Содержание к диссертации
Введение
Глава I: Обзор литературы 11
1.1. Эпидемиология бронхиальной астмы 11
1.2. Патогенез бронхиальной астмы и роль противовоспалительной терапии 11
1.3. Молекулярные механизмы действия глюкокортикоидов 17
1.3.1. Глюкокортикоидный рецептор: строение и механизм действия 17
1.3.2. Влияние полиморфизма гена, кодирующего глюкокортикоидный рецептор 24
1.4. Современные проблемы 35
1.4.1. Контроль над бронхиальной астмой 35
1.4.2. Неконтролируемая бронхиальная астма 36
1.4.3. Побочные эффекты стероидной терапии 41
1.5. Заключение 43
Глава II: Материалы и методы исследования 45
2.1. Программа и объекты исследования 45
2.2. Клиническая характеристика пациентов 46
2.3. Методы исследования 52
2.3.1. Клинико-инструментальные методы исследования 52
2.3.2. Молекулярно-генетические методы исследования 57
2.3.3. Методы статистической обработки 63
Глава III: Результаты исследования 66
3.1. Распределение аллелей, генотипов и комбинаций генотипов полиморфных маркеров reHaGR 66
3.2. Анализ взаимосвязи фенотипических вариантов течения бронхиальной астмы с полиморфизмом гена GR 78
3.2.1. Особенности течения бронхиальной астмы при различных генотипах Bell полиморфизма гена GR 78
3.2.2. Особенности течения бронхиальной астмы при различных генотипах Tthl 1II полиморфизма гена GR 92
3.2.3. Особенности течения бронхиальной астмы при различных комбинациях генотипов Bell и Tthl 1II полиморфизма гена GR...107
3.2.4. Анализ структуры гена GR в группе детей с тяжелым, непрерывно-рецидивирующем течением бронхиальной астмы 148
Глава IV: Обсуждение полученных результатов 154
Выводы 174
Практические рекомендации 175
Список литературы 176
Приложения 191
- Патогенез бронхиальной астмы и роль противовоспалительной терапии
- Неконтролируемая бронхиальная астма
- Клинико-инструментальные методы исследования
- Особенности течения бронхиальной астмы при различных генотипах Bell полиморфизма гена GR
Введение к работе
На современном этапе бронхиальная астма (БА) принадлежит к числу наиболее распространенных заболеваний у детей в мире. Бронхиальной астмой страдает от 5 до 10% детского населения [4]. Многочисленные исследования демонстрируют тенденцию к росту заболеваемости бронхиальной астмой и утяжелению ее течения [6, 7, 9,22, 30, 92].
Надо отметить, что в более ранних изданиях GINA и созданной на ее основе Национальной программе, на первый план выдвигалась классификация БА по степени тяжести, что и определяло стратегию ее терапии [3, 12, 13]. В новой редакции GINA центральное место для выбора объема терапии отводится не классификации тяжести течения БА, а критериям ее контроля [1, 4]. Однако нельзя не отметить, что используемая многоступенчатая система лечения больных и контроля терапии основывается на клинических данных и недостаточно точных одномоментных измерениях показателей форсированного выдоха больных.
Принимая во внимание наличие хронического аллергического воспаления дыхательных путей у всех больных с персистирующей формой БА [4, 37], ингаляционные глюкокортикостероиды (ИГКС) являются препаратами первой линии в лечении данной патологии. ИГКС обладают выраженным противовоспалительным действием на уровне различных звеньев патогенеза [4, 36, 115]. Существует необходимость выработки объективных точных критериев использования глюкокортикоидов (ПС) и контроля эффективности проводимой терапии, поскольку некоторые пациенты нуждаются в терапии высокими дозами ПС на длительный период, причем снижение дозы приводит к дестабилизации состояния. У части этих пациентов, несмотря на увеличение дозы гормонов, комбинации их с пролонгированными бета2-адреномиметиками, пролонгированными теофиллинами или антагонистами лейкотриенов не удается достигнуть хорошего или полного контроля течения заболевания [17, 40, 64]. Важно распознать этих пациентов на ранних сроках,
7 т.к. отсутствие ответа на терапию часто приводит к неоправданно высоким дозам ГК с развитием побочных эффектов проводимой терапии.
Современные методы, применяемые в медицине, позволяют изучать молекулярно-генетические основы чувствительности к стероидам. В ряде ассоциативных исследований, выявлены изменения чувствительности к стероидам при некоторых структурных особенностях гена глюкокортикоидного рецептора (GR) [43]. Так, например, предполагают наличие связи Bell полиморфизма гена GR, обусловленного заменой цитозина на гуанин в 647 положении во втором интроне гена, с метаболическими изменениями, гиперчувствительностыо гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы к глюкокортикоидам, глюкокортикоид-зависимой вазоконстрикцией [100, 110, 125, 132]. Tthllll полиморфизм, образующийся в результате замены цитозина на тимин в -3807 положении от точки старта транскрипции мРНК в промоторном участке гена, ассоциирован с повышенным базальным уровнем кортизола и относительной резистентностью к ГК [109, 127].
Значительный интерес представляет исследование полиморфизма гена GR, их связи с клиническим течением БА у детей, влиянием на эффективность проводимой терапии ИГКС, поскольку данный вопрос в доступной литературе освящен недостаточно. Все это послужило основанием для выполнения настоящей работы.
Цель исследования. Оптимизация терапии ингаляционными
глюкокортикоидами у детей с бронхиальной астмой различной степени тяжести на основе результатов клинико-инструментального и молекулярно-генетического обследования. Задачи исследования. 1. Сформировать группы детей с различной степенью тяжести Б А на
основании клинико-инструментального, лабораторного обследования и
оценить у них эффективность терапии ИГКС.
Провести молекулярно-генетическое тестирование ВсП и Tthllll полиморфизма гена GR и изучить распределение аллелей и генотипов.
Сопоставить результаты клинико-анамнестических, инструментальных, лабораторных методов исследования с результатами молекулярно-генетического тестирования у детей, получающих ИГКС, в зависимости от пола и тяжести заболевания.
Выделить группу с непрерывно-рецидивирующими,- неконтролируемым течением БА и провести анализ нуклеотидной последовательности 2 экзона гена GR методом секвенирования в этой группе детей.
Оценить влияние выявленных структурных особенностей гена GR на течение БА у детей.
Выявить признаки, позволяющие прогнозировать уровень контроля течения БА и оптимизировать терапию ИГКС у детей.
Основные положения, выносимые на защиту.
Выявлены ассоциации изученных полиморфных маркеров гена GR с особенностями течения заболевания, эффективностью терапии ИГКС и уровнем контроля БА.
Полиморфизм гена GR у детей с тяжелым, непрерывно-рецидивирующим течением БА является одним из важных компонентов, определяющих молекулярно-генетическую основу клинических особенностей течения заболевания и недостаточной эффективности терапии ИГКС.
Подбор индивидуальной терапии ИГКС и прогнозирование эффекта проводимого лечения у детей с БА целесообразно проводить с использованием комплекса клинико-функциональных и молекулярно-генетических методов обследования.
Научная новизна исследования. « Настоящая работа является первым в нашей стране комплексным исследованием, учитывающим наряду с клинико-функциональными характеристиками особенности строения гена GR при терапии ИГКС у детей с БА.
Впервые в нашей стране проведена оценка популяционных частот аллелей и генотипов Bell и Tthl 1II полиморфизма гена GR.
Впервые изучено влияние Bell и Tthl 111 полиморфизма гена GR на течение и формирование БА у детей, в зависимости от пола и степени тяжести заболевания.
Впервые проведено изучение нуклеотидной последовательности 2 экзона гена GR методом прямого секвенирования в группе детей с тяжелым, неконтролируемым течением БА. Выявлены замены во 2 экзоне гена: G198A (22 кодон), G200A (23 кодон), A1220G (363 кодон), описанные в литературе, и замена G633A (167 кодон), ранее не зарегистрированная в базе данных, содержащих информацию о структуре гена GR (GenBank).
Научно-практическая значимость работы. 9 Изученные Bell и Tthl 111 полиморфные маркеры гена GR, ассоциированные с особенностями течения заболевания и эффективностью терапии ИГКС позволяют оптимизировать лечение заболевания у детей с БА.
Результаты изучения нуклеотидной последовательности 2 экзона у детей с
тяжелой, непрерывно-рецидивирующей БА должны рассматриваться как
необходимый этап в молекулярно-генетическом алгоритме исследования
структуры гена GR.
На основании полученных результатов разработаны клинико-генетические критерии оценки и прогнозирования эффективности использования ИГКС и уровня контроля БА у детей. Апробация работы.
Результаты исследования применены в учебном процессе на кафедре госпитальной педиатрии, кафедре факультетской педиатрии ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава, внедрены в праісгику подготовки и усовершенствования специалистов - педиатров кафедры педиатрии им. профессора И.М.Воронцова ФПК и 1111 ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава, а также внедрены в клиническую
10 праісгику детского аллергологического отделения ДГБ №2 им. Св. Марии Магдалины (г.Санкт-Петербург).
Основные положения диссертации представлены на 6 научно-практических конференциях: X Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2006 г.), на котором постерный доклад получил специальную премию в конкурсе молодых ученых; Научно-практической конференции молодых ученых СПбМАПО (Санкт-Петербург, 2006 г.); XVI Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, П Конгресс Евроазиатского Респираторного Общества (Санкт-Петербург, 2006 г.); III Междисциплинарном конгрессе «Ребенок, врач, лекарство» (Санкт-Петербург, 2008 г.), VH Российскиом конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2008 г.), European Human Genetics Conference (Барселона, 2008 г.), XX International Congress of Genetics (Берлин, 2008 г.).
Проведенная работа является разделом НИР кафедры педиатрии им. профессора И.М.Воронцова ФПК и ПП ГОУ ВПО СП6ТПМА Росздрава.
По проблемам диссертации опубликовано 13 печатных работ (11 тезисов и 2 статьи), из них 4 в зарубежных изданиях.
Личный вклад автора в проведенное исследование. Автором самостоятельно проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, изучение данных клинико-инструментального обследования детей и подростков, наследственного анамнеза и катамнеза, создана формализованная история болезни и база данных результатов обследования детей. Молекулярно-генетическое тестирование выполнено автором лично. Анализ, интерпретация, изложение полученных данных, формулирование выводов и практических рекомендаций в основном выполнены автором лично. Доля участия автора в накоплении информации - до 100%, в математико-статистической обработке - более 80%, в обобщении и анализе материала- 100%.
Патогенез бронхиальной астмы и роль противовоспалительной терапии
В настоящее время БА рассматривается как хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, в котором участвует ряд клеток и медиаторов воспаления.
Клинически воспаление в бронхах проявляется бронхиальной гиперреактивностью и обратимой бронхиальной обструкцией. Длительное аллергическое воспаление может приводить к структурным изменениям стенки бронхов - гипертрофии гладкомышечной, разрастанию соединительной ткани, субэпителиальному фиброзу, способствующему утяжелению течения БА за счет прогрессирования необратимой бронхиальной обструкции и бронхиальной гиперреактивности [6,13, 25].
Характерные для болезни морфологические изменения в бронхах сохраняются и в бессимптомный период заболевания, и в стадию стойкой ремиссии. Также не установлено четкой взаимосвязи между степенью тяжести Б А и интенсивностью воспаления [4,13].
Ключевое значение в патогенезе БА имеют эозинофилы, Т-лимфоциты, тучные клетки и антиген-представляющие клетки (в частности, альвеолярные макрофаги). Выделить только один вид ключевых эффекторных клеток невозможно, поскольку многие клетки бронхов и привлеченные в них клетки воспаления вызывают характерные патофизиологические изменения. Так, Th-2-лимфоциты секретируют определенные цитокины (интерлейкины IL-4 и EL-5), вызывающие привлечение и активацию эозинофилов дифференциацию Т-хелперов. Активированные эозинофилы инфильтрируют брохиолы и выделяют секреторные белки гранул, вызывающие отек и активирующие репаративные механизмы. Тучные клетки выделяют гистамин и лейкотриены, тем самым дополнительно усиливая воспаление и проницаемость микрососудов. Все виды клеток, выявленные в бронхах при бронхиальной астме, способные выделять медиаторы, вызывающие повреждающую бронхи воспалительную реакцию [15, 31].
В настоящее время известно более 100 различных медиаторов, участвующих патогенезе БА и развитии сложной воспалительной реакции в дыхательных путях [37]. Сложность каскада воспалительных реакций обуславливает трудности поиска ключевого звена для терапевтического воздействия. Исходя из патогенеза бронхиальной астмы, современная терапия направлена на устранение аллергического воспаления слизистой оболочки бронхов, уменьшение гиперреактивности бронхов, восстановление бронхиальной проходимости и устранение бронхоспазма, предупреждение структурной перестройки стенки бронхов [13]. Препараты, применяемые для терапии БА, направлены на обеспечение проходимости дыхательных путей (препараты, облегчающие симптомы или «средства скорой помощи»), а также на угнетение воспаления и контроль заболевания (препараты базисной терапии). К средствам базисной терапии относят ЛС с противовоспалительным и/или профилактическим эффектом (ГК, кромоны, антилейкотриеновые, анти IgE и антицитокиновые препараты) и длительнодействующие бронходилататоры (длительнодействующие р2адреномиметики, препараты теофиллина с медленным высвобождением) [4, 8]. История применения ГК при БА насчитывает более 100 лет. Вероятно, что польза от перорально назначенного экстракта надпочечника, описанная Solis Cohen в 1900, была действительно вследствие содержания стероидов, чем присутствия адреналина, т.к. адреналин в значительной степени инактивируется моноаминоксидазой кишечника и печени при абсорбции из желудочно-кишечного тракта. Нобелевская премия по медицине и физиологии была присуждена в 1950 Kendall и Reichstein, которые независимо выделили и синтезировали кортизол и затем адренокортикотропный гормон (АКТГ) и Philip Hench, ревматологу из клиники Майо, который продемонстрировал их существенную эффективность при внутривенном введении пациентам с ревматоидным артритом. Только спустя 6 месяцев после демонстрации Hench клинической эффективности АКТГ у пациентов с ревматоидным артритом, Boardley et al. (1949) из Университера Джона Хопкинса показали, что имеется подобный положительный эффект у пациентов с астмой [35, 41]. Они описали пять пациентов с астмой, интересно, что все из них имели мокроту с эозинофилами, которые быстро улучшили состояние после внутримышечного введения АКТГ с более чем 3-х недельным периодом исчезновения мокроты. Позже это наблюдение было подтверждено на большей группе пациентов. Впоследствии, оральный кортизон, широко используемый в то время для лечения тяжелых воспалительных заболеваний, был показан эффективной заменой инъекциям у пациентов с тяжело контролируемой астмой. Сомнения в эффективности данной терапии привели в 1956 году в Великобритании к мультицентровому исследованию Medical Research Council кортизона у пациентов с астмой, которое было первым плацебо-контролируемым исследованием, выполненным при астме [35,95]. Результаты оказались неожиданно разочаровывающими: отмечались незначительные клинические улучшения, которые не были стойкими 2 месяцев терапии. Такие данные могли быть следствием низких доз назначенного кортизона, отсутствия объективных измерений функции легких и включения многих пациентов с хронической обструктивной болезнью легких. Однако, несмотря такие негативные результаты, оральные стероиды стали все чаще использоваться у пациентов с тяжелой астмой, и теперь побочные эффекты, проявляющиеся в замедлении роста у детей, остеопорозе и метаболических нарушениях, стали главной проблемой [35].
Возможностью снижения системных побочных эффектов могла стать доставка ПС ингаляционным путем, однако кортизон и дексаметазон, вводимые ингаляционно, не демонстрировали преимущества из-за отсутствия у них местной эффективности, что привело к поиску топически активных стероидов. McKenzie и Stoughton (1962) открыли, что местная эффективность ПС находится в прямой связи с вазоконстрикцией сосудов кожи, хотя клеточная основа этого теста до сих пор неясна [35, 94]. Гидрокортизон оказался слабым в тесте McKenzie, но два синтетических стероида, беклометазона дипропионат и бетаметазон-17-валерат имели хороший ответ сосудов кожи. Эти стероиды были эффективны для местного лечения экземы, и предполагалось, что они будут эффективны и при ингаляционном приеме. Дальнейшее изучение проблемы проводилось в направлении разработки ингаляционных форм стероидов и позволило Harry Morrow Brown с соавт. в 1972 установить, что беклометазон дипропионат в ингаляционной форме эффективно снижает необходимость в оральных КС и способствует лучшему контролю заболевания у многих пациентов [35, 46].
Неконтролируемая бронхиальная астма
За годы, прошедшие между двумя пересмотрами GINA, изменился подход к фармакотерапии БА. В новой редакции GINA центральное место для выбора объема терапии отводится не классификации тяжести течения заболевания, а критериям контроля над астмой [1].
В издании 2006 года точно обозначены критерии для определения уровня контроля БА: частота симптомов в дневные и ночные часы, частота обострений и обращений за медицинской помощью, потребность в ингаляционных бронхолитиках, нежелательные лекарственные реакции, ограничение физической нагрузки, объем ПСВ. На основе проявлений Б А выделяют три уровня контроля: контролируемая астма, частично контролируемая астма, неконтролируемая астма. Таким образом, при сохранении общепринятого ступенчатого подхода к медикаментозному лечению БА, акцент фармакотерапии сместился с оценки тяжести течения заболевания, на оценку ответа на проводимую терапию [4].
Однако нельзя не отметить, что в настоящее время отсутствуют данные о достаточно аргументированных сроках длительного медикаментозного лечения БА. Используемая многоступенчатая система лечения больных основывается на клинических и недостаточно точных одномоментных замерах показателей форсированного выдоха больных. Широкое внедрение в повседневное лечение детей с БА кортикостероидов (ингаляционных, а при необходимости и оральных) требует выработки более точных критериев их использования в связи с возможными побочными действиями этих препаратов. Возникает насущная потребность в создании системы контроля эффективности проводимой терапии [11,14].
Несмотря на патогенетически обоснованную и доказанную эффективность терапии ИГКС, у некоторых детей даже на фоне терапии высокими дозами ИГКС не удается достигнуть полного контроля заболевания. Это может быть связано с плохой доставкой препаратов в дыхательные пути, недостаточной дозой, гетерогенностью индивидуального ответа на противоастматическое лечение, а также недостаточным комплаенсом, т.е. невыполнением родителями рекомендаций врача [13].
Важно распознать этих пациентов на ранних сроках, т.к. отсутствие ответа на терапию часто приводит к ингаляционной терапии высокими дозами ГК на длительный период и побочным эффектам при продолжающемся патологическом процессе в дыхательных путях [111].
Тяжелая форма БА не является однородным понятием; под этим термином объединен целый ряд синдромов, отражающих степень тяжести болезни. Русские аналоги терминов применяющихся в англоязычной литературе, могут быть переведены следующим образом: острая тяжелая астма, астматическое состояние, нестабильная астма, фатальная астма, тяжелая хроническая астма, внезапно возникшая тялселая астматическая атака, медленно развивающаяся астматическая атака [23].
По заключению рабочей группы Европейского респираторного общества (ERS) к тяжелой/терапевтически резистентной астме относится - состояние, которое недостаточно контролируется (наличие хронических симптомов, эпизодические обострения, персистирующая и варьирующая обструкция воздухоносных путей, постоянная потребность в (32-агонистах короткого действия), несмотря на применение адекватных доз кортикостероидов. Адекватными дозами ИКС применительно к слолшой астме являются: 800 мкг беклометазона дипропионата или 400 флютиказона пропионата [17, 64]. Особого интереса заслуживают эндогенные факторы неконтролируемости БА. К доказанным в настоящее время эндогенным механизмам отсутствия контроля над симптомами болезни относят наличие сниженной чувствительности к КС (как промежуточный этап вторичной КС-резистентности) и собственно КС-резистентность I и П степени, генетически детерминированные индивидуально высокие темпы развития воспаления, неуправляемую бронхиальную гиперреактивность. В настоящее время КС-резистентность делится на два типа: первичная резистентность (тип П), обусловленная генетическим дефектом (мутации, приводящие к нарушению функции гормон-связывающего домена кортикостероидного рецептора) и вторичная (тип I), приобретенная в процессе лечения и в большинстве случаев обратимая [16,17, 20]. Причиной КР I типа является дефект связывания кортикостероидного рецептора в Т клетках, который может быть следствием длительной иммунологической стимуляции, опосредованной цитокинами [18, 90]. Полная КС резистентная астма встречается редко, менее чем в 1:1000 случаев БА. Более распространены случаи снижения ответа на ГК, описываемые как «гормонозависимая астма», требующая высоких доз ингаляционных или системных ГК, для контроля заболевания [34]. Необходимость постоянного приема ингалируемых кортикостероидов для поддержания стабильного состояния позволяет характеризовать подобное течение бронхиальной астмы как "астму, зависимую от ингаляционных кортикостероидов" [12, 76]. Существует мнение, что к гормонозависимым относятся случаи заболевания, при которых необходим постоянный прием кортикостероидных препаратов внутрь в течение 1 года и более [24]. Представленная гетерогенность ответа на терапию ГК имеет в своей основе различные механизмы. Большинство пациентов имеют нормальный уровень кортизола плазмы и не имеют надпочечниковой недостаточности, считается, что метаболическая и эндокринная функции эндогенных ГК не нарушена [40? 66]. Клеточные изменения при ГК резистентной астме Ввиду отсутствия признаков грубых биохимических нарушений у этих пациентов, последующие исследования сфокусировались на роли мононуклеаров периферической крови при ГК резистентной (ГКР) астме. Многие исследования показали, что ГКР астма ассоциирована с повреждением реактивности моноцитов и Т-лимфоцитов на супрессию ГК in vitro и in vivo [79]. Предполагается, что резистентность возникает в результате избыточной продукции «воспалительных цитокинов» (TL-2, IL-4), и недостаточного подавления повышенной экспрессии при терапии ГК [54, 55, 89]. Комбинация EL-2 и IL-4 индуцирует стероидную резистентность in vitro посредством р38 МАІЖ (митоген-активируемая протеинкиназа), вызывающей фосфорилирование GR, что в свою очередь снижает связывающую активность рецептора и стероид-индуцированную ядерную транслокацию [34].
Клинико-инструментальные методы исследования
Этот полиморфизм обусловлен заменой гуанина на цитозин в 647 положении во втором интроне этого гена. В результате этой замены (TGATCA на ТСАТСА) формируется сайт рестрикции для эндонуклеазы Ksp 221 [68]. В большинстве работ полиморфизм определяется на сенс-цепи, в этом случае С меняется на G [125]. Для ПНР анализируемого участка гена GR были выбраны следующие праймеры [68]: F 5 AAATTgAAgCTTAACAATTTTggC 3 R 5 gCAgTgAACAgTgTACCAgACC З 40 циклов амплификации проводились в конечном объеме 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг геномной ДНК, 250 пкмоль каждого праймера, ЮмМ Tris-HCI рН 8.4, 0.5mM,MgCI2, 50 mM KCI, 0,2 тМ каждого dNTP и одну единицу Taq полимеразы. ГЩР включала 30 секунд -денатурация при 94 С,30 секунд - отжиг при 59 С и 45 секунд - синтез при 72 С. Длина фрагмента, нарабатываемого в результате ГЩР -206 п.н.
Для генотипирования, продукты ГЩР рестрицировались Ksp 221 («Сибэнзим», Россия, Е081, Е082), после чего анализировались в 2.5% агарозном геле. Имеют место аллель С, имеющий Ksp 221 рестрикционный сайт, и аллель G, не несущий сайта для Ksp 221. При комбинации этих аллелей формируются три генотипа: GG (206 п.н.); CG (206 п.н, 116 п.н., 90 п.н.); СС (116 п.н., 90 п.н.). (рис.2.1)
Этот полиморфизм обусловлен заменой цитозина на тимин в 3807 положении апстрим от точки старта мРНК в промоторном участке гена, кодирующего глюкокортикоидныи рецептор. В результате этой замены (С/Т) исчезает сайт рестрикции для эндонуклеазы Psyl (Tthllll) («Fermentas», Литва). Для ЇТЦР анализируемого участка гена GR были выбраны следующие праймеры [127]: GRthllll-F -5 CCAGGAGTGGGACATAAAGCT-3 GRthl 11I-R 5 - CTTAGAAGCAGAGGTGGAAATGAAG -З 40 циклов амплификации проводились в конечном объеме 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг геномной ДНК, 5 пкмоль каждого праймера, ЮмМ Tris-HCI рН 8.4, 0.5mM,MgCI2( 50 тМ KCI, 0,2 тМ каждого dNTP и одну единицу Taq полимеразы. ПЦР включала 30 секунд -денатурация при 95 С,30 секунд - отжиг при 55 С и 30 секунд - синтез при 72 С. Длина фрагмента, нарабатываемого в результате ПЦР -96 п.н. Для генотипирования, продукты ПЦР рестрицировались Psyl (Tthllll) («Fermentas», Литва), после чего анализировались в 10% полиакриламидном геле (ПААГ). Имеют место аллель С, имеющий Psyl (Tthl111) рестрикционный сайт и аллель Т, не несущий сайт для Psyl (Tthllll), таким образом формируются три генотипа: ТТ (96 п.н.); СТ (96 п.н, 55 п.н., 41 п.н.); СС (55 п.н., 41 п.н.). (рис.2.2) Данные исследование проводилось в группе пациентов из 24 детей с тяжелым, непрерывно-рецидивирующим, неконтролируемым течением бронхиальной астмы. 1. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) Для проведения ПЦР была подобрана пара праймеров, фланкирующих 2 экзон гена NR3C1 и дающих амплификат размером 1496 п.о.: Forward: 5 - СТА АТС GGA ТСА GGA AGA-3 Reverse: 5 - CCA ATG GGA TAC TGA AAA-3 62 Эти же последовательности праимеров использовали для секвенирования амплификатов. Амплификация проводилась в конечном объеме 50 мкл реакционной смеси, содержащей кДНК - 10 мкл, 10х реакционный буфер - 5 мкл, смесь dNTP (ЮмМ) - 5 мкл, Mg2+ (25мМ) - 5 мкл, праймеры (15 пМ/місл) - по 1 мкл, Taq ДНК-полимераза (10 ед/мкл) - 0,25 мкл, Н20 (до 50 мкл) - 22,75 мкл. Проводилось 35 циклов ПЦР. ГЩР включала 30 секунд -денатурация при 94 С,30 секунд - отжиг при 52 С и 60 секунд - синтез при 72 С. Амплификацию проводили на приборе «Терцик» (ДНК-Технология). 2. Электрофоретическое разделение амплификатов и выделение фрагментов из агарозного геля Для очистки амплификатов от компонентов ГЩР-реакционной смеси перед секвенированием проводили разделение амплификатов в 1% агарозном геле с последующим вырезанием фрагментов требуемого размера, эллюцией и солевым осаждением ДНК (1/10 объема 5М NaCI, 2,5V этанол). После осаждения фрагменты ДНК высушивали и растворяли в 12 мкл Н20 и использовали для постановки реакции секвенирования. 3. Секвенирование фрагментов ДНК Секвенирование проводилось с использованием реагентов «BigDye Terminator Kit v.2.0» (Applied Biosystems). Для этого брали исследуемый образец ДНК (ПЦР-фрагменты ДНК) в количестве 60 нг, один из секвенирующих (см. выше) праимеров в количестве 6 пМ и 8 мкл реакционной смеси «BigDye», доводили объем раствора до 20 мкл и проводили реакцию секвенирования по следующей схеме: 25 циклов: 96С - 30 сек 50С-15сек; далее 60С - 4 мин Секвенирование проводили в 4,25% полиакриламидном геле на автоматическом секвенаторе ABI Prism 377 (Applied Biosystems).
Особенности течения бронхиальной астмы при различных генотипах Bell полиморфизма гена GR
В группе девочек с тяжелой БА у носителей СС генотипа чаще встречаются отрицательные КСП, по сравнению с носителями других генотипов CG+GG (53.8% против 6.3%, р=0.01).
У девочек больных БА средней тяжести, имеющих генотип СС, отрицательная ИПП с гистамином встречалась чаще, чем у носителей генотипов CG+GG (50% против 0%, р=0.029).
Сравнение средних значений спирометрических показателей в периоде ремиссии (VC, FVC, FEV1, FEV1/FVC, FEF25-75, PEF, FEF25, FEF50, FEF75, прирост VC, прирост FVC, прирост FEV1, прирост PEF, прирост FEF25, прирост FEF50, прирост FEF75) и показателей циркадного ритма проходимости бронхов (СПб, СЛб, Мет, СГІбф) у детей в периодах ремиссии и обострения БА не выявило различий между аналогичными показателями у детей, имеющих генотип СС Bell полиморфизма гена GR, и у детей с генотипами CG и GG. (табл. П. 4-6). Однако, при обострении в группе детей больных БА средней тяжести высокая СЛб (более 15%) встречается чаще у носителей генотипа СС, чем у носителей генотипов CG+GG (80.8% против 50%, р=0.001).
При сравнении значений спирометрических показателей в периоде обострения БА у детей, имеющих генотип СС Bell полиморфизма гена GR, и у детей с генотипами CG и GG получены следующие результаты. У детей, имеющих генотип СС значения FVC выше, а индекса FEV1/FVC ниже, по сравнению с аналогичными показателями у носителей генотипов CG и GG (98,37±13,34%, 94,33±12,59%, p=0,049; 92,20±11,04%, 95,76±9,47%, p=0,030, соответственно). Прирост VC при пробе с бронходилятатором выше у носителей генотипа СС, по сравнению с данным показателем у детей, имеющих генотипы CG и GG (8,79±8,12%, 4,80±5,43%, р=0,014). У мальчиков носителей генотипа СС значения FVC выше, по сравнению с аналогичным показателем у носителей генотипов CG и GG (98,29±12,45%, 93,16±13,29%, р=0,032). Сравнение других показателей спирометрии (VC, FEV1, FEF25-75, PEF, FEF25, FEF50, FEF75, прирост FVC, прирост FEV1, прирост PEF, прирост FEF25, прирост FEF50, прирост FEF75) не выявило различий между аналогичными показателями у детей, имеющих генотип СС Bell полиморфизма гена GR, и у детей с генотипами CG и GG в периоде обострения БА. Данные представлены в табл.П. 7.
Сравнение значений иммунологических показателей крови у детей вне обострения БА позволило установить следующие различия. Дети с генотипом СС имеют более низкие значения общего IgE по сравнению с уровнем аналогичного показателя у детей с генотипами CG и GG; у девочек с генотипом СС уровень общего IgE также ниже по сравнению с уровненем общего IgE у девочек с генотипами CG и GG (рис. 3.1). У девочек с генотипом СС вне обострения БА чаще встречались нормальные значения IgE (до 100 ед/мл) и реже высокие, по сравнению с девочками, имеющими генотипы CG+GG (63.6% против 6.7%, р=0.003). У детей с генотипом СС отмечается сниженное относительное количество СО20-лимфоцитов (субпопуляция предшественников В-клеток, зрелые В-клетки) по сравнению с уровнем аналогичного показателя у детей с генотипами CG и GG (19±3,94%, 21±4,15%, р=0,044). Среди девочек, носителей генотипа СС АКА ниже, по сравнению с данным показателем у носителей генотипов CG и GG (0±9,94%, 10±8,43%, р=0,019). Мальчики, имеющие генотип СС показали более высокие значения спонтанного НСТ-теста по сравнению с уровнем данного показателя у мальчиков с генотипами CG и GG (9,93±7,69%, 3,32±3,97%, р=0,006), т.е. отмечается более высокая бактерицидная активность нейтрофилов. Сравнение других иммунологических показателей у детей в период ремиссии БА (IgA, IgM, IgG, ЦИК, комплемент, CD3, CD4, CD8, CD4/CD8, фагоцитарное число нейтрофилов, фагоцитарный индекс нейтрофилов, фагоцитарное число моноцитов, фагоцитарный индекс моноцитов, стимулированный НСТ-тест, спонтанная миграция лейкоцитов, ИТМ) не выявило различий между аналогичными показателями у детей, имеющих генотип СС Bell полиморфизма гена GR, и у детей с генотипами CG и GG (табл. П.8). При анализе показателей иммунологического обследования детей в периоде обострения БА выявлено, что АКА ниже у детей, имеющих генотип СС Bell полиморфизма гена GR по сравнению с носителями CG и GG генотипов (8,28±8,07%, 11,29±8,97%, р=0,045). Сравнение других иммунологических показателей у детей в период обострения БА (IgE, IgA, IgM, IgG, ЦИК, комплемент, CD3, CD4, CD8, CD20, CD4/CD8, фагоцитарное число нейтрофилов, фагоцитарный индекс нейтрофилов, фагоцитарное число моноцитов, фагоцитарный индекс моноцитов, спонтанный НСТ-тест, стимулированный НСТ-тест, спонтанная миграция лейкоцитов, ИТМ) не выявило различий между аналогичными показателями у детей, имеющих генотип СС Bell полиморфизма гена GR, и у детей с генотипами CG и GG (табл. П.9). При оценке относительного количества эозинофилов в крови вне обострения заболевания выявлено, что мальчики - носители генотипа СС ВсП полиморфизма гена GR, имеют более высокие значения эозинофилов в крови по сравнению с уровнем аналогичного показателя у мальчиков с генотипами CG и GG (4,00±3,55 %, 3,00±3,74%, р=0,04), что может являться косвенным показателем большей активности аллергического воспаления. Других различий данного показателя у детей, имеющих генотип СС ВсП полиморфизма гена GR, и у детей с генотипами CG и GG в периоды обострения и ремиссии выявлено ен было (табл. П. 10). У детей, носителей генотипа СС сопутствующий аллергический конъюнктивит встречался чаще, чем у имеющих генотипы CG+GG, такие же различия отмечаются в группе девочек (35.1% против 24.4%, р=0.011; 40.0% против 16.7%, р=0.014). В группе детей больных БА средней степени тяжести у носителей генотипа СС малые формы респираторной аллергии как сопутствующая патология встречалась реже по сравнению с другими генотипами CG+GG (79.2% против 89.4% р=0.023). И в группе девочек, носителей генотипа СС, и в группе детей обоего пола, имеющих генотип СС, реже требовалось назначение ИГКС через небулайзер (пульмикорт) при обострении, чем при генотипах CG+GG (21.1% против 61.3%, р=0.008; 28.9% против 43.9%, р=0.038, соответственно).
![Эффективность магнитоинфракрасной лазерной терапии при атопической бронхиальной астме у детей [Электронный ресурс]](/i/i/4450/183374.png "Эффективность магнитоинфракрасной лазерной терапии при атопической бронхиальной астме у детей [Электронный ресурс] Короткова Евгения Ильинична")
