Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Современные представления о распространённости, факторах риска развития атопических заболеваний 13
1.2. Особенности иммунологических показателей пуповинной крови новорождённых детей 21
1.3. Значение иммунной системы и ЦНС в поддержании гомеостаза организма при аллергической патологии 26
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Объект и объем исследования 31
2.2. Иммунологические методы исследования 32
2.3. Статистические методы анализа 35
ГЛАВА 3. Общая клиническая характеристика обследованных беременных и новорожденных 36
3.1. Общая клиническая характеристика 153 беременных, включенных в исследование (1 этап исследования) 36
3.2. Общая клиническая характеристика 153 новорожденных, включенных в исследование (1 этап исследования) 40
3.3. Иммунологические показатели пуповинной крови обследуемых новорожденных 41
ГЛАВА 4. Влияние генетических и внешнесредовых факторов антенатального периода, течения беременности и родов на субпопуляционный состав лимфоцитов пуповинной крови новорожденных 44
4.1. Влияние генеалогического анамнеза по атопическим заболеваниям на субпопуляционный состав лимфоцитов пуповинной крови новорожденных ..44
4.2. Иммунологические показатели пуповинной крови ребёнка в условиях ксеногенного воздействия 53
4.3. Микроэкологические факторы, действующие на беременную женщину и состояние иммунитета новорожденного 58
4.4. Влияние размера семьи и порядка рождения на внутриклеточную продукцию интерферона-у (ИНФ-у+) мононуклеарами пуповинной крови (МПК): «гигиеническая гипотеза» и «гипотеза внутриматочного программирования» формирования атопии 60
ГЛАВА 5. Связь иммунологических параметров пуповинной крови с течением перинатального периода новорожденных 63
ГЛАВА 6. Факторы риска формирования атопического дерматита 75
6.1. Общая клиническая характеристика 62 беременных и 62 детей грудного возраста, включенных в исследование (2 этап исследования) 75
6.2. Влияние генетических факторов на формирование АД у детей грудного возраста: данные проспективного анализа 82
6.3. Влияние течения беременности и родов на формирование АД у детей грудного возраста: данные проспективного анализа 83
6.4. Влияние внешнесредовых факторов на формирование АД у детей грудного возраста: данные проспективного анализа 88
6.5. Влияние антропометрических данных матери и ребенка на формирование АД у детей грудного возраста: данные проспективного анализа 91
6.6. Влияние общего количества эпизодов гипертермии, ОРВИ и диареи на формирование АД у детей грудного возраста: данные ретроспективного анализа 94
6.7. Влияние течения перинатального периода на формирование АД у детей
грудного возраста: данные ретроспективного анализа 102
6.8. Влияние питания матери и ребенка на формирование АД у детей грудного возраста: данные проспективного и ретроспективного анализа 103
6.9. Влияние содержания активированных Th2 мононуклеаров без внутриклеточного ИНФ-у+ и CD 26+ лимфоцитов пуповинной крови на размеры рубчика БІДЖ и формирование АД у детей грудного возраста: данные проспективного и ретроспективного анализа 106
6.10. Состав пуповиннои крови у детей с развившимся атопическим дерматитом и без развившегося атопического дерматита 107
Заключение 111
Выводы 127
Практические рекомендации 128
Список литературы 130
- Современные представления о распространённости, факторах риска развития атопических заболеваний
- Общая клиническая характеристика 153 беременных, включенных в исследование (1 этап исследования)
- Влияние генеалогического анамнеза по атопическим заболеваниям на субпопуляционный состав лимфоцитов пуповинной крови новорожденных
- Общая клиническая характеристика 62 беременных и 62 детей грудного возраста, включенных в исследование (2 этап исследования)
Введение к работе
За последние десятилетия произошел значительный рост распространенности атопических заболеваний (атопического дерматита, бронхиальной астмы, поллиноза, аллергического ринита) практически во всех странах мира. Эта тенденция позволила исследователям обозначить последовательное развитие аллергических реакций у предрасположенных к атопии лиц как «аллергический марш» (Локшина Э.Э., Зайцева О.В., 2006). Заболеваемость указанными болезнями, особенно в детской популяции, настолько высока, а возможности профилактики и терапии настолько ограничены, что фундаментальные исследования в этой области еще долгое время не потеряют своей актуальности (Scezch W., 1992; Begishvili Т.В., 1996; Смирнова СВ., 1997; Andreassi М., Forleo Р., 1997; Островский И.М., 2000; Короткий Н.Г., 2000; Прахин Е.И., 2000; Зайцева СВ., 2001; Княжеская Н.Н., 2001; Золотова И.А., 2001; Альбанова В.И., 2002; Смирнова Г.И., 2002; Иванов, О.Л., 2004).
Эпидемиологические исследования, проведённые во многих странах мира (Англия, Болгария, Венгрия, Германия, Польша, Россия, США и многие другие), свидетельствуют, что от 10 до 30% городского и сельского населения, проживающего в областях с высокоразвитым экономическим потенциалом страдает аллергическими заболеваниями (А. Д. Адо, 1990; А. Г. Чучалин, 1999, 2001; Anderson, 1993).
Изучение естественных иммунных механизмов формирования атопии, как основного патогенетического звена атопических болезней, играет первостепенную роль в таких исследованиях. Большинством исследователей признается ведущая роль дисбаланса в системе Т-хелперов (Thl/Th2-лимфоцитов) в сторону преобладания Т1і2-ответа избыточной продукции IgE при контакте с широко распространенными экзоаллергенами - атопии (Медуницын Н.В., 1999; Соловей Т.Н., 1999; Смолкин Ю.С, 2000; Намазова Л.С, 2000; Федосеева В.Н., 2006; Локшина Э.Э., Зайцева О.В., 2006; Романцов
М.Г., 2006). Исследование цитокиновой регуляции атопии используется в последнее время достаточно широко. Однако в большей части таких работ в качестве маркерного предиктора использован уровень IgE, реже используются уровень цитокинов и фенотипирование лимфоцитов (Резник И.Б., 1989; Воронова А.В., 1989; Hansen L.G., 1993; Banks W.A.. 1995; Mazor М., 1995; Талаев В.Ю., 1999, 2001; Дигилова Н.Д., 2000; Каап А.. 2000; Гавриш Т.В., 2000; Ревякина В.А., 2000; Трофимова И.Б., 2001; Ветров В.П.. 2001; Бережная Н.М., 2002, 2006; Батенева Е.И., Трофимов Д.Ю., Хаитов P.M., 2001, 2006). Описаны возрастные особенности иммунной системы у детей старшего возраста с атопическим дерматитом (Шамов Б.А., 1999).
Наиболее признанная в настоящее время «гигиеническая гипотеза» роста атопических болезней, в качестве причины преобладания Тп2-ответа называет снижение стимуляции ТЫ естественными микробными и вирусными возбудителями (Strachan, DP., 2000; Вискова Н.Ю., 2003; Гордеева Л.А., 2005). Однако совершенно неясным остается «критический возраст», в котором происходит критический сдвиг в сторону преобладания Тп2-активности, в частности, не установлено, может ли такое изменение происходить антенатально.
Выявление «критического возраста» формирования дисбаланса в
системе Thl/Th2-лимфоцитов важно по причинам острой необходимости
донозологической диагностики с целью превентивной профилактики атопии
и реальной возможностью вмешаться в процесс созревания иммунной
системы. С целью однозначного фенотипического маркирования для
выделения ТЫ и Тл2-лимфоцитов рекомендуется исследование комплекса
поверхностных антигенов (кластеров дифференцировки)
(CD30,CD62L,CCR3,CCR4 - ТЬ2-профиль и CD26,CCR5,CXCR3 - Thl-профиль) (Katoh N., 2000; Bock О., 2001; Schade R. P. , Van Ieperen-Van Dijk A. G., Versluis С et al. 2002; Holmlund U., Bengtsson A., Nilsson C. et al.. 2003; Lorenzo, 2003).
Таким образом, предлагаемое изучение субпопуляционного состава
лимфоцитов в пуповинной крови, как возможного предиктора формировании
атопии является актуальным и обладает достаточной научной новизной для
фундаментальной аллергологии. Исследование направлено на решение задач
по позициям «технологии живых систем» перечня "Приоритетные
направления развития науки, технологий и техники РФ" и «технологии
иммунокоррекции» перечня "Критических технологий Российской
Федерации". Цель научного исследования:
Изучить клинико-патогенетическую взаимосвязь иммунологических показателей пуповинной крови новорожденных с пренатальными факторами риска формирования атопического фенотипа и оценить прогностическую значимость различных маркеров баланса Thl/Th2 лимфоцитов в момент рождения ребенка для оценки риска формирования атопического дерматита грудного возраста. Задачи научного исследования:
Провести проспективное наблюдение за детьми от рождения до 12 месяцев и выявить взаимосвязь особенностей генеалогического анамнеза, течения беременности и родов с формированием атопического дерматита у детей грудного возраста.
В возрасте 12 месяцев среди обследованных детей проанализировать ретроспективные данные и выявить взаимосвязь клинических проявлений атопического дерматита с рецидивирующими инфекциями респираторного тракта, эпизодами диареи и особенностями вскармливания на первом году жизни.
Исследовать влияние известных эпидемиологически верифицированных факторов риска формирования атопии на субпопуляционный состав мононуклеаров пуповинной крови, с оценкой внутриклеточной продукции интерферона-у+, соотношения
CD26+ и CD30+ мононуклеаров и концентрации общего IgE пуповинной крови.
На основании анализа субпопуляционного состава мононуклеаров пуповинной крови выявить связь особенностей формирования пренатального иммунитета с клиническими проявлениями поражения центральной нервной системы новорожденного ребенка.
Оценить субпопуляционный состав мононуклеаров и содержание различных классов иммуноглобулинов пуповинной крови в качестве предикторов формирования атопического дерматита и рецидивирующих инфекций респираторного тракта у детей грудного возраста.
Сформировать научно обоснованные рекомендации по профилактике атопического дерматита в зависимости от иммунного статуса новорожденного, определенного по субпопуляционному составу мононуклеаров пуповинной крови.
Новизна исследования:
Впервые при анализе внутриклеточной продукции интерферона-у+ мононуклеарами пуповинной крови установлена пренатальная поляризация в системе Thl/Th2 лимфоцитов, ассоциированная с эпидемиологически верифицированными факторами риска формирования атопического фенотипа у детей.
Впервые на основе данных проспективного наблюдения когорты новорожденных установлена высокая прогностическая значимость низкого содержания мононуклеаров пуповинной крови, продуцирующих интерферон-у+, в отношении формирования атопического дерматита у детей грудного возраста.
Впервые показана связь концентрации общего IgE пуповинной крови с количественным содержанием мононуклеаров с экспрессией маркеров CD26+ и CD30+ и установлено отсутствие
прогностической значимости этих показателей в отношении формирования атопического дерматита у детей грудного возраста. Положения, выносимые на защиту:
Наиболее значимыми факторами риска формирования атопического дерматита у детей грудного возраста являются положительный атопический семейный анамнез, социальный статус родителей (служащие) и вес при рождении менее 2900 г.
Пренатально сформированный дисбаланс в системе Thl/Th2, выражающийся в низком содержании мононуклеаров пуповинной крови, способных продуцировать интерферон-у+, ассоциирован с наиболее важными эпидемиологическими факторами формировании атопического фенотипа у детей.
Низкое содержание неактивированных мононуклеаров, продуцирующих интерферон-у+ (субтип IFNy+/CD69-), является иммунологическим фактором риска формирования атопического дерматита у детей грудного возраста, в то время как, уровень общего IgE и отношение CD26+/CD30+ в пуповинной крови не обладают прогностической значимостью в отношении данного заболевания.
Практическая значимость работы:
Для практического здравоохранения предложена система формирования групп детей с высоким риском развития атопического дерматита, которая предусматривает проведение ранних превентивных мероприятий с сочетанием анамнестических (положительный атопический семейный анамнез, социальный статус родителей (служащие), вес при рождении менее 2900 г.) и лабораторно-иммунологических (низкое содержание ИНФ-у+ / CD69-) маркеров.
Выявление дисбаланса в системе Thl/Th2 - лимфоцитов (пониженное содержание CD26+ лимфоцитов, высокие концентрации IgE и снижение содержания клеток, продуцирующих ИНФ-у+), а также увеличение
содержания естественных киллерных клеток (CD16+CD56+) пуповинной крови новорожденных с нарушениями со стороны нервной системы может служить диагностическим критерием формирования и прогностическим критерием тяжести течения перинатальной патологии центральной нервной системы (ЦНС).
Показатели содержания основных субпопуляций мононуклеаров пуповинной крови (МІЖ) у новорожденных предложены для лечебно-профилактических учреждений Красноярского края как региональные нормативно-референтные величины оценки формирования пренатального иммунитета. Внедрение результатов исследования:
Результаты проведенных исследований внедрены в практическую работу 2-го детского отделения ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (г. Красноярск), МУ Центра реабилитации для детей и подростков с ограниченными возможностями «Радуга» (г. Красноярск), в учебный процесс кафедры фармакологии с курсами клинической фармакологии, фармацевтической технологии и курсом ПО, кафедры поликлинической педиатрии и пропедевтики детских болезней ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Росздрава. Апробация материалов диссертации:
Материалы работы были представлены на итоговых научных конференциях института медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Метаболические механизмы иммунореактивности» (Красноярск, 2004); на 12-м Российско-Японском симпозиуме (Красноярск, 2005); на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями (Красноярск, 2005); на Европейском Респираторном Конгрессе (Копенгаген, 2006); на Европейском
Респираторном Конгрессе (Стокгольм, 2007); на 17-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Казань, 2007); на научно-практической конференции, посвященной 90-летиюсо дня рождения академика К.Р. Седова (Иркутск, 2008); на научно-практической конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Кызыл, 2008); на межлабораторном заседании сотрудников ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск, 2008). Публикации:
По теме диссертации опубликовано 30 печатных работы в местной и центральной печати, из них 5 - в журналах, рекомендуемых ВАК. Получен патент на изобретение Пат. 2331881 Российская Федерация, МПК G 01N 33/38. Способ определения риска развития атопических заболеваний у новорожденных детей/ СЮ. Терещенко, И. А. Новицкий, Л. В. Васильева; Краснояр. гос. мед. акад. - № 2007108866/15; опубл. 20.08.2008, бюл. № 23. -3 с. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение. Способ прогнозирования развития атопического дерматита у новорожденных. / Терещенко С.Ю., Васильева Л.В., Исаков И.В. и др. Заявка № 2007107288/15(007930); заявлено 26.02.2007 г.; приоритет 26.02.2007 г. Заявитель и патентообладатель ГУ НИИ МПС СО РАМН; решение о выдаче патента 17.12.2007 г. Структура и объем работы:
Диссертация содержит 157 страниц машинописного текста, 24 таблиц, 14 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список использованной литературы включает 250 источников, в том числе 175 отечественных и 75 зарубежных авторов.
Современные представления о распространённости, факторах риска развития атопических заболеваний
В структуре аллергических заболеваний (A3) у детей ведущее место занимают атопический дерматит (АД), бронхиальная астма (БА) и аллергический ринит (АР) (Студеникин М.Я., Балаболкин И.И., 1998; Larsen F., 1993; Bergmann R., 1994). Эпидемиологические исследования, проведённые 20 лет назад во многих странах мира (Англия, Болгария, Венгрия, Германия, Польша, Россия, США и многие другие), показали, что в это время от 10 до 30% городского и сельского населения, проживающего в областях с высокоразвитым экономическим потенциалом страдали аллергическими заболеваниями (А. Д. Адо, 1990; А. Г. Чучалин, 1999, 2001; Anderson, 1993). В США количество больных с аллергией в эти годы превышало 40 млн человек, из них 8,9 млн страдали БА, 20-30 млн -поллинозом, 11,8 млн - другими аллергическими заболеваниями. На основании статистических данных США, уровень распространения БА среди детей за 1980 - 1989 гг. увеличился на 29%. В 23% случаев БА являлась причиной пропуска занятий в школах США и оставалась ведущей причиной госпитализации детей. В России распространённость A3 в 90-е годы по данным эпидемиологических исследований колебалась от 13,9 до 20% (Ильина Н.И., 1996).
За последнее десятилетие двадцатого столетия и в начале третьего тысячелетия сохраняется высокий процент распространённости аллергических реакций и заболеваний у детей. По данным официальной статистики, до 20% населения промышленно развитых стран страдают аллергическими заболеваниями (Федосеева В.Н., Иванов В.Д., 2006). В разных регионах России ими страдает от 15 до 35% детского населения (Локшина Э.Э., Зайцева О.В., 2006). Наряду с повсеместным ростом распространённости A3, согласно данным ВОЗ, ежегодно отмечается повышение показателя смертности при таких болезнях, как БА, анафилактический шок, острые токсикоаллергические реакции (Чучалин А.Г., Огородова Л.М., 2001). АД страдают в развитых странах 10% детей. Начинаясь в 60% случаев в младенческом возрасте и в 85%) - в пределах первых пяти лет жизни ребенка, проявления АД могут длиться неопределенно долго, причиняя много страданий и самому ребенку, и его родителям (Мс Nally N.J., Philips D.R., Williams H.S., 1998).
Под широко распространенным термином «атопия» понимают наследственную предрасположенность к аллергическим реакциям в ответ на сенсибилизацию определенными антигенами. Термин «атопия» был введен в 1923 г. американскими учеными R.F. Coca и R.A. Cooke для описания клинических проявлений гиперчувствительности к белковым и белковоподобным веществам при бронхиальной астме и аллергическом рините. С этого времени атопическая экзема, атопический нейродермит и почесуха Бенье были отнесены к группе атопических заболеваний и постепенно стали обозначаться более общим термином - АД. Сами авторы определяли атопию как необыкновенную реакцию на аллергенное воздействие, свойственное только человеку. При этом обязательным атрибутом атопии являлись семейная отягощенность и образование в ответ на аллергенную стимуляцию патологических антител - реагинов (Coca A.F., Cooke R.A.., 1923)
Продолжив исследования, R.A. Cooke предлагает в 1930 г. первую, и наиболее известную, классификацию аллергических реакций, в которой выделяет аллергические реакции немедленного типа и аллергические реакции замедленного типа. Много позже открытия R.F. Coca и R.A. Cooke были дополнены и окончательно подтверждены: в 1967 г. группа Ишизака показала, что реагины представляют собой уникальный класс иммуноглобулинов - иммуноглобулин Е (IgE), позже P.Gell и R.Coombs дополнили классификацию иммунопатологических реакций до 4 типов (Gell P.G., Coombs R.R., 1975).
Постепенно термин АД в зарубежной литературе стал преобладающим (Gratziou Ch., Priftis К., Tatsis G., 1996). Гораздо сложнее он приживался в России. Тесное переплетение АД с понятием экссудативного диатеза, наряду с общей путаницей в терминологии, надолго задержало его повсеместное признание. Лишь в конце 20 столетия термин АД окончательно укоренился в нашей стране и достаточно прочно вошел в практику врачей различного профиля (Карачинцева Н.В., 2004). И, наконец, усилиями многих авторов в 2000г. была создана первая в1 России научно - практическая программа «Атопический дерматит у детей: диагностика, лечение и профилактика», в которой под термином «атопический дерматит» подразумевалась иммунологическая концепция патогенеза заболевания, базирующаяся на понятии атопии как генетически обусловленной способности организма к выработке высокой концентрации общего и специфических IgE антител в ответ на действие аллергенов окружающей среды (Балаболкин И.И., 1991; Научно-практическая программа «Атопический дерматит у детей: диагностика, лечение и профилактика».-Москва.-2000; Терещенко С.Ю., 2002).
В октябре 2003 г. Комиссия Номенклатурного комитета Всемирной организации по аллергологии определила атопию как индивидуальную или семейную предрасположенность к синтезу IgE антител в ответ на низкие дозы аллергенов, как правило, белковой природы и развитию типичных симптомов, таких как астма, риноконъюнктивит или экзема. В тоже время существует другая точка зрения: по утверждению В.И. Пыцкого (2000,2002) атопия - это не только иммунный механизм, а феномен, в развитии которого принимают участие как иммунные, IgE-опосредованные, так и неиммунные механизмы.
Причинно значимыми в развитии A3 у детей могут быть пищевые, пыльцевые, лекарственные аллергены, аллергены домашней пыли, клещей домашней пыли, животных, пера птиц, спор плесневых грибов, химические соединения. При этом прослеживается связь развития аллергического поражения отдельных органов и систем с определёнными аллергенами. Так, у детей раннего возраста возникновение АД чаще всего связано с пищевой сенсибилизацией, БА и АР - с сенсибилизацией к аллергенам домашней пыли, клещей домашней пыли, аллергического конъюнктивита (АК) - с сенсибилизацией к пыльцевым аллергенам. У 70-95 % детей, страдающих респираторными аллергозами, выявлена взаимосвязь с предшествующими рецидивирующими инфекциями органов дыхания, которые, поражая слизистые оболочки дыхательных путей и стенки бронхов, нарушают их барьерную функцию, облегчают проникновение аллергенов через измененный эпителиальный покров (Хаитов М.Р., 2001, Самсыгина Г.А., 2005).
На распространённость атопии влияют климатические различия в концентрации аллергенов (в регионах с влажным климатом больше спор плесневых грибов, а в высокогорье и на Крайнем Севере мало пыльцы); степень индустриального загрязнения воздуха, наличие в воздухе химических аллергенов (никель, хром, формальдегид); жилищные условия (вентиляция, пассивное курение, наличие ковров, мягкой мебели, животных аэрополлютантов) (Федосеева В.Н., Иванов В.Д., Федоскова Т.Г., 2006).
Общая клиническая характеристика 153 беременных, включенных в исследование (1 этап исследования)
Были проведены клинические наблюдения, иммунологические исследования различных классов иммуноглобулинов и субпопуляционного состава лимфоцитов пуповинной крови у 153 детей. За данными детьми в дальнейшем проведено проспективное наблюдение.
Клиническое обследование детей включало в себя: - сбор анамнестических данных при беседе с родителями методом интервью с заполнением специально разработанной анкеты, включающей данные по течению беременности, генеалогическому анамнезу, о районе и условиях проживания. Анализ родов и течения периода новорожденности проводились по медицинской документации. Проанализированы такие факторы, как патология беременности, наличие профессиональных вредностей и приём лекарственных препаратов во время беременности, пассивное курение, бытовое окружение женщины и злоупотребление аллергенными продуктами во время беременности, патология родов. Учитывались такие факторы, как характер питания беременной и ребенка, заболеваемость, реакции на профилактическую вакцинацию, аллергические реакции в течение первого года жизни. В целом анкетированы родители 153 детей. Таким образом, для дальнейшего исследования клинико- анамнестических данных была использована "очищенная" выборка, состоящая из 153 детей. Данная выборка состояла из детей, достоверно не имеющих на момент обследования аллергических заболеваний. 2.2 Иммунологические методы исследования.
На базе двух родильных домов г. Красноярска (родильного дома № 5 и родильного дома № 6) проведен забор пуповинной крови 153 доношенных новорождённых, у которых внутриутробное развитие и ранний период адаптации протекали физиологически, с последующим типированием лимфоцитов, количественным определением цитокинов и иммуноглобулинов. У детей, включенных в исследование, определяли следующие иммунологические показатели: абсолютное и относительное содержание лимфоцитов с различными поверхностными маркерами (CD3+, CD4+, CD8+, CD 19+, CD16+56+); уровни IgA, IgG, IgM. Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов пуповинной крови оценивали с помощью метода проточной цитофлюориметрии, используя FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) и реагенты Simul Test 1MK - lymphocyte Kit (USA). Анализ проводили, используя программу Simul SET.
Для верификации баланса Thl/Th2 активности использованы следующие маркеры: количественное содержание общего IgE плазмы крови, процентное содержание CD26+ и CD30+ лимфоцитов и их отношение, процентное количество клеток, синтезирующих ИНФ-у+, после стимуляции фитогемагглютинином (ФГА) (раздельно для общей популяции лимфоцитов и Т1і(С04+)-лимфоцитов). Оценка внутриклеточной продукции ИНФ-у+ проводилась раздельно для лимфоцитов имеющих и не имеющих маркер активации - CD69+.
У всех детей для иммунологического исследования забиралось 10,0 мл пуповинной крови в момент родов. Количественное определение иммуноглобулинов класса А, М, G и общего IgE проводилось иммуноферментным методом с помощью наборов ИФА — БЕСТ - стрип фирмы ЗАО «Вектор - БЕСТ». Результаты исследования выражались в г/л (граммах на миллилитр) (IgA, IgM, IgG) и в мЕД/мл (международных единицах на миллилитр) (IgE).
Для исследования популяций лимфоцитов был использован метод проточной цитометрии на проточном цитометре FACS Calibur с помощью программы Simul SET на базе Красноярского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями. В основе метода проточной цитометрии лежит измерение оптических свойств клеток. Клетки по одиночке вводятся в ламинарный поток в проточной кварцевой кювете, где они пересекают сфокусированный световой пучок, не касаясь стенок кюветы. Источником света могут быть различные типы лазеров, ультрафиолетовая лампа или их комбинация. Свет определённой длины волны возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с отдельным клеточным компонентом, при этом может происходить одновременное возбуждение разных красителей, что позволяет оценивать сразу несколько клеточных параметров. С помощью гейта (способа выделения области исследуемых клеток) получают дот-плоты - графики распределения клеток по квадрантам в зависимости от типа флуоресцентных сигналов, идущих с поверхности клеток. В своих исследованиях мы использовали набор двухцветных реагентов Simultest ТМ IMK-Lymphocyte Beston Dickinson. В пробирки вносили по 20 мкл антител CD3+/CD19+, CD4+/CD8+, CD3+/CD16+CD56+, добавляли кровь и инкубировали при комнатной температуре в темноте. Затем добавляли разведённый дистиллированной водой 1:10 лизирующий раствор, тщательно перемешивали. Инкубировали при комнатной температуре в темноте. Центрифугировали исследуемые образцы. После удаления супернатанта добавляли 2 мл CellWash, тщательно перемешивали и центрифугировали. Повторно добавляли 2 мл CellWash после удаления супернатанта. Тщательно перемешивали и анализировали на проточном цитометре FACS Calibur с помощью программы Simul SET. Для исследования экспрессии маркёров CD26+ и CD30+ на лимфоцитах пуповинной крови в пробирки внесли по 20 мкл антител CD26+ и CD30+, добавляли кровь и инкубировали при комнатной температуре в темноте. Затем добавляли разведённый дистиллированной водой 1:10 лизирующий раствор, тщательно перемешивали. Инкубировали при комнатной температуре в темноте. Центрифугировали исследуемые образцы. После удаления супернатанта добавляли 2 мл CellWash, тщательно перемешивали и центрифугировали. Повторно добавляли 2 мл CellWash после удаления супернатанта. Тщательно перемешивали и анализировали на проточном цитометре FACS Calibur с помощью программы CellGuest, используя пороговое значение по светорассеянию.
Влияние генеалогического анамнеза по атопическим заболеваниям на субпопуляционный состав лимфоцитов пуповинной крови новорожденных
Давно известно, что атопические заболевания или предрасположенность к ним могут передаваться по наследству (Адо В.А., 1997). Анализ родословных позволяет оценить степень риска аллергического заболевания. Так, если в в семье болен один из родителей либо братья и сестры вероятность заболеть у ребенка составляет 20-40%. В случае же, если аллергическими заболеваниями страдают оба родителя, то вероятность заболевания у детей достигает 50-80% (Федосеева В.Н., Иванов В.Д., 2006).
С точки зрения генетики, АД, БА и поллиноз относят к муль-тифакторным, генетически детерминированным заболеваниям. В связи с этим важное значение приобретает поиск наследуемых биологических дефектов, которые могли бы принимать участие в патогенезе БА, АД и поллнноза.
Из 153 обследованных матерей выяснить генеалогический анамнез удалось практически у всех (151). К сожалению 2 родильницы не были опрошены повторно перед выпиской, так как проживают в сельской местности и были выписаны домой внепланово. Оказалось, что у 26,14% обследуемых детей (из них 21 мальчик и 19 девочек) родственники страдают атопическими заболеваниями. В таблице 4 представлено процентное соотношение страдающих A3 и не имеющих A3 родственников обследуемых нами детей. Как следует из таблицы 4, дети в нашем исследовании в большинстве случаев имели отягощенную наследственность в отношении аллергических заболеваний по материнской линии. Так, 21,19% матерей отмечали в анамнезе аллергические заболевания. Эти данные не противоречат эпидемиологическим исследованиям, проведённым во многих странах мира (Англия, Болгария, Венгрия, Германия, Польша, Россия, США и многие другие), которые свидетельствуют, что от 10 до 30% городского и сельского населения, страдает аллергическими заболеваниями (А. Д. Адо, 1990; А. Г. Чучалин, 1999, 2001; Anderson, 1993). Среди отцов обследуемых нами детей аллергическими заболеваниями страдали лишь 3,97% человек. Очевидно, что опрошенные нами женщины не достаточно осведомлены о состоянии здоровья отцов своих детей. С другой стороны, по данным Сидоренко Е.Н. и соавт. (1998), соотношение мужчин и женщин, имеющих кожные проявления атопии составило 1:3,3. Наличие сибсов зарегистрировано у 40 (26,49%) обследованных детей. Аллергические проявления имели 25% сибсов. Бабушки и дедушки обследуемых новорожденных имели в анамнезе аллергические заболевания в 11,25%) случаев. Генеалогический анамнез позволил определить структуру аллергических заболеваний у родственников обследованных новорожденных, что представлено на рисунке 3.
Из рисунка 3 следует, что у большинства матерей (81,25% женщин) и сибсов (81,82% детей) наблюдались кожные проявления атопии. У отцов кожные проявления аллергических состояний наблюдались в 50%) случаев. Среди бабушек и дедушек аллергические состояния наиболее часто проявлялись в виде крапивницы (в 29,41% случаев) и бронхиальной астмы (в 23,52% случаев).
Одним из наиболее значимых биологических дефектов для всей группы атопических болезней является атопия, с характерными для нее особенностями фенотипа циркулирующих лимфоцитов в виде снижения количества клеток, проявляющих активность ТЫ и, наоборот, увеличения клеток с активностью Th2. Однако, до настоящего времени твердо не установлено, могут ли такие особенности формироваться внутриутробно, либо они приобретаются (либо усугубляются) в постнатальный период жизни? Одна из задач исследования заключалась в выявлении различий в содержании отдельных субпопуляций лимфоцитов пупувинной крови новорожденных в зависимости от наличия или отсутствия атопических проявлений у ближайших родственников.
При исследовании установлено четкое снижение количества лимфоцитов, проявляющріх активность ТЫ у детей, родственники которых имели аллергические заболевания. В таблице 5 представлены результаты исследования содержания ИКК в пуповинной крови детей, родственники которых имели аллергические заболевания в сравнении с данными показателями у детей, родственники которых не имели аллергических заболеваний. Из таблицы 5 видно, что содержание мононуклеаров, синтезирующих ИНФ-у+ в пуповинной крови детей с отягощенным аллергологическим анамнезом достоверно ниже, чем у детей, чьи родственники не страдали атопией (р=0,005). Это подтверждает важную роль наследственности в формировании атопического фенотипа. Следует отметить, что снижается как общее количество интерферон-продуцирующих клеток, так и их отдельные субпопуляции. При этом уменьшение содержания мононуклеаров, синтезирующих ИНФ-У+ происходит в основном за счет снижения популяции не активированных интерферон-продуцирующих клеток.
В отношении маркеров, характеризующих баланс в системе Thl/Th2 лимфоцитов установлено снижение количества мононуклеаров, синтезирующих ИНФ-у+ у детей от матерей с положительным аллергологическим амнезом. Процентное содержание интерферон-продуцирующих клеток в пуповинной крови было достоверно ниже в группе детей от матерей с наличием аллергических заболеваний в анамнезе, чем у детей, чьи матери не страдают атопией 0,085 (0-0,15) и 0,205 (0,08-0,335) соответственно, р=0,002.
Общая клиническая характеристика 62 беременных и 62 детей грудного возраста, включенных в исследование (2 этап исследования)
В последние годы, несмотря на проводимые лечебно-профилактические мероприятия, продолжает сохраняться высокий процент распространённости аллергических реакций и заболеваний у детей (Балаболкин И.И., 2002,2003). В этой ситуации важно определить факторы риска формирования атопического фенотипа грудного ребенка, чтобы своевременно осуществить профилактику его развития. С этой целью проведено проспективное наблюдение 62 новорожденных от рождения до 1 года. У новорожденных детей изучен иммунный статус в момент рождения и, в дальнейшем, проведен анализ течения периода новорожденности, характера вскармливания, заболеваемости на 1 году жизни. Также выполнена оценка генеалогического анамнеза обследуемых детей, социального статуса их семей, особенностей микроэкологии проживания.
Первоначально проведено изучение социального положения матерей обследуемых детей (рис. 1 1). В большинстве случаев матери являлись служащими (47%) и домохозяйками (35%). По данным проведенного нами социологического исследования было установлено, что большинство из обследуемых женщин на момент исследования состояло в браке: брак зарегистрирован у 74% матерей, гражданский брак - у 24%, в браке не состоят - 2%. При этом подавляющее большинство женщин имеют среднее образование (72%) и 26% - высшее образование. Для оценки влияния на организм детей ксеногенного воздействия, пылевых, пыльцевых и эпидермальных аллергенов был проведен анализ их среды проживания. В сельской местности проживали 11% семей. Не курят в жилом помещении в 56% семей, курят много - в 19%. Курили во время беременности 24% женщин. Курящие мужья у 77% женщин. Анализ наличия животных в квартирах у обследуемых семей показал следующее: в квартире нет животных у 60% опрошенных, кошки - у 25% семей, собаки - в 15% семей (рис. 12). В большинстве квартир мало пылесборников (82 %), большое количество домашних цветов определялось у 44 % опрошенных. Для оценки влияния конституциональных особенностей матери на формирование атопического фенотипа грудного ребенка проведен анализ показателей роста и веса женщин. В 16% случаев рост матерей был ниже 160 см, вес был равен или превышал 75 кг у 47% матерей. При анализе родословных выявлен отягощенный атопический анамнез у 29% обследуемых детей. Матери новорожденных страдали аллергическим заболеванием в 25% случаев (диатез, экзема, нейродермит, атопический дерматит, крапивница). В результате проведенного анализа течения беременности и родов у обследуемых женщин было установлено, что настоящая беременность протекала под воздействием профессиональных вредностей у 42% опрошенных женщин. Лишь в 10 % случаев весь период беременности продолжался без патологии. В 37% случаев во время беременности женщины злоупотребляли молочными продуктами (молоко более 1 л/сутки, творог более 150 г/сутки); в 48% - употребляли в больших количествах куриные яйца, рыбу, цитрусовые, шоколад. По данным многочисленных исследователей существует связь между формированием атопии и полом (Лусс Л.В., 2003; Пыцкий В.И., 1999; Огородова Л.М., Астафьева Н.Г., 2001). Именно поэтому в работе проведен анализ пола новорожденных, который показал примерно одинаковый процент распределения между мальчиками и девочками - 54 % и 46 % соответственно. Анализ течения периода новорожденности показал, что 92% детей родились доношенными. Вес детей при рождении был равен или превышал 3600 г в 27% случаев, вес новорожденных не превышал 2900 г в 19% случаев. Отсутствие контакта с матерью в родильном зале (выкладывание на живот, присасывание к груди) было отмечено у 34% - 42% детей. Проявления физиологических состояний отмечались у 77% новорожденных. Для оценки влияния вскармливания на формирование аллергических проявлений нами проведен анализ питания детей на первом году жизни. Оказалось, что молоко матери получали с рождения всего 29% обследованных новорожденных, предлактационное питание в виде молочной смеси, донорского молока, глюкозы получали остальные 71% детей. Далее проведен анализ видов вскармливания обследуемых детей на первом году жизни (рис. 13).
