иммунитета у больных ОКИ по данным исследования иммуноглобулина А в сыворотке крови и секреторного иммуноглобулина А в копрофильтратах 112
Глава 4. Результаты исследования факторов патогенности условно патогенных возбудителей ОКИ у детей первого года жизни 115
4.1. Результаты микробиологического исследования признаков, коррелирующих с факторами патогенности К. pneumonia 115
4.2. Результаты изучения клинических изолятов К. pneumonia и S.aureus на антибиотикочувствительность 116
4.2.1. Результаты изучения клинических изолятов К. pneumonia из фекалий больных ОКИ на антибиотикочувствительность 116
4.2.2. Результаты изучения клинических изолятов S. aureus на антибиотикочувствительность 118
4.3. Результаты микробиологических исследований способности К. pneumoniae к экспрессии фимбрий 1-го типа 119
4.4. Результаты ПЦР анализа области регуляции фимбрий 1-го типа и генов, кодирующих факторы патогенности клинических изолятов К. pneumoniae 121
Глава 5. Результаты изучения механизмов лечебного действия лактосодержащих пробиотиков 124
5.1. Результаты микробиологической оценки типа метаболизма клинических штаммов индигенной лактофлоры 124
5.2. Результаты изучения in vitro ауто- и гомоантагонистической активности индигенной лактофлоры больных ОКИ и производственных штаммов пробиотиков на основе лактобацилл 124
5.3. Результаты изучения in vitro антагонизма лактосодержащих пробиотиков и индигенной лактофлоры к клиническим изолятам К. pneumoniae 126
5.4. Результаты изучения in vitro контрантагонизма К. pneumonia к пробиотическим и индигенным штаммам лактофлоры 127
5.5. Результаты изучения in vitro биосовместимости пробиотиков с индигенной лактофлорой 128
5.6. Результаты изучения устойчивости пробиотических лактобацилл к антибиотикам 129
Глава 6. Клиническая эффективность новых пробиотиков, содержащих лактобациллы (витафлор, лактобактерин жидкий, биобактон), в терапии ОКИ у детей первого года жизни 131
6.1. Клиническая характеристика больных ОКИ первого года жизни, получавших разные схемы терапии 131
6.2. Клиническая эффективность лечебных комплексов с использованием лактосодержащих пробиотиков в терапии ОКИ у детей первого года жизни 135
6.3. Оценка влияния лактосодержащих пробиотиков, используемых в комплексной терапии ОКИ, на элиминацию возбудителя, динамику молочнокислой флоры, микробиоценоз кишечника 148
6.4. Оценка влияния лактосодержащих пробиотиков, используемых в комплексной терапии ОКИ у детей первого года жизни, на состояние неспецифической резистентности и местного иммунитета 159
6.5. Прогнозирование исходов лечения больных ОКИ первого года жизни 161
Глава 7. Обсуждение результатов 166
Выводы 190
Практические рекомендации 192
Библиографический список 193
Приложения 218
Приложение 1 218
Приложение 2 226
Приложение 3 230
Приложение 4 240
- Роль факторов патогенности К. pneumonia в развитии ОКИ
- Особенности клиники и лечения ОКИ у детей первого года жизни
- Результаты ПЦР анализа области регуляции фимбрий 1-го типа и генов, кодирующих факторы патогенности клинических изолятов К. pneumoniae
- Клиническая эффективность лечебных комплексов с использованием лактосодержащих пробиотиков в терапии ОКИ у детей первого года жизни
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной ш важных проблем педиатрии является высокий уровень инфекционных заболеваний у детей, в том числе у детей раннего возраста. Особую опасность вызывают острые кишечные инфекции (ОКИ) в связи с высокой распространенностью и социальной значимостью (Учапкин В.Ф. и др., 2003; O'Ryan М. et al., 2005; McCabe-Sellers B.J., Beattie S.E., 2004).
До настоящего времени остаются недостаточно изученными особенности клинической картины ОКИ у детей первого года жизни; изменения реакций иммунной системы в зависимости от этиологических форм кишечных инфекций (Тихомирова О.В. и др., 2009; Жеребцова Н.Ю. и др., 2006; Новокшонов А.А. и др., 2004; Габараева З.Г, 2002). Современные представления о значении микроэкологических нарушений кишечника при ОКИ не однозначны (Железова Л.И., 2006).
Продолжается обсуждение принципов лечения среднетяжелых и легких форм
ОКИ у детей, при этом рекомендуется ограничение использования
антибиотиков и химиотерапевтических средств (Колоколов В.А. и др., 2004;
Тихомирова О.В. и др., 2004; Учайкин В.Ф. и др., 2001). Все более актуальной
становится микробная терапия - использование в моно- и комплексной терапии
ОКИ пробиотиков, оказывающих комплексное корригирующее воздействие на
макроорганизм (Лобзин Ю.В. и др., 2006; Руш К., Руш. Ф., 2003).
Эффективность микробной терапии зависит от выраженности
антагонистических свойств пробиотиков по отношению к конкретным патогенным и условно патогенным бактериям. Пробиотические штаммы не должны обладать антагонизмом к облигатной флоре пациента и должны противостоять факторам патогенности болезнетворных микробов (Петров Л.Н. и др., 2008; Младзиевская Ю.А., 2005; Глушанова Н.А., 2005). Получены данные о сложном, в том числе иммуномодулирующем действии пробиотиков, особенно содержащих лактобацилды (Зорина В.В. и др., 2004; Хорошіиюва Н.В., 2003; Oh S. et al., 2000), поэтому их назначение у детей с ОКИ патогенетически обосновано (Воротынцева Н.В., Мазанкова Л.Н., 2001). При этом изменения местного и общего иммунитета при ОКИ у детей грудного возраста, возникающие, в том числе под влиянием терапии с использованием пробиотиков, остаются мало изученными; не разработаны четкие критерии дифференцированного назначения пробиотиков.
Таким образом, проведение исследований, направленных на клинико-патогенетическое обоснование дифференцированного назначения пробиотиков на основе лактобацилл в комплексной терапии ОКИ у детей первого года жизни является актуальным и необходимым для улучшения исходов лечения, профилактики затяжного течения инфекции.
Цель исследования: на основании изучения клинико-патогенетических особенностей ОКИ у детей грудного возраста разработать тактику рационального использования пробиотиков, содержащих лактобациллы.
Задачи исследования:
-
Уточнить этиологическую структуру и клинические особенности ОКИ у детей первого года жизни в условиях инфекционного отделения многопрофильного детского стационара.
-
Оценить степень нарушений микробиоценоза кишечника у больных ОКИ первого года жизни и особенности этих нарушений в зависимости от этиологии заболевания; изучить состояние неспецифической резистентности и местного иммунитета у больных ОКИ.
-
Исследовать микробиологические и молекулярно-генетические факторы патогенності! условно патогенных возбудителей ОКИ (К. pneumoniae. S. aureus).
4. Изучить механизмы лечебного действия пробиотиков (явления
бактериального антагонизма, антибиотикорезистентность).
5. Определить клиническую эффективность новых пробиотиков, содержащих
лактобациллы (Витафлор, Лактобактерин жидкий, Биобактои), в терапии ОКИ
у детей первого года жизни; разработать тактику дифференцированного
использования пробиотиков в терапии ОКИ у детей грудного возраста.
Научная новизна исследования
Уточнена этиологическая структура ОКИ у детей первого года жизни, находившихся на лечении в инфекционном отделении многопрофильного педиатрического стационара: ОКИ условно патогенной этиологии - 48,3%; ОКИ вирусной этиологии - 41,7% (среди детей старше 3-х мес); ОКИ патогенной бактериальной этиологии (12,7%); ОКИ неуточненной этиологии (17,8%)). Клиническими особенностями ОКИ условно патогенной этнологии в отличие от ОКИ вирусной этиологии и ОКИ патогенной бактериальной этиологии являются менее тяжелые проявлениями интоксикации и затяжное течение.
Выявлены выраженные дисбиотические расстройства кишечника у 77,3% больных ОКИ условно патогенной этиологии в остром периоде заболевания, отмечено сохранение их в периоде ранней реконвалесценции у 67,9% детей. Установлена высокая частота клебсиеллеза у больных ОКИ условно патогенной этиологии. Подтверждена патогенность штаммов клебсиелл, выделенных у больных ОКИ первого года жизни.
Доказано преимущество Витафлора перед другими лактосодержащими пробиотиками по антагонистической активности к К. pneumoniae и преимущество Биобактона по биосовместимости с аутоштаммами лактофлоры больных ОКИ первого года жизни.
Определена тактика дифференцированного применения новых пробиотиков на основе лактобацилл в составе программ терапии ОКИ у детей первого года жизни, предполагающая назначение Витафлора в остром периоде заболевания, а Биобактона - в периоде реконвалесценции.
Научно-практическая значимость исследования
Уточнены неблагоприятные факторы анамнеза жизни, способствующие снижению общей иммунологической резистентности и повышающие риск
возникновения ОКИ условно патогенной этиологии и ОКИ вирусной этиологии у детей первого года жизни.
Доказана необходимость проведения микробиологических исследований антагонистической активности бактериальных пробиотических препаратов против возбудителей ОКИ, изучения устойчивости пробиотических штаммов к контрантагонизму возбудителей инфекционного процесса и биосовместимости их с индигенной микрофлорой конкретного больного для обоснованного выбора пробиотика на каждом этапе болезни с целью достижения полноценной реконвалесценции.
На основе изучения динамики клинической картины и состояния микробиоценоза кишечника разработаны дифференцированные подходы к использованию отечественных пробиотиков на основе лактобацилл в составе лечебных комплексов при ОКИ у детей первого года жизни. Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в практику работы СПб ГУЗ ДГБ №1; клиники детских болезней им. М.С. Маслова ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. СМ. Кирова МО РФ»; отделения кишечных инфекций ФГУ «НИИДИ РФ». Результаты исследования применяются в учебном процессе на кафедре детских болезней ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. СМ. Кирова МО РФ» при проведении лекционных и практических занятий для слушателей академии, врачей факультета повышения квалификации; в учебном процессе ФГУ «НИИДИ РФ» при проведении лекционных занятий с клиническими ординаторами. Публикации. По теме диссертации опубликовано: 15 печатных работ, в том числе - 2 в реферируемых журналах, 11 - в материалах научных конференций, 2 - методические рекомендации для врачей. Получены приоритетные справки на изобретения: «Способ лечения острых кишечных инфекций у детей грудного возраста» № 2008105255 от 12.02. 2008; «Способ прогнозирования успешности лечения острых кишечных инфекций, вызванных условно патогенными микроорганизмами, у детей первого года жизни» № 2009115069 от 20.04.2009. Апробация работы. Основные положения диссертации заслушаны, обсуждены и одобрены на заседаниях: Российской научной конференции «Педиатрия: из XIX в XXI век» (СПб, 2005); междисциплинарной научно-практической конференции стран СНГ, посвященной 120-летию общества детских врачей России (СПб, 2006); 8-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2006»; 6-й Российской научной конференции «Актуальные вопросы детской гастроэнтерологии и питания» (СПб, 2006); 1-м Междисциплинарном конгрессе «Ребенок и лекарство» (СПб, 2006); 1-й Междисциплинарной конференции по акушерству, перинаталогии, неонаталогни «Здоровая женщина - здоровый новорожденный» (СПб, 2006); Международном конгрессе «Пробиотики, нребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» (СПб, 2007); 9-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2007»; городской научно-практической конференции, посвященной 30-летнему юбилею Детской городской больницы
№1 (СПб, 2007); 11-ом Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2009».
Личный вклад автора. Автором самостоятельно проведен клинико-диагностический и терапевтический мониторинг 118 детей первого года жизни, больных ОКИ в динамике заболевания и через месяц после выписки из стационара. Собраны данные из первичной медицинской документации. Результаты обследования внесены автором в индивидуальные карты пациентов и компьютерную базу данных. Доля участия автора в накоплении, обобщении и анализе материала составляет более 90%.
Положения, выносимые на зашиту
-
ОКИ условно патогенной этиологии занимают одно из ведущих мест в этиологической структуре ОКИ у детей первого года жизни. В отличие от инфекции, обусловленной возбудителями вирусной или патогенной бактериальной природы, ОКИ условно патогенной этиологии характеризуются менее тяжелыми клиническими проявлениями и затяжным течением на фоне сохранения нарушений биоценоза кишечника.
-
Клебсиеллез как моноинфекция или как микстинфекцня при сочетании с золотистым стафилококком - основная этиологическая форма ОКИ условно патогенной этиологии у детей первого года жизни, что обусловлено наличием множества факторов патогенності! К. pneumoniae и S. aureus.
-
Рациональная терапия ОКИ у детей первого года жизни предусматривает использование пробиотических препаратов на основе лактобацилл соответственно выраженности их антагонистической активности против возбудителей ОКИ, устойчивости к контрантагонизму возбудителей инфекции и биосовместимости с иидигеииой микрофлорой пациента, установленных микробиологическими исследованиями.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 243 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 50 рисунками и 44 таблицами. Библиография включает 217 источников, из них 73 - на иностранных языках.
Роль факторов патогенности К. pneumonia в развитии ОКИ
Клебсиеллы являются факультативными представителями нормофлоры семейства Enterobacteriaceae. Факт их выделения из клинического материала не всегда может расцениваться как доказательство этиологической значимости. Необходимы подтверждения патогенности выделенных штаммов.
Патогенность - полидетерминантный признак, определяемый совокупностью различных свойств или факторов патогенности, обусловливающих развитие в макроогранизме патологических изменений [Бондаренко В.М. и др., 2008]. Выделяют четыре группы факторов патогенности микроорганизмов. Первая группа обеспечивает избирательное взаимодействие бактерий с рецепторами эпителиоцитов с последующей колонизацией. У патогенных энтеробактерий адгезины представлены поверхностными фимбриями и завитками или ассоциированы с нефимбриальными структурами: белками наружной мембраны, мукоидом полисахаридной капсулы, липосахаридами клеточной стенки.
Вторая группа факторов патогенности обеспечивает устойчивость микробов к иммунным механизмам макроорганизма. У патогенных энтеробактерий эта группа представлена поверхностными О-, К- и V-антигенами, белками наружной мембраны, IgA-протеазой, антилизоцимным фактором, альфа-гемолизином, антилактоферритином [Бондаренко В.М. и др., 1989]. К третьей группе факторов патогенности относят бактериальные модулины, индуцирующие синтез медиаторов воспаления, в том числе противо- и провоспалительных цитокинов. У патогенных энтеробактерий данная группа представлена липополисахаридом (эндотоксином), фимбриальными и поверхностными белками, поринами, суперантигенами с токсическими свойствами.
Четвертую группу составляют токсины и токсические продукты. У клебсиелл наличие фимбрий часто коррелирует с гемаглютинирующей способностью [Podschun R. et al., 2001]. Бактерии рода Klebsiella могут обладать четырьмя типами гемагглютининов: MS (фимбрий I типа); MR/K (фимбрий III типа); MR/E (Escherichia-like фимбрий); MR/P {Proteus-like фимбрий). MS-фимбрии обнаружены у представителей 9 родов семейства Enterobacteriaceae [Sebghati Т.А. et al., 1998]. Фимбрий I и III типов являются значимыми не только для адгезии клебсиелл на эпителии слизистой оболочки, но и для формирования возбудителем биопленки на плотных поверхностях [Ong C.L. et al., 2008; Suescun A.V. et al., 2006; Witkowska D. et al., 2005]. MS-адгезины выявляются практически у всех штаммов К. pneumonia, MR-адгезины - у 65 - 89% штаммов, одновременное выявление MS- и MR-адгезинов отмечается у 17,5 — 73,5% штаммов. Капсула защищает К. pneumonia от фагоцитоза и естественной бактерицидной активности сыворотки крови человека [Schembri М.А. et al., 2005]. Обсуждается вопрос о взаимодействии капсулы и фимбрий I типа [Matatov R. et al., 1999; Tarkkanen A.M. et al., 1992]. Большинство исследователей считают, что активно функционирующие фимбрий I типа у клебсиелл препятствуют коэкспрессии полисахаридной капсулы, а штаммы, обладающие выраженной капсулой, лишены функционально активных фимбрий. Однако с помощью электронной микроскопии было показано, что фимбрий прорастают капсулу, т.е. капсула не препятствует адгезии [Гостева В.В. и др., 1984].
Адгезия энтеробактерий на энтероцитах может быть связана с АЕ-активностью (от англ. Attaching/Effacing), которая приводит к изменению мембранного потенциала клетки, активирует протеинкиназу С, тирозинкиназу, инозитолфосфатазу, повышает секрецию хлоридов и клеточную проницаемость. АЕ-активность была выявлена у некоторых диареегенных штаммов К. pneumonia [Guerin F. et al., 1998]. В защите макроорганизма от инфекции имеют значение факторы врожденного иммунитета, в частности, Toll-подобные рецепторы (TLR) [Rakoff-Nahoum S. et al., 2004; Stagg AJ. et al., 2003]. TLR-3 взаимодействуют с ds RNA, TLR-4 - с липополисахаридом грамотрицательных бактерий. При обнаружении чужеродного антигена клетками эпителия слизистых оболочек синтезируются про- и противовоспалительные цитокины, при этом в отдельных случаях может происходить увеличение количества рецепторов, облегчающих колонизацию грамотрицательной флорой, в том числе клебсиеллами [Ковальчук Л.В. и др., 2005].
К факторам патогенности клебсиелл, противостоящим защитным механизмам макроорганизма, относится капсула, предохраняющая от лизирующего действия комплемента и фагоцитов. Установлена высокая вирулентность штаммов К. pneumonia К2-серотипа [Kabha К. et al., 1995]. Для проявлений вирулентности имеет значение не только наличие капсулы, но и ее размеры [Yoshida К. et al., 2000]. Предполагают, что часть капсульного полисахарида в процессе роста капсульных штаммов К. pneumonia выделяется в среду. Свободный капсульный полисахарид может нейтрализовывать специфические опсонизирующие антитела. Эффект бактериальных модулинов реализуется в ходе связывания возбудителя с кишечным , эпителием: эпителиоциты вырабатывают провоспалительные цитокины, а липополисахарид индуцирует экспрессию молекул адгезии. Провоспалительные цитокины и молекулы адгезии активируют нейтрофилы, макрофаги, эозинофилы, стимулируют выход лейкоцитов из сосудов и воспалительную инфильтрацию кишечной стенки [Мавзютов А.Р. и др., 2007; Henderson I.R. et al., 2000; Chakravortty D., Kumar K.S., 1999]. Локально синтезированные цитокины: ИЛ-ір, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНО-а, грануллоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор и др. регулируют эпителиальную проницаемость и ионный транспорт [Musch M.W. et al., 2002; Oprins J.C. et al., 2000]. Клебсиеллы, как многие другие бактерии, способны продуцировать сидерофоры, осуществляющие транспорт железа внутрь клетки. Ионы железа необходимы для размножения бактерий in vivo [Podschun R. et al., 2000].
Токсины семейства Enterobacteriaceae подразделяют на следующие типы: цитотонические; цитотоксические (цитолетальный дилатирующий токсин, цитотоксический некротизирующий фактор, шига-подобные токсины); энтерогемолизин; токсины, влияющие на нервную систему кишечника посредством выделения нейромедиаторов-трансмиттеров [Бондаренко В.М., Рябиченко Е.В., 2007]. Клебсиеллы имеют термолабильный (LT-I и LT-II) и термостабильный (STa и STb) энтеротоксины, вызывающие секреторную диарею. В патологии человека имет значение LT-I [Мавзютов А.Р. и др., 2007]. По механизму действия и иммунологическим свойствам LT-I гомологичен холерогену (на 80%), а также и токсинам энтеротоксигенных кишечных палочек. Ген, кодирующий LT-I, находится на плазмиде, содержащей гены колонизирующего фактора [Nataro J.P., Kaper J.B., 1998]. STa-токсин стимулирует секрецию хлоридов, приводя к потере жидкости; вызывает секреторный невральный рефлекс; стимулирут выработку провоспалительных цитокинов. Рецепторы к STa сконцентрированы на энтероцитах тонкой кишки, количество их уменьшается с возрастом, что обусловливает более тяжелое течение клебсиеллеза у детей. STb-токсин стимулирует секрецию KCL, подавляет абсорбцию NaCL, вызывает расширение капилляров и истончение собственной пластинки слизистой оболочки кишечника, воздействует на гладкомышечные клетки, усиливая перистальтику. Ген, кодирующий STb, находится на плазмиде, содержащей гены, детерминирующие синтез факторов колонизации, лекарственной устойчивости, продукции колицинов [Albano F. et al., 2000]. Цитотоксический некротизирующий фактор (CNF-I и CNF-II) обнаружен у штаммов К. pneumonia [Мавзютов А.Р. и др., 2002]. В патологии человека имеет значение CNF-I, вызывающий реорганизацию F-актиновых структур цитоскелета.
Шига-подобные токсины (SLT) способствуют развитию гемоколита при ОКИ [Мавзютов А.Р. и др., 2007; Егорова Т.Н. и др., 2001]. У клебсиелл описаны тиолзависимые гемолизины и определена их роль в возникновении инфекции [Руднев И.А., Бондаренко В.М., 1993]. Бактериальный эндотоксин клебсиелл (липополисахарид клеточной стенки) может индуцировать целый каскад реакций, ведущих к развитию тяжелых патологических процессов. IgA-протеазы, как фактор инвазии и защиты возбудителя от иммунных агентов макроорганизма, обнаружены у К. pneumonia [Агапова О.В. и др., 1998].
Экспрессия генов вирулентности патогенных бактерий не является конститутивной. Их проявление связано с условиями внешней среды. Гены вирулентности «включаются» в организме хозяина и «выключаются» в период пребывания во внешней среде, что важно для адаптации патогенных микроорганизмов в окружающей среде, включая условие развития инфекционного процесса [Бондаренко В.М. и др., 2008; Struve С, Krogfelt К.А., 2004].
Особенности клиники и лечения ОКИ у детей первого года жизни
При изучении сезонной частоты ОКИ различной этиологии было установлено следующее (рис. З.1.). ОКИ патогенной этиологии выявляли примерно с одинаковой частотой весной (26,7%), летом (33,3%) и осенью (26,7%), однако зимой их отмечали реже (13,3%). ОКИ условно патогенной этиологии одинаковой частотой отмечали весной (32,1%) и осенью (30,4%), но реже зимой (21,4%) и еще более редко летом (16,1%). ОКИ вирусной этиологии в подавляющем большинстве случаев диагностировали в холодное время года: зимой (48%), весной (28%) и осенью (24%), что совпадает с данными других авторов [31, 186]. ОКИ неустановленной этиологии чаще регистрировали весной (33,3%) и осенью (38,1%) и реже зимой (14,3%) и летом (14,3%).
Клиническая картина ОКИ у детей первого года жизни характеризовалась преобладанием среднетяжелых форм заболевания - 64,4% случаев. Количество больных со среднетяжелой и тяжелой формами заболевания уменьшалось в ряду: ОКИ патогенной этиологии (93,3%), ОКИ вирусной этиологии (78%), ОКИ условно патогенной этиологии (73,7%), ОКИ невыясненной этиологии (63,9%). На высокую частоту среднетяжелых форм заболевания при вирусной диарее указывают и другие авторы [24, 96]. Частота диагностики ОКИ различной степени тяжести представлена в таблице 3.5. Различия между группами больных ОКИ различной этиологии недостоверны.
В клинической картине наблюдаемых больных ОКИ преобладал энтероколитический вариант поражения желудочно-кишечного тракта (40,7%), далее следовали гастроэнтероколитический (26,3%), гастроэнтеритический (25,4%) и энтеритический (7,6%) варианты. Частота клинических вариантов поражения желудочно-кишечного тракта у больных ОКИ различной этиологии приведена в таблице 3.6. У больных ОКИ патогенной этиологии наиболее часто диагностировали энтероколитический вариант заболевания (60%). У больных ОКИ условно патогенной этиологии диагностировали все клинические варианты, но более часто — энтероколитический вариант (38,6%). У больных ОКИ вирусной этиологии более часто диагностировали гастроэнтеритический вариант инфекции (48%). У больных ОКИ невыясненной этиологии в клинической картине преобладал энтероколитический вариант поражения желудочно-кишечного тракта (47,6%). Уровень значимости статистических различий по критерию M-L Chi-square близок к достоверному (р=0,08).
Была изучена частота сопутствующих диагнозов у больных ОКИ различной этиологии первого года жизни (таблица 3.7). Острая респираторная инфекция (ОРИ) чаще была диагностирована у больных ОКИ условно патогенной этиологии (14%) и ОКИ вирусной этиологии (12%); малые формы гнойной инфекции - у больных ОКИ невыясненной этиологии (14,3%) и ОКИ условно патогенной этиологии (12,3%); желтухи — у больных ОКИ невыясненной этиологии (14,3%); атопический дерматит — у больных ОКИ невыясненной этиологии (14,3%); прочие диагнозы (среди которых в 56,7% случаев имели место заболевания инфекционного генеза, в частности, пиелонефрит) — у больных ОКИ патогенной этиологии (60%). Уровень значимости статистических различий оцениваемых показателей по критерию M-L Chi-square соответствует достоверному (р=0,03).
Физическое развитие у 80,5% наблюдаемых больных соответствовало мезосоматическому типу; у 5,1% - микросоматическому типу; у 14,4% — макросоматическому.
Был проведен анализ выраженности симптомов интоксикации у больных ОКИ различной этиологии. Повышение температуры тела при поступлении в стационар отмечали у большинства наблюдаемых больных (рис. 3.2.). Повышение температуры более 38,5С в 1-й день наблюдения чаще отмечали у больных ОКИ вирусной этиологии (рис. 3.3.). К 5-ому и 7-ому дням лечения в стационаре фебрильную температуру регистрировали только у 6,7% больных ОКИ патогенной этиологии (уровень различий по критерию Pearson Chi-square близок к достоверному, р=0,07).
Повышение температуры до субфебрильного уровня (рис. 3.4.) в 1-й день наблюдения чаще отмечали у больных ОКИ условно патогенной этиологии (45,6%) и больных ОКИ патогенной этиологии (33,3%); уровень различий по критерию M-L Chi-square близок к достоверному, р=0,08. В последующие дни различий в частоте регистрации повышенной температуры тела выявлено не было.
Частота судорожного синдрома убывала в ряду: ОКИ патогенной этиологии (6,7%), ОКИ вирусной этиологии (4%), ОКИ условно патогенной этиологии (3,5%), ОКИ неустановленной этиологии (0%).
Жалобы на снижение аппетита были важным признаком интоксикационного синдрома. На рис 3.6. изображена частота наличия жалоб на снижение аппетита при поступлении больных в стационар и в динамике на 3 и 5 дни лечения. Снижение аппетита чаще отмечали у больных ОКИ вирусной этиологии. Статистические различия по критерию Pearson Chi-square на 1 и З день наблюдения были достоверными (р=0,053; р=0,02, соответственно).
Интенсивность снижения аппетита при поступлении в стационар (рис. 3.7.), оцененную на 3 балла, чаще отмечали у больных ОКИ вирусной этиологии (достоверность статистических различий по критерию M-L Chi-square р=0,03). На 3-й день лечения интенсивность снижения аппетита у больных ОКИ снижалась (рис. 3.8.), но минимальная выраженность данного симптома чаще оставалась у больных ОКИ вирусной этиологии (достоверность статистических различий по критерию M-L Chi-square р=0,06).
Минимальная выраженность снижения аппетита оставалась только у больных ОКИ патогенной этиологии (13,3%; достоверность статистических различий по критерию Pearson Chi-square р=0,003).
Рвота является сложным рефлекторным актом [Магнуссон М.Р., 2007; Чей В.Д., 1997], обусловленным у больных ОКИ интоксикацией, а также воспалительными поражениями слизистой оболочки желудка, то есть гастритическим синдромом. Частота симптома рвоты у больных ОКИ различной этиологии в динамике наблюдения представлена на рис. 3.9.
В 1-й и 3-й дни наблюдения симптом рвоты чаще отмечали у больных ОКИ вирусной этиологии, на 5-й и 7-й дни наблюдения - у больных ОКИ патогенной этиологии, причем частота рвоты у последних на 7-й день наблюдения была достоверно выше, чем у других больных (р=0,0001 по критерию Pearson Chi-square).
Частота повторной и многократной рвоты у наблюдаемых больных в 1-й, 3-й и 5-й дни лечения в стационаре достоверно не отличалась. На 7-й день повторную рвоту отмечали только у 6,7% больных ОКИ патогенной этиологии (р=0,03 по критерию Pearson Chi-square).
Диарейный синдром в первые дни наблюдения отмечали у подавляющего большинства больных ОКИ различной этиологии (рис. 3.10.). Под влиянием лечения в последующие дни наблюдения число больных с синдромом диареи уменьшалось.
Число дефекаций у наблюдаемых больных также постепенно уменьшалось. Частота кратности стула у больных ОКИ различной этиологии при поступлении в стационар приведена на рис. 3.11. Многократная диарея до 10 раз в сутки чаще была отмечена у больных ОКИ вирусной этиологии (в 20% случаев). Однако достоверность различий не была выявлена. Частота кратности стула у больных ОКИ на 3-й день стационарного лечения приведена на рис. 3.12. Многократную диарею до 6 - 7 раз в сутки отмечали у больных ОКИ условно патогенной этиологии (21,%; 5,3% случаев, соответственно) и больных ОКИ вирусной этиологии (16%; 8% случаев, соответственно). Уровень различий по критерию M-L Chi-square р=0,04.
Патологические примеси в каловых массах при поступлении наблюдаемых больных на лечение выявляли у подавляющего большинства, в последующие дни количество больных с патологическими примесями в кале постепенно уменьшалось. Частота обнаружения слизи в каловых массах у больных ОКИ различной этиологии в динамике наблюдения приведена на рис. 3.13.
Более длительное выделение слизи с каловыми массами (р 0,05) отмечали у больных ОКИ неустановленной этиологии (в 57,1%).
Частота обнаружения прожилок крови в каловых массах у больных ОКИ различной этиологии в динамике наблюдения приведена на рис. 3.14. При поступлении в стационар признаки гемоколита были выявлены у 9,5% больных ОКИ неустановленной этиологии; 6,7% больных ОКИ патогенной этиологии; 3,5% больных ОКИ условно патогенной этиологии; 4% больных ОКИ вирусной этиологии (р 0,05). В последующие дни наблюдения прожилки крови в каловых массах отмечали только у 1 больного (1,8%) ОКИ условно патогенной этиологии. К моменту завершения лечения больных в стационаре признаки гемоколита не наблюдали.
Визуальных признаков наличия гноя в каловых массах у больных ОКИ первого года жизни не отмечали.
Наличие колитического синдрома у наблюдаемых больных подтверждали данными копрологического исследования.
Результаты ПЦР анализа области регуляции фимбрий 1-го типа и генов, кодирующих факторы патогенности клинических изолятов К. pneumoniae
Генетический анализ показал, что у всех исследованных штаммов присутствовал ген hem, кодирующий гемолизин (таблица 4.3).
У десяти штаммов был обнаружен ген blaSHV-П, кодирующий бета-лактамазу SHV-11 типа, что объясняет устойчивость данных штаммов клебсиелл к пенициллинам и аминогликозидам. Кроме того, у восьми из исследованных шестнадцати штаммов была определена нуклеотидная последовательность размером 650 п.н. (psr), характеризующая область регуляции (ОР) транскрипции структурных генов, кодирующих адгезины фимбрий 1-го типа.
Schembri M.A. с соавторами продемонстрировали, что рестриктаза BsaBI, при разрезании ОР на фрагменты 304 п.н. и 342 п.н. характеризовала состояние ОР в положении «вкл.», что приводило к транскрипции структурных генов и формированию фимбрий 1-го типа на поверхности клебсиелл [Schembri M.A. et al., 2005]. Разрезание рестриктазой BsaBI ОР с образованием двух неодинаковых фрагментов (204 п.н. и 446 п.н.) характеризовало состояние ОР в положении «выкл.», что приводило к образованию фенотипа клеток без фимбрий 1-го типа.
Рестрикционный анализ ОР штаммов № 75, 86, 93, 95, 98, 100, 109, 1956 показал, что штаммы №№ 95 и 1956 не имели сайта рестрикции для BsaBI. У остальных штаммов рестрикционный анализ выявил образование двух фрагментов 204 п.н. и 446 п.н., что характеризовало «выкл.» состояние ОР (рис. 4.3.).
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей штаммов №№ 95 и 1956 обнаружил, что ОР этих штаммов также находилась в состоянии «выкл.».
Таким образом, результаты изучения области регуляции транскрипции генов, кодирующих адгезины фимбрий 1-го типа, позволили выделить две группы штаммов в соответствии с наличием psr (табл. 2). Клетки штаммов, геном которых не имел psr, были как отрицательны в реакции агглютинации (№ 80, 82, 90, 118), так и высоко положительны (№ 76, 81, 83, 114). Обобщая данные микробиологического и генетического исследований можно сделать вывод, что двенадцать из исследованных штаммов оказались положительными по способности образования фимбрий 1-го типа, что подтверждает патогенность выделенных клебсиелл. К отрицательной группе были отнесены штаммы № 80, 82, 90 и 118.
Клиническая эффективность лечебных комплексов с использованием лактосодержащих пробиотиков в терапии ОКИ у детей первого года жизни
Медико-социальная эффективность использования медицинской технологии заключается в проведении рациональной патогенетической терапии ОКИ с использованием пробиотиков, что приводит к предупреждению негладкого течения заболевания. Эффективность предложенной медицинской технологии была прослежена на 118 больных ОКИ первого года жизни, госпитализированных в инфекционно-диагностическое отделение ГУЗ Детская городская больница №1 Санкт-Петербурга.
Наблюдаемые пациенты в зависимости от использования в комплексной терапии лактосодержащих пробиотиков были разделены на следующие группы: группа 1 (п=32) получала Витафлор; .группа 2 (п=29) — Лактобактерин жидкий; группа 3 (п=31) - Биобактон. Группу сравнения (группа 4, п=26) составили больные, которые не получали пробиотики в период стационарного лечения.
Анализ результатов исследования (таблица 6.2) выявил следующее. Наименьшие средние сроки лечения в стационаре (М±а) отмечены у больных группы 2 (7,1±2,9 дн.). Надо заметить, что длительность пребывания больных в стационаре зависела не только от результатов лечения, она также определялась социальными и бытовыми факторами.
Выявлено положительное влияние Лактобактерина и Биобактона, используемых в комплексных схемах лечения, на восстановление моторной функции желудка, что выразилось в достоверном снижении числа срыгиваний за сутки к 5 дню лечения по сравнению с больными группы 1 и группы 4 (рис. 6.6.).
Терапия с включением пробиотиков способствовала уменьшению числа эпизодов рвоты к 3 дню лечения, что косвенно свидетельствовало о снижении степени интоксикации под влиянием лечения (рис. 6.7.). Причем, достоверная разница данного показателя эффективности терапии была выявлена в отношении больных группы 3, получавших Биобактон. Кроме того, у больных группы 3, получавших Биобактон, отмечалось наименьшее число эпизодов диареи к 5 дню терапии (рис. 6.8.). Выраженность метеоризма в баллах к 3 дню лечения в группах больных, получавших пробиотики, была меньше, чем в группе сравнения (рис. 6.9.). Величина средней выраженности метеоризма в баллах к 3 дню лечения у больных группы 3, получавших Биобактон, достоверно отличалась от такового в группе сравнения. К 5 дню лечения у больных всех опытных групп выраженность метеоризма была достоверно меньше, чем в группе сравнения.
Очевидно, включение Биобактона в схемы терапии больных ОКИ способствовало более быстрому восстановлению ферментативной (в том числе, лактазной) активности пищеварительного тракта.
Сравнение средних значений массы тела больных (М±ст) в раннем периоде реконвалесценции ОКИ обнаружило превышение данного показателя у больных группы 1 по сравнению с больными других групп. Были выявлены различия между группой 1 (6821,6±2820,8 г) и группой 2 (5502,0±2486,4 г), но они были не достовернымы (р=0,058). Можно предположить, что пробиотические лактобациллы Витафлора, положительно влияя на резидентную микрофлору кишечника детей, способствуют адекватному снабжению клеток и тканей организма питательными веществами, то есть участвуют в организации и поддержании трофостата [Уголев A.M., 1991]. Оценка динамики воспалительной реакции организма по значениям лейкоцитоза к моменту выписки больных (рис. 6.10) выявила положительные тенденции у пациентов, получавших Биобактон; р 0,05.
Наименьшие средние значения моноцитоза (М±с) по данным анализа лейкоцитарной формулы к моменту выписки из стационара отмечены у больных группы 1 (9,3%±3,6%,) наибольшие - у больных группы 4 (12,7%±6,3%),р 0,05.
Мононуклеарные фагоциты играют роль не только в неспецифическом, но и в специфическом иммунитете. Предполагают, что моноцитоз у больных первых месяцев жизни, возможно, связан со стимуляцией иммунитета микробными антигенами [Шабалов Н.П. и др., 2000; Алексеев Н.А., 1998]. Наибольшие средние значения эозинофилии (М±а) к моменту выписки из стационара были выявлены у больных группы 4 (5,6%±,3,7%), наименьшие — у больных группы 1 (3,5%±3,1%), р 0,05. Имеются данные о том, что микробные пробиотики и их метаболиты, взаимодействуя с эпителием, способствуют стимуляции Т-клеточного иммунитета в сторону дифференцировки Th-І [Петров Л.Н. и др., 2008].
Значения гемоглобина к моменту выписки из стационара (М±а) у больных опытных групп были выше, чем у больных группы сравнения, что указывало на снижение у последних адаптивных реакций организма на инфекционный процесс. Показатели гемоглобина в группах больных ОКИ убывали в следующем порядке: группа 1, группа 2, группа 3, группа 4.
Сравнение значений гематологических показателей у больных ОКИ., получавших различные схемы лечения, в остром периоде и в периоде ранней реконвалесценции (при р 0,05) приведено в таблице 6.3. Анализ таблицы 6.3. выявил положительные результаты во всех группах больных. Наибольшее количество достоверных результатов обнаружено у больных группы 3, получавших Биобактон в комплексной терапии ОКИ, наименьшее - у больных группы 2, получавших Лактобактерин. В группе сравнения не было найдено достоверной положительной динамики значений гематокрита, отражающего степень обезвоживания. Последнее позволяет предположить активное участие пробиотиков на основе лактобацилл на процессы всасывания в кишечнике у больных ОКИ. В группе 2 не было выявлено достоверной положительной динамики значений ЛИИ, что можно объяснить наиболее низкими исходными значениями данного показателя (М±а) в остром периоде заболевания (в группе 1 - 0,74±0,57; в группе 2 — 0,72±0,78; в группе 3 - 0,81±0,71; в группе сравнения - 0,77±0,71). Динамика копрологических показателей у больных группы 1, получавших в комплексной терапии Витафлор приведена в таблице 6.4. Анализ данных таблицы показывает восстановление процессов переваривания всасывания питательных веществ в тонком кишечнике, что выразилось в достоверном снижении количества жирных кислот (р=0,01), близким к достоверному снижении количества неизмененных мышечных волокон (р=0,07), нейтрального жира (р=0,09), непереваримой клетчатки (р=0,08). Полученные результаты свидетельствуют о купирование воспалительных изменений в толстой кишке, что доказывает достоверное снижение количества слизи (р=0,01) и лейкоцитов в копрограмме (р=0,002).
Динамика копрологических показателей у больных группы 2, получавших в комплексной терапии Лактобактерин приведена в таблице 6.5.
