Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Современное состояние проблемы герпесвирусных инфекций (обзор литературы) 17
1.1. Современные аспекты этиологии и клинического течения герпесвирусных инфекций у новорожденных и детей первого года жизни 17
1.2. Современный подход к диагностике герпесвирусных инфекций у новорожденных и детей первых месяцев жизни 32
1.3. Роль иммунной системы в патогенезе герпесвирусных инфекций 42
1.4. Современное состояние проблемы лечения герпесвирусных инфекций у детей 59
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 64
2.1. Общая характеристика обследованных больных 64
2.2. Методы исследования 78
ГЛАВА III. Клинико-лабораторная характеристика больных 91
3.1 Клинико-лабораторная характеристика герпесвирусной инфекции у детей на первом месяце жизни с учетом этиологии заболевания 91
3.2. Клинико-лабораторная характеристика герпесвирусной инфекции с учетом этиологии заболевания в катамнезе у детей на первом году жизни 105
ГЛАВА IV. Показатели иммунного и цитокинового статусов у детей первых месяцев жизни с герпесвирусной инфекцией, родившихся у матерей группы инфекционного риска
4.1 ДНК-диагностика и уровень специфических антител в сыворотке крови у детей, больных герпесвирусной инфекцией, в динамике на первом году жизни с учетом этиологии и тяжести заболевания 122
4.2 Иммунный статус детей первых месяцев жизни с герпесвирусной инфекцией в динамике с учетом этиологии и тяжести заболевания 127
4.3 Цитокиновый статус детей первых месяцев жизни с герпесвирусной инфекцией в динамике с учетом этиологии и тяжести заболевания 153
4.4 Показатели иммунного статуса у детей первых месяцев жизни в случаях позднего обнаружения ДНК цитомегаловируса в крови и в моче 174
4.5 Уровень цитокинов в пуповинной крови как скрининговый маркер инфекционного процесса у новорожденных, родившихся у матерей с хроническими воспалительными гинекологическими заболеваниями 195
ГЛАВА V. Клинико-иммунологические критерии прогнозирования тяжести заболевания при цитомегало-вирусной инфекции у детей 200
ГЛАВА VI. Клинико-иммунологические критерии прогнозирования хронического течения заболевания при цитомегаловирусной инфекции у детей 215
6.1. Прогноз частых ОРВИ на первом году жизни у детей, перенесших цитомегаловирусную инфекцию в первые месяцы жизни 235
6.2. Прогноз сохранения неврологической симптоматики к концу первого года жизни у детей, перенесших цитомегаловирусную инфекцию в первые месяцы жизни 246
ГЛАВА VII. Лечение детей с герпесвирусной инфекцией 254
Заключение 262
Выводы 294
Практические рекомендации 291
Указатель литературы 296
- Современные аспекты этиологии и клинического течения герпесвирусных инфекций у новорожденных и детей первого года жизни
- Клинико-лабораторная характеристика герпесвирусной инфекции у детей на первом месяце жизни с учетом этиологии заболевания
- ДНК-диагностика и уровень специфических антител в сыворотке крови у детей, больных герпесвирусной инфекцией, в динамике на первом году жизни с учетом этиологии и тяжести заболевания
- Прогноз частых ОРВИ на первом году жизни у детей, перенесших цитомегаловирусную инфекцию в первые месяцы жизни
Введение к работе
Актуальность проблемы. Герпесвирусные инфекции являются одной из актуальных проблем педиатрии, так как они занимают ведущее место в причине мертворождаемости, преждевременных родов, младенческой смертности, заболеваемости новорожденных и ранней инвалидизации (Гриноу А., Осборн Д., Сазерленд Ш., 2000; Володин Н.Н (ред.), 2002; Шарапова О.В., Корсунский А.А., 2003; Шабалов Н.П. и соавт., 2005; Ковальчук Л.В. и соавт., 2006; Черняковский О.Б. и соавт., 2009). Это обусловлено убиквитарным распространением герпесвирусов, многообразием вызываемых заболеваний, часто принимающих хроническое течение (Зуев В.А., 1988; Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., 2007; Кулаков В.И., Барашнев Ю.И., 2007; Сучков С.В. и соавт., 2007; Pallier С. et al., 2002; Mace M. et al., 2004; Pusztai R. et.al., 2004; Picone O. et al., 2005). Внутриутробная инфекция развивается у 27-36,6% детей, рожденных живыми у матерей группы высокого инфекционного риска, обусловливая от 11% до 45% перинатальных потерь, достигая по данным разных авторов 65,6% (Царегородцев А.Д, Рюмина И.И., 2001; Цхай В.Б. и соавт., 2002; Подзолкова Н.М. и соавт., 2003; Орджоникидзе Н.В., и соавт., 2005; Макаров О.В. и соавт., 2008; Черняховский О.Б. и соавт., 2009; Griffits P.D., 2002; Whitley R, 2004). Частота ранней неонатальной заболеваемости и смертности при внутриутробном инфицировании колеблется от 5,3 до 27,4%, а мертворождаемость составляет 16,8% (Сенчук А.Я, Дубоссарская З.М., 2005; Бусуек Г.П. и соавт., 2006). По данным В.И. Кулакова (2003) среди детей, заболевших в ранний неонатальный период, инфекционные заболевания выявляются у 50 – 60%, а у 37,5% умерших новорожденных инфекционная патология явилась основной причиной смерти. Сложной задачей остается выявление конкретной этиопатогенетической причины заболевания, несмотря на широкий арсенал современных методов диагностики, включающих полимеразную цепную реакцию, серодиагностику (Aurelius E. et al., 1993; Damato E.J. , et al., 2002; Flowler K.B. et al., 2003). Многие авторы указывают на то, что в ряде случаев клиническая диагностика герпесвирусной инфекции в настоящее время является чрезвычайно трудной из-за неспецифичности и полиморфности симптоматики, что приводит к позднему назначению патогенетической терапии (Гриноу А. и соавт., 2000; Дегтярева М.В., 2001; Володин Н.Н., 2004; Шабалов Н.П., 2004; Воронцова Ю.И. и соавт., 2004; Сенчук А.Я., Дубоссарская З.М., 2005; О.В. Макарова, 2006; Бочарова И.И. и соавт., 2007; Carillo J. et al., 1999; Greatsas G. et al., 1999; Levition A., Paneth N., 1999; Corey R., Flynn J., 2000; Dwyer R., 2002). В настоящее время доказано, что отрицательный результат обследования крови и мочи методом ПЦР, полученный в первые дни жизни, не исключает возможности отсроченной реализации внутриутробной инфекции (Воронцова Ю.Н. и соавт., 2004; Федорова Н.Е. и соавт., 2005). Диагностическая ценность лабораторных методов, основанных на оценке гуморального иммунитета (антитела к герпесвирусу IgM и IgG) в период ранней неонатальной адаптации, связана с особенностями антителогенеза (недостаточная выработка IgM и трансплацентарное происхождение IgG) и является низкой (Володин Н.Н и др., 2001; Кулаков В.И., Барашнев Ю.И., 2007). Это свидетельствует о том, что не существует ни одного метода обследования, обладающего в реальных клинических условиях 100% чувствительностью и специфичностью. Согласно исследованиям Н.Н. Володина, Д.Н. Дегтярева (2003), B.T. Rouse (2001); E.B. Staros (2005) любая интерпретация результатов лабораторного исследования должна проводиться с обязательным учетом анамнестических и клинических данных. Имеются веские основания подозревать герпесвирусную инфекцию на основании учета перинатальных факторов (генитальный герпес у матери, возможные иммуносупрессивные воздействия), весомых клинических данных (TORCH – синдром при наличии различной степени выраженности повреждения ЦНС), данных НСГ. В этих случаях, учитывая, что выявление вирусспецифического антигена – наиболее надежного и достоверного метода диагностики – не всегда возможно из-за трудностей детекции антигена, целесообразно изучать вспомогательные методы диагностики для дифференцированного подхода к назначению энергичной противовирусной терапии, не дожидаясь вирусологических исследований (Володин Н.Н., Дегтярев Д.Н. (ред.), 1998; Кудашов Н.Н., 2005) . Для решения этих вопросов в настоящее время многие исследователи занимаются изучением функционального состояния системы интерферона при герпесвирусной инфекции у новорожденных и детей первых месяцев жизни со сниженным противовирусным иммунитетом (Ершов Ф.И. и соавт., 2005; Исаков В.А. и соавт., 2006; Железникова Г.Ф., 2008). Приоритетным направлением является разработка новых технологий ранней диагностики нарушений функциональной, метаболической, иммунологической адаптации новорожденных (Алиев А.Ф., 2002; Володин Н.Н. и соавт. 2000; Карпухин Е.В., Валлиуллина С.А., 2002; Цхай В.Б. и соавт., 2002; Фризе К., Кахель В., 2003; Баранов А.А. и соавт., 2006; Дегтярев Д.Н., 2006; Рабсон А., и соавт., 2006; Царегородцев А.Д. и соавт., 2006; Козлова Л.И., 2006; Баранов А.А., Альбицкий В.Ю., 2007; Бочарова И.И., и соавт., 2007; Володин Н.Н и др., 2007; Ганковская Л.В. и соавт., 2007; Железникова Г.Ф., 2008; Орджоникидзе Н.В., Ушницкая Е.К., 2008; Alford C. et al., 1999; Faumont N. et al., 2001; Edelmann K.H., Wilson C.B., 2001). Не менее важной проблемой является выбор тактики терапии, минимизация этиотропной и иммунокорригирующей терапии в неонатальном периоде.
Таким образом, несмотря на то, что проблема герпесвирусных инфекций у новорожденных и детей первых месяцев жизни является предметом изучения многих исследователей, однозначного решения этой проблемы нет. Большое значение приобретает дальнейшее изучение патогенетических механизмов формирования герпесвирусной инфекции для выбора оптимального метода диагностики, прогноза хронического течения заболевания и возможных осложнений у детей первых месяцев жизни с позиций оценки у них способности к полноценной межклеточной кооперации и зависимости первичного противовирусного иммунного ответа от взаимодействия костимуляторных молекул, изучение роли ИФН -, ИФН - в иммунной защите (Макаров О.В. и др., 2006; Железникова Г.Ф., 2008; Carillo J. et al., 1999; Greatsas G. et al., 1999; Levition A., Paneth N., 1999; Corey R., Flynn J., 2000; Macher C. et al., 2001; Dwyer R., 2002). Вышеизложенное открывает перспективу для решения проблемы ранней диагностики и оптимизации лечения этой грозной патологии у детей первых месяцев жизни.
Цель работы: Разработка ранних критериев диагностики, прогноза течения и возникновения осложнений герпесвирусной инфекции (ЦМВИ, герпеса 1-2 типа, Эпштейна-Барр вирусной инфекции) у детей первых месяцев жизни для своевременного назначения комплексной этиопатогенетической терапии.
Основные задачи исследования:
1. Выявить особенности преморбидного фона и клинического течения герпесвирусных инфекций у детей первого года жизни с учетом тяжести, стадии патологического процесса и клинической формы заболевания.
2. Изучить процессы активации, костимуляции и апоптоза иммунокомпетентных клеток, у детей первых месяцев жизни с герпесвирусной инфекцией в зависимости от этиологии заболевания и стадии патологического процесса.
3. Оценить особенности цитокинового статуса у детей первых месяцев жизни с герпесвирусной инфекцией в зависимости от этиологии заболевания и стадии патологического процесса.
4. Изучить содержание молекул активации, апоптоза, костимуляции и интерферонового статуса с целью прогноза генерализации патологического процесса, хронического течения заболевания и развития осложнений к концу первого года жизни у детей с ЦМВИ.
5. Разработать критерии доклинической диагностики и прогноза манифестации инфекционного процесса у новорожденных, родившихся у матерей с хроническими гинекологическими заболеваниями.
6. Оптимизировать комплексную этиопатогенетическую терапию при герпесвирусной инфекции у детей первого года жизни.
Научная новизна работы
В настоящей работе впервые:
- проведено клинико-иммунологическое исследование в аспекте изучения процессов активации, костимуляции, пролиферации и апоптоза иммунокомпетентных клеток, а также ИФН -, ИФН - у детей первых месяцев жизни с герпесвирусной инфекцией, позволившее установить новые закономерности формирования клинических форм заболевания, развития осложнений и оптимизировать тактику лечебных мероприятий;
- выявлены особенности динамики уровней ИФН-, ИФН- в сыворотке крови больных с учетом типа возбудителя и стадии патологического процесса: на начальных этапах развития герпесвирусной инфекции у детей с ЦМВИ и Эпштейна-Барр вирусной инфекции имеет место повышение уровня ИФН – , при ЦМВИ и инфекции, вызванной вирусом простого герпеса, имеет место снижение выработки ИФН – , являющееся одной из причин тяжелого течения заболевания. Дальнейшее снижение уровня ИФН – , свидетельствует о сохраняющихся нарушениях в системе интерферона, что диктует необходимость проведения повторных курсов иммунокорригирующей терапии;
- определены критерии доклинической диагностики и прогноза манифестации инфекционного процесса у новорожденных, родившихся у матерей с хроническими гинекологическими заболеваниями, по уровню провоспалительных (ИЛ-2, ИФН - ИФН -, ФНО -), противовоспалительных (ИЛ-4) цитокинов и Т-лимфоцитов с рецепторами CD69, CD71, CD95 (патент на изобретение № 2237900 от 10.10. 2004; патент на изобретение № 23117550 от 20.02.2008);
- установлены наиболее информативные критерии форм тяжести заболевания при ЦМВИ, основанные на совокупной оценке клинических симптомов и иммунных нарушений, проявляющихся дефектами процессов костимуляции, осуществляемых через молекулу CD20+CD40+, готовности лимфоцитов к апоптозу (CD95) и нарушением выработки ИФН - и ИФН – (патент на изобретение № 2341797от 20. 12. 2008);
- дано клинико-патогенетическое обоснование выделения клинических и иммунологических критериев хронизации инфекционного процесса при ЦМВИ, связанных с нарушением механизмов активации и костимуляции иммунокомпетентных клеток в виде снижения уровней содержания относительного числа клеток с маркерами CD3+, CD28+, CD71+, CD95+ и увеличения клеток с маркерами CD20+ , CD40+, CD69+;
- установлена тесная взаимосвязь между сохранением изменений со стороны ЦНС в течение первого года жизни и нарушениями в клеточном звене иммунной системы, касающаяся Т-лимфоцитов с рецепторами CD69+, CD71+, CD95+, CD28+;
- оптимизирована комплексная этиопатогенетическая терапия герпесвирусной инфекции у детей первого года жизни с учетом динамики изменения иммунных маркеров.
Практическая значимость
На основании результатов исследования преморбидного фона, клинических показателей и иммунного статуса
- определены клинические, специфические (ИФА и ПЦР) и иммунологические критерии диагностики герпесвирусной инфекции в зависимости от этиологии заболевания и тяжести патологического процесса;
- разработаны наиболее информативные критерии прогноза формы тя -
жести заболевания, основанные на оценке клинических симптомов, методов специфической диагностики (ИФА и ПЦР), показателей специфического иммунного ответа, включающего оценку активации, пролиферации, костимуляции и апоптоза иммунокомпетентных клеток, а также уровня интерферонов и ;
- разработан диагностический алгоритм прогноза хронического течения ЦМВИ, основанный на комплексной оценке состояния преморбидного фона, клинических проявлений заболевания, изменений иммунного статуса, что позволяет осуществлять своевременное комплексное лечение заболевания.
Положения, выносимые на защиту:
1. Клиническая картина герпесвирусной инфекции детей первого года жизни проявляется полиорганным характером поражения, включая нервную, бронхолегочную, сердечно-сосудистую, гепато-билиарную, пищеварительную системы, и зависит от состояния преморбидного фона (хронические воспалительные гинекологические заболевания, осложнения беременности у матерей, перинатальное поражение ЦНС, низкая оценка по шкале Апгар), а также глубины и характера иммунологических нарушений.
2. Для диагностики форм тяжести и вариантов течения герпесвирусной инфекции у детей раннего возраста необходим комплекс методов, включающих оценку преморбидного фона, клиническое обследование, изучение специфического противовирусного ответа в реакции ИФА, детекцию ДНК вируса методом ПЦР и изучение иммунного статуса. Изменения в иммунном статусе, отражающие нарастание готовности лимфоцитов к апоптозу и изменение костимулирующего сигнала, влияющего на пролиферацию, дифференцировку и переключение классов В-лимфоцитов, являются одним из значимых механизмов, определяющих формирование различных форм тяжести и вариантов течения заболевания при герпесвирусной инфекции у детей первых месяцев жизни.
3. Доклиническая диагностика инфекционного процесса у новорожденных основана на выявлении нарушений интерферонового статуса и усилении выработки провоспалительных цитокинов. К предрасполагающим факторам реализации воспалительного процесса относится такая группа риска как хронические воспалительные гинекологические заболевания у матерей.
4. Предложенная программа комплексного лечения способствует исчезновению клинических симптомов, восстановлению иммунологических сдвигов у большинства больных.
Апробация работы
Основные положения работы представлены: на научно-практической конференции «Антибактериальные стратегии в акушерстве, гинекологии и педиатрии» (Ростов-на-Дону, 2001), 4-ом съезде Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины (Москва, 2002), I Всероссийском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2002), II Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2003), VIII конгрессе педиатров России «Современные проблемы профилактической педиатрии» (Москва, 2003), научно-практической конференции педиатров Юга России «Актуальные вопросы педиатрии» (Ростов-на-Дону, 2003), научно-практической конференции «Современные проблемы педиатрии» (Ростов-на-Дону, 2003), научно-практической конференции «Современные проблемы педиатрии» (Ростов-на-Дону, 2004), X конгрессе педиатров России (Москва, 2005), Российской научной конференции «Педиатрия: из XIX в XXI век» (Санкт-Петербург, 2005), научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии у детей» (Ростов-на-Дону, 2006); на X Конгрессе педиатров России (Москва, 2006), I междисциплинарном конгрессе «Ребенок и лекарство» (Санкт-Петербург, 2006), II Ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины «Новые технологии в перинатологии» (Москва, 2007), 2-ой Российской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2007), I Международном Семинаре «Инфекция в акушерстве и перинатологии» (Москва, 2007), I Балтийском Конгрессе по детской неврологии (Санкт-Петербург, 2007), XI Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2007), XII Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2008 года).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 32 работы, из них в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК МО и науки РФ - 9 статей, получено 3 патента на изобретения: «Способ прогнозирования нарушений адаптаций у новорожденных от матерей с хроническими воспалительными гинекологическими заболеваниями» № 2237900 10 октября 2004; «Способ прогнозирования генерализованной формы герпесвирусной инфекции у детей первых месяцев жизни» № 2341797 от 20. 12. 2008; «Способ ранней диагностики цитомегаловирусной инфекции у новорожденных» № 2317550 от 20.02.2008; 1 медицинская технология (№ ФС - 2005/115- Москва, 2006).
Внедрение в практику здравоохранения
Полученные данные внедрены в работу отделения патологии новорожденных и родильного отделения ФГУ «Ростовского НИИ акушерства и педиатрии Росмедтехнологий», используются при проведении семинаров с учебными ординаторами и в лекциях на тематических семинарах для врачей-педиатров и неонатологов Южного федерального округа.
Структура диссертации
Диссертация изложена в традиционной форме. Состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы и приложения. Работа представлена на 346 страницах машинописного текста, иллюстрирована 75 таблицами и 51 рисунками. Библиографический указатель включает 476 работ, из них 273 отечественных и 203 иностранных.
Современные аспекты этиологии и клинического течения герпесвирусных инфекций у новорожденных и детей первого года жизни
Внутриутробная инфекция является одной из важнейших медико-социальных проблем современного акушерства и перинатологии (Нисевич Л.Л. и соавт., 1999; Ожегов A.M., Мякишева Л.С., 1999; Русланова Н.Н. и соавт., 2000; Тютюнник В.Л., 2001; Орехов К. В., 2002; Учайкин В.Ф., 2003; Долгих Т.И. и соавт., 2004; Кан Н.Е., Оржоникидзе Н.В., 2004; Орджоникидзе Н.В., Агаронян Н.Г., 2005; Яковлева Т.В., 2006; Чернявский О.Б. и соавт., 2009; Almedia L.N. et al., 2000; Amarapal L.N. et al. 2001; Damato T.J., Winnen C.W., 2002; Lanari M. et al., 2003; Holler L.M. СВ., 2005; Remington J.S., 2004). По данным разных авторов ВУИ развивается у 27,4 -36,6% детей, рожденных у матерей группы высокого инфекционного риска, а в структуре смертности новорожденных инфекционная патология занимает 1—3 места, обусловливая от 11 до 45% потерь (Гуртовой Б.Л. и соавт., 1994; Орджоникидзе Н.В., Агаронян Н.Г. и соавт., 2005). Предложен ряд частных методов и моделей, позволяющих углубленно исследовать патологические проявления отдельных заболеваний вирусной природы у беременных женщин, однако комплексное исследование влияния внутриутробных инфекций на заболеваемость новорожденных и возникновение врожденной патологии развития, являющееся актуальной задачей медиков, получило недостаточное развитие (Головотюк В.И и соавт., 2002; Дубровина Е.В., 2006 ).
Субклиническое или латентное течение ВУИ значительно затрудняет диагностику этой патологии (Макаров О.В. и соавт., 2004). Следует учитывать, что поражение нервной системы при внутриутробном инфицировании делает актуальной проблему наиболее ранней верификации возбудителя и назначения этиопатогенетического лечения с целью предотвращения инвалидизации детей. Необходимо отметить, что в связи с высоким риском развития отсроченных ОС 18 ложнений, свойственных ряду внутриутробных инфекций, лечение новорожденных детей должно проводиться даже при выделении латентных возбудителей (Матвеенко, 2000).
Герпесвирусные инфекции, обусловленные вирусами простого герпеса, цитомегалии, вирусом Эпштейна-Барр, являются частой причиной заболеваний урогенитального тракта у женщин и особенно опасны во время беременности, так как могут вызывать тяжелый инфекционный процесс, приводящий к инвалидности или смертности новорожденных. При антенатальном инфицировании плода заражение герпесвирусами происходит трансплацентарно. Ряд исследователей связывает неблагоприятные исходы беременности при первичной гер-песвирусной (в особенности, цитомегаловирусной) инфекции с гестационным сроком. Если инфицирование происходит на ранних сроках беременности, возрастает частота самопроизвольных выкидышей и преждевременных родов. Ци-томегаловирус, в отличие от вирусов простого герпеса 1-2 типов, обладает большей патогенностью в отношении плода и может вызывать фетопатии и патологию новорожденных (Сучков СВ. и соавт., 2007; Gaytant М.А. et al., 2003; Hollier L.M., Grissom H., 2005). При заражении на 1 -14 день гестации развиваются бластопатии, при заражении на 15-75 день гестации формируются эм-бриопатии, при заражении на 76 - 180 день гестации выявляются ранние фетопатии, при заражении, начиная с 181-го дня, беременности развиваются фетопатии самых различных уровней: манифестные воспалительные реакции с поражением различных органов и систем (Володин Н.Н. (ред.), 2002; Ballao L.A. et al., 2005). По данным статистики, до 60% матерей с привычным невынашиванием беременности заражены цитомегаловирусом. Постнатальное инфицирование новорожденного герпесвирусами от матери и медицинского персонала встречается достаточно редко (Lombardi G., Stronati М., 2005).
Для плода особенно опасны возбудители герпесвирусных инфекций, с которыми мать впервые встретилась во время беременности. Отсюда принципиально важным является выявление либо до беременности, либо на ранних ее сроках женщин серонегативных, не инфицированных вышеуказанными возбудителями, так как именно они - группа высокого риска внутриутробной инфекции у плода, формирования у него пороков развития.
Инфекционный процесс, приведший к поражению плода, у матери может протекать как острый, субклинический с неспецифической симптоматикой и даже латентно. Особое значение имеет мочеполовая инфекция матери (пиелонефриты, воспаление придатков и другие) как источник возбудителей при генерализованной внутриутробной инфекции (Айламазян Э.К., 1995; Адаскевич В.П., 1997; Кудашов Н.И. и соавт., 1998; Лаврова Д.Б., 1998; Федотова А.В., 1998; Безнощенко Г.Б. и соавт., 2003; Шабалов Н.П., 2004; Макаров и соавт., 2004; NishimuraN. etal., 1999).
Однако в настоящее время нет сомнений в том, что врожденная антенатальная цитомегалия у ребенка может быть следствием реактивации цитомега-ловирусной инфекции (ЦМВИ) у беременной женщины, а не только первичного инфицирования ее во время беременности (Saltman R.B., 1994; Rigges J.M. et al., 1998; Boppana S.B. et al., 1999). Для вирусов семейства герпеса характерна длительная, практически пожизненная персистенция в организме хозяина, не сопровождающаяся нарушением репродуктивной функции последнего. Сохранение вирусной популяции в природе обеспечивается за счет вертикальной передачи вирусов от одного поколения хозяина к другому. Наиболее распространенный способ вертикальной передачи инфекционных вирусов у человека — трансплацентарый. Следовательно, внутриутробная инфекция вероятна и при отсутствии у женщины во время беременности острого вирусного заболевания. Активация латентно персистирующей инфекции возможна при разнообразных нарушениях гомеостаза у беременной (анемия, гиповитаминоз, переутомление, стрессовые ситуации, декомпенсация экстрагенитальной патологии неинфекционного генеза и т.д.) Однако срыв адаптации к эндогенному вирусу и обострение хронической инфекции высоко вероятны на фоне острых инфекционных заболеваний. При этом возбудитель острой респираторно-вирусной инфекции, на фоне которой повысилась активность эндогенной инфекции, мог выступать в роли лишь дополнительного этиологического фактора. В работах последних лет (Подзолкова Н.М. и соавт., 2003; Кулаков В.И. и соавт., 2005; Макаров О.В. и соавт., 2006) подчеркивается, что лишь комплексное исследование видового состава микроорганизмов родовых путей, околоплодных вод, плаценты, новорожденного, определение антигенов и антител к предполагаемому возбудителю в пуповинной крови и амниотической жидкости, гистологическое исследование последа позволяют определить природу возбудителя и уточнить объем лечебно-профилактических мероприятий в раннем неонатальном периоде.
Клинико-лабораторная характеристика герпесвирусной инфекции у детей на первом месяце жизни с учетом этиологии заболевания
Уровень ИЛ-2 или ИЛ 4 в сыворотке крови пациентов определяли методом иммуноферментного анализа наборами фирмы ООО «Протеиновый контур» (С.-Петербург, Россия). Растворы стандартов, промывочного, рабочего буфера и коньюгатов готовили согласно инструкции к набору. Перед проведением анализа все лунки планшета промывали трижды промывочным буфером. Затем в соответствующие лунки планшета с иммобилизованными антителами к ИЛ-2 или ИЛ-4 вносили по 100 мкл растворов стандартов или исследуемых сывороток. Дополнительно во все лунки вносили по 100 мкл рабочего буфера. Смесь инкубировали 1 час при 37 С при непрерывном встряхивании на шейке-ре ST З(Латвия). По окончании инкубации трижды промывали лунки планшета промывочным буфером на промывочном устройстве для микропланшетов ELISA WASHER HUMAN (USA), после чего во все лунки планшета вносили по 200 мкл раствора биотинилированных моноклональных антител к ИЛ-2 или ИЛ-4, полученную смесь инкубировали 1 час при 37 С на шейкере. По окончании инкубации осуществляли трехкратную промывку, как описано выше. Во все лунки планшета вносили по 200 мкл раствора коньюгата стрептавидина с пероксидазой хрена, и проводили инкубацию 1 час при 37 С на шейкере. По окончании инкубации осуществляли трехкратную промывку, как описано выше. Во все лунки вносили по 200 мкл раствора субстрата, инкубировали смеси 15 минут при комнатной температуре в темном месте. Останавливали реакцию добавлением 50 мкл стоп-реагента в каждую лунку. Измерение оптической плотности при 450 нм и обсчет результатов проводили на фотометре MULTI- LABEL COUNTER 1420(Финляндия). В компьютерное обеспечение прибора вводили численные значения концентраций интерлейкина-2 или интерлейкина-4 в стандартных растворах и получали после измерения концентрацию интерлейкина-2 или интерлейкина-4 в опытных пробах в пг/мл.
Экспрессию мембранных маркеров иммунокомпетентных клеток (СДЗ+, СД4+, СД8+, СД20+, СД69+, СД71+, СД95+, СД28+, СД40+) периферической крови определяли на проточном лазерном цитофлуориметре «Beckman COULTER» Epics XL II (США), (№ 20123). Типирование лимфоцитов проводили с помощью моноклональных антител к кластерам дифференцировки СДЗ+, СД4+, СД8+, СД20+, СД69+, СД71+, СД95+, СД28+, СД40+ фирмы IMMU-NOTECH (Франция). У ребенка брали 1 мл гепаринизированной крови. Затем из этой пробы отбирали по 100 мкл крови на каждое тестируемое антитело и вносили в пробирки, после чего в каждую пробирку добавляли по 20 мкл моноклональных антител (СДЗ+, СД4+, СД8+, СД20+, СД69+, СД71+, СД95+, СД28+, СД40+) из набора моноклональных антител к кластерам дифференцировки СДЗ+, СД4+, СД8+, СД20+, СД69+, СД71+, СД95+, СД28+, СД40+ и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. В каждую пробирку добавляли по 500 мкл гемолизирующего буфера из набора реагентов сложных диагностических для иммунологии и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку добавляли по 1 мл фосфатно-солевого буфера из набора реагентов сложных диагностических для иммунологии и центрифугировали 3 минуты при 1500 оборотах в минуту, и так 2 раза. К осадку лимфоцитов добавляли в каждую пробирку по 1 мл фосфатно-солевого буфера из набора реагентов сложных диагностических для иммунологии. Ре-суспензировали 3 секунды каждую пробирку. Величину экспрессии мембранных маркеров лимфоцитов (СДЗ+, СД4+, СД8+, СД20+, СД69+, СД71+, СД95+, СД28+, СД40+) крови определяли на проточном цитометре «Beckman COULTER» Epics XL II. О состоянии гуморального иммунитета судили по содержанию сывороточных IgG, IgA, IgM иммуноглобулинов, определяемых методом радиальной иммунодиффузии по J. Manchini et al. (1965).
Для исследования микробного пейзажа проводили исследование материала отделяемого пупочной раны, слизистой ротоглотки, крови. При культу-ральном исследовании определяли качественный и количественный состав всех ассоциантов микроценоза изучаемых образцов. Посев проводили на набор стандартных питательных сред для выделения облигатных и факультативных анаэробов, микроаэрофилов. Забор и транспортировку исследуемого материала проводили с использованием набора для транспортировки аэробных и анаэробных бактерий Portagem Amies Agar + Swab фирмы bioMerieux, содержащего стерильный аппликатор с ватным тампоном и пробирку с транспортной средой Portagem Amies Agar. Portagem Amies Agar представляет собой непитательную среду, не разбавленную фосфатом, поддерживающую жизнеспособность микроорганизмов. Микробную колонизацию оценивали по частоте выделения симбионтов и по интенсивности - десятичному логарифму от среднего числа микроорганизмов (lg КОЕ), выделенных из исследуемого материала. Исследование крови проводили с использованием автоматического бактериологического анализатора гемокультур ВасТ/ALERT 3D biomerieux Inc., США - Франция с использованием педиатрических сред для качественного определения наличия аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (бактерий и грибов) в крови (ВасТ/А1егг).Видовую идентификацию выделенных возбудителей из других локусов проводили с помощью компьютерной программы и идентификационных наборов фирмы Becton Dickinson BBL Crystal Systems (идентификация энтеро - и неферментирующих микроорганизмов, грамположительных, анаэробов, Нейсерий и Гемафилов, всего около 400 видов).
Процедура статистической обработки полученных эмпирических данных предусматривала последовательное выполнение нескольких этапов. Проверялось распределение исходных переменных на нормальность с применением пакета прикладных программ MegaStat (Лакин Г.Ф., 1990; Гайдышев И.В., 2001). Проведенная оценка исходных данных по виду распределения не позволила использовать параметрические методы исследования, так как распределение данных не подчинялось нормальному закону. Далее применялись процедуры описательной статистики, с помощью которой находились — оценивались значения медианы и интерквартильного размаха (25%, 75%). Достоверность полученных результатов рассчитывалась при доверительной вероятности 95%. Обработка исходных рядов признаков осуществлялась с использованием пакетов прикладных программ Statistica версии 6.0 и EXCEL 2003, SPSS 13.0, MegaStat. Для сравнения межгрупповых различий использовали непараметрический метод Вилкоксона для независимых групп с помощью пакета AtteStat 9.2.
При помощи пакета SPSS рассчитывались доверительные интервалы для медиан. Пересечение интерквартильных интервалов не говорит об отсутствии достоверных различий сравниваемых групп. В случае сравнения долевых признаков в двух независимых группах объектов исследования применяли программу вычисления точного критерия Фишера. Анализ корреляций 3-х признаков осуществлен графическим методом - карты линий уровня. Были также применены нелинейные методы, метод классификаций, дискриминантный анализ с оценкой точности, чувствительности, специфичности, прогностической ценности положительного и отрицательного результатов (Реброва О.Ю., 2002).
ДНК-диагностика и уровень специфических антител в сыворотке крови у детей, больных герпесвирусной инфекцией, в динамике на первом году жизни с учетом этиологии и тяжести заболевания
Отмечено достоверное повышение уровня В-лимфоцитов во всех группах больных в отличие от контрольной группы, причем при тяжелой форме ЦМВИ относительное и абсолютное число В-лимфоцитов было достоверно выше, чем у пациентов других групп.
Таким образом, сравнительный анализ показал, что реакция иммунной системы на герпесвирусную инфекцию характеризуется перераспределением основных субпопуляций Т-лимфоцитов, причем происходит оно на фоне снижения относительного уровня CD3+ (за исключением инфекции, вызванной вирусом простого герпеса), касается всех больных, независимо от этиологии заболевания и проявляется снижением относительного числа CD4+, повышением абсолютного числа CD8+. Преобладают эти изменения в группе детей с тяжелой формой ЦМВИ.
Молекулярная патология расширила возможности изучения тонких механизмов возникновения и течения заболеваний. Изучение экспрессии различных адгезивных молекул, а также цитокинов, во многом обеспечивающих регуляцию экспрессии этих молекул, привело к пониманию многих механизмов, лежащих в основе развития болезней, и позволило по-новому взглянуть на их патогенез. Исследование молекулярных основ болезней связано с идентификацией путей передачи клеточных и межклеточных сигналов (Пальцев М.А., 1999; Ярилин А.А., 2001). В настоящее время расшифрованы молекулярные основы костимуляции, осуществляемые с участием молекул CD 28 и CD 40. Сигналы, поступающие в Т клетку через комплекс TCR — CD 3, недостаточны для индукции экспрессии генов активации. Эти процессы усиливаются, благодаря сигналам, запускаемым через молекулу CD 28. Отсутствие одного из компонентов комплекса активации приводит к дефектам активации и, следовательно, и иммунной защиты (Талалаев В.Ю., 2000; Ярилин А.А., 2001). Взаимодействие молекул CD28 с любой молекулой группы В7 необходимо для активации CD4+. В отсутствии костимулирующего сигнала развивается анергия. Сигнал CD40 и CD40L имеет противоположную направленность и служит хелперным стимулом для дифференцировки В - лимфоцитов. Двунаправленные взаимоотношения между клетками иммунной системы, отражают многоклеточный симбиоз в пределах многоклеточного организма, обеспечивая полноценность иммунной защиты. Типичным результа I том взаимодействия является активация клеток с включением программ пролиферации дифференцировки или апоптоза. В доступной литературе имеются единичные работы по изучению молекул костимуляции (CD28 и CD40) у детей первых месяцев жизни (Талалаев В.Ю., 2000). CD28 - маркер костимуляции CD3 для усиления их пролиферативной активности и повышения способности к синтезу цитокинов. Приведенные данные явились предпосылкой для изучения мембранных молекул CD28 и CD40 у детей первых месяцев жизни с клиническими проявлениями герпесвирусной инфекции. У детей с тяжелым течением ЦМВИ отмечалось достоверное (р 0,04) снижение отно-сительного количества активированных клеток с маркерами активации CD3+CD28+ (таблица 40) на фоне достоверного снижения CD 28 в популя ции в сравнении с детьми контрольной группы. Наряду с этим достоверно возрастало (р 0,01) количество CD3+CD28- (таблица 41). Обращает внима ние, что только в этой группе уровень CD3-CD28+ оставался на уровне кон трольных значений и не снижался как в других группах больных. При сред нетяжелой форме ЦМВИ также отмечалось снижение относительного и аб солютного количества активированных клеток с маркерами активации CD3+CD28+ при снижении количества клеток, экспрессирующих CD 28, при этом не отмечалось возрастания числа клеток CD3 без маркеров активации CD28 (CD3+CD28-). Изменения иммунологических показателей при инфек ции, вызванной вирусом простого герпеса, характеризовались достоверным снижением числа клеток с маркерами активации CD3+CD28+ и увеличением числа клеток без маркеров активации CD3+CD28-. Эпштейна-Барр вирусная инфекция не сопровождалась существенными отличиями в содержании лим фоцитов CD3+CD28+. Таким образом, при ЦМВИ, тяжелой форме более вы сокий, чем в других группах больных, уровень абсолютного и относительно го количества клеток без маркеров активации CD3+CD28- и более выражен ное снижение числа клеток с маркерами CD3+CD28+, через которые прово дятся в клетку костимулирующие сигналы, необходимые для активации Т хелперов, вызвало угнетение клеточного звена иммунитета на внедрения па тогена (рисунки 3, 4). Это являлось одной из причин более тяжелого тече ния заболевания у пациентов этой группы по сравнению с другими группами больных. Как и при взаимодействии антиген представляющей клетки с Т хелперами, при Т-В кооперации имеется двусторонняя направленность сиг налов, однако преобладающее направление их в этом случае от Т к В клетке, поскольку при этом активируется В-лимфоцит. В осуществлении такого типа кооперации основная роль принадлежит взаимодействию двух пар молекул: CD40 В-клеток и CD40L (Ярилин А.А., 1999).
Прогноз частых ОРВИ на первом году жизни у детей, перенесших цитомегаловирусную инфекцию в первые месяцы жизни
Целью данного фрагмента исследований явилась разработка критериев прогноза тяжелых форм ЦМВИ у детей первых месяцев жизни. Выбор ЦМВИ связан с тем, что именно эта инфекция преобладала среди изучаемых нами герпесвирусных инфекций. Нами было проведено сравнение иммунологических показателей в двух группах: 1.1 — ЦМВИ, типичная генерализованная форма (тяжелая) - 67 человек (30,3 %); 1.2 - ЦМВИ, типичная генерализованная форма с неполной клинической симптоматикой (среднетяжелая) - 80 человек (36,2 %). Исследование цитокинов и показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета проводили в сыворотке крови в начале заболевания, после того, как диагноз ЦМВИ был подтвержден методами ПЦР и ИФА. Решение поставленной задачи проводили в два этапа: 1. Для выбора статистически значимых параметров для прогноза формы ЦМВИ был применен метод деревьев классификации. 2. Для получения формулы прогноза тяжелой или среднетяжелой формы ЦМВИ с использованием отобранных методом деревьев классификации параметров был применен метод логистической регрессии. Деревья классификации - это метод автоматического анализа данных, позволяющий предсказывать принадлежность наблюдений к тому или иному классу категориальной переменной в зависимости от предикторных переменных (Murthy S., 1997). Одним из наиболее важных свойств дерева классификаций является возможность последовательного (иерархического) изучения влияния отдельных переменных в отличие от дискриминантного анализа. Нами использовано ветвление по методу CART (Classification and Regression Trees), которое при построении дерева осуществляет полный перебор всех возможных вариантов одномерного ветвления. Это алгоритм построения бинарного дерева решений - дихотомической классификационной модели. Каждый узел дерева при разбитии имеет только двух потомков. В связи с тем, что при этом производится полный перебор вариантов, есть гарантия, что будет найден вариант ветвления, дающий наилучшую классификацию. Таким образом, нами использован метод деревьев классификаций, который можно охарактеризовать как набор иерархических, чрезвычайно гибких средств предсказания принадлежности наблюдений к определенному классу значений категориальной, зависимой переменной по значениям одной или нескольких предик-торных переменных. При этом для одного и того же объекта прогноз может делаться несколько раз. По своей конечной цели - достижению точного прогноза - анализ методом деревьев классификации не отличается от классических методов. После того, как были выявлены статистически значимые иммунологические параметры, был применен метод логистической регрессии и ROC-анализа. Логистическая регрессия - это разновидность множественной регрессии, общее назначение которой состоит в анализе связи между несколькими независимыми переменными и зависимой переменной (Zweig M.N., 1993). Вычислив стандартные коэффициенты регрессии, можно с помощью логистической регрессии оценить вероятность того, какая форма заболевания будет иметь место для конкретного больного. Зависимость, связывающую вероятность тяжелой или среднетяжелой формы ЦМВИ и величину иммунологических параметров, мы представляли в виде формул. Для оценки качества модели логистической регрессии был применен ROC — анализ, что является несомненными ее преимуществом. ROC- кривая — это характеристическая кривая (Reception Operator Characteristic), которая показывает зависимость количества истинно положительных и ложно отрицательных результатов. Чувствительность можно сравнивать при данной специфичности и, наоборот, 194 специфичность при фиксированной чувствительности. Чувствительность снижается при росте специфичности. Характеристическая кривая теоретически не имеет существенных преимуществ перед зависимостью чувствительность - специфичность. Однако с ее помощью можно установить зависимость между чувствительностью и специфичностью. Основным достоинством характеристической кривой является совместное описание количества истинно положительных результатов, т.е. пользы истинно положительных решений и количества ложноположительных результатов - вреда ложнопо-ложительных решений. Это позволяет выбрать на кривой точку, которая будет соответствовать максимуму «пользы» или «минимуму» вреда (Davis J., Goadrich М., 2006). Эта точка, в которой чувствительность и специфичность совпадают, называется точкой разделения (или точкой баланса) и является величиной признака, с помощью которой наилучшим образом разделяют обследуемые группы. Превышение точки разделения считается достаточным основанием для качественной оценки. Ошибкой является стремление к минимуму числа ложных результатов. При этом подходе уравниваются ложно-положительные и ложноотрицательные результаты. Цена их последствий никогда не бывает одинаковой (Власов В.В., 1988). При анализе иммунологиче-ских показателей у детей с герпесвирусной инфекцией мы исходили из того, что ложноположительный результат не так опасен, как ложноотрицательный, т.е. оставление без обследования и лечения больного ребенка. Максимальной информативностью диагностический тест обладает при такой точке разделения, которая соответствует максимальной удаленности характеристической кривой от положительной диагонали. Чем изгиб характеристических кривых больше и положение выше, тем сильнее различаются между собой группы по изучаемому признаку. Наиболее универсальным и достаточно простым методом оценки характеристических кривых является метод оценки площади под кривыми. При визуальной оценке ROC- кривых расположение их относительно друг друга указывает на их сравнительную эффективность. Кривая, расположенная выше и левее, свидетельствует о большей предсказательной способности модели. При расчете прогноза формы заболевания (тяжелая или среднетяже-лая), применяя дерево решений с использованием в качестве исходных параметров значения уровней цитокинов ИЛ2, ИЛ4, ИФН - а, ИФН - у, ФНО - а в начале заболевания, мы получили следующие предсказывающие условия для прогноза ЦМВИ типичной генерализованной формы (тяжелой формы): а) если уровень 311,45 пг/мл — ИФН-у 570,2 пг/мл и уровень ИФН-а 26,7пг/мл, (7) то с достоверностью 100% и при уровне значимости р = 0,05 прогнозируется ЦМВИ типичная генерализованная форма (тяжелая форма); б) если уровень ИФН-у = 570,2 пг/мл, (8) то с достоверностью 100% и при уровне значимости р = 0,05 прогнозируется ЦМВИ, типичная генерализованная форма (тяжелая форма). Предсказывающее выражение для прогноза ЦМВИ генерализованной типич ной формы с неполной клинической симптоматикой (среднетяжелая форма) выглядит следующим образом:
Похожие диссертации на Клинико-патогенетические аспекты герпесвирусных инфекций у детей первых месяцев жизни
