Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Лечение туберкулеза 9
1.2. Гепатотоксические реакции противотуберкулезных препаратов и их коррекция в процессе химиотерапии туберкулеза 13
1.3. Иммунокоррекция при туберкулезе 18
ГЛАВА2. Материал и методы исследования 29
2.1. Общая характеристика материала и объем исследований 29
2.2. Методики, используемые in vitro для изучения влияния глутоксима на рост микобактерий и специфическую активность противотуберкулезных препаратов... 29
2.3. Моделирование туберкулезной инфекции и показатели эффективности ее лечения 31
2.4. Методики исследования функциональной активности перитонеальных макрофагов мышей 34
2.5. Методики изучения морфо-функционального состояния печени 36
2.6. Методики исследования процессов репаративной регенерации легких и печени 38
2.7. Статистическая обработка результатов исследования... 39
ГЛАВА 3. Влияние глутоксима на эффективность этиотропной терапии экспериментального туберкулеза 40
3.1. Действие глутоксима на рост микобактерий туберкулеза и специфическую активность противотуберкулезных препаратов в опытах in vitro 40
3.2. Изучение влияния глутоксима на эффективность этиотропного лечения мышей, зараженных культурой M.bovis-bovinus 42
3.2.1. Определение влияния глутоксима на функциональную активность перитонеальных макрофагов 54
3.3. Исследование влияния глутоксима на эффективность этиотропной терапии мышей, зараженных клиническим полирезистентным изолятом микобактерий туберкулеза 61
3.3.1. Функциональная активность перитонеальных макрофагов 68
3.3.2. Гистологические исследования легких мышей 76
ГЛАВА 4. Влияние глутоксима на гепатотоксические реакции противотуберкулезных препаратов и процессы репаративнои регенерации 84
4.1. Изучение гепатозащитной активности глутоксима 84
4.2. Изучение действия глутоксима на процессы репара-тивной регенерации 92
4.2.1. Влияние глутоксима на развитие компенсаторной гипертрофии легких 92
4.2.2. Влияние глутоксима на скорость регенерации печени.. 95
Заключение 102
Выводы 112
Практические рекомендации 113
Указатель литературы 114
- Гепатотоксические реакции противотуберкулезных препаратов и их коррекция в процессе химиотерапии туберкулеза
- Моделирование туберкулезной инфекции и показатели эффективности ее лечения
- Изучение влияния глутоксима на эффективность этиотропного лечения мышей, зараженных культурой M.bovis-bovinus
- Изучение гепатозащитной активности глутоксима
Введение к работе
Актуальность проблемы. В начале третьего тысячелетия туберкулез продолжает причинять человечеству колоссальный экономический и биологический ущерб (Шевченко Ю.Л., 2000; Покровский В.И., 2001; Левашев Ю.Н., 2003; Davey S., 2001). Сохранение эпидемической напряженности по туберкулезу как в России, так и во всем мире является результатом сочетанного влияния феномена лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза (МБТ) и повсеместного ее распространения угрожающими темпами, а также экологических, социальных и экономических факторов, приведших к росту имму-нодефицитных заболеваний различного генеза (Покровский В.И., 2000; Хру-лева Т.С., 2001; Чуканов В.И., 2001; Онищенко Г.Г., 2003; Вишневский Б.И., 2003; Iseman М, 1998). В результате резко изменились течение туберкулезной инфекции и структура клинических форм, возросла частота диссеминирован-ных процессов, инфильтративных и казеозных пневмоний, участились случаи (до 72,3%) прогрессирующего течения туберкулеза с острым началом и массивным бактериовыделением (Хоменко А.Г., 1999; Ерохин В.В., 2000; Соколова Г.Б. и др., 2000; Иванова Л.А. и др., 2001; Мишин В.Ю., 2001; Ариэль Б.М., 2003).
В современных условиях полирезистентность МБТ и дефекты иммунной системы выделены в качестве неустранимых и наиболее значимых причин терапевтических неудач (Иванова Л.А.,1995). В настоящее время во фтизиатрии для лечения полирезистентных форм туберкулеза легких используют массивную этиотропную терапию, что создает чрезмерную медикаментозную нагрузку и повышает риск развития побочных реакций со стороны различных органов и систем (Иванова Л.А., 1995; Соколова Г.Б., 2000; Павлова М.В., 2000; Елькин А.В., 2000; Чуканов В.И. и др., 2000). В связи с этим очевидна необходимость многопланового, целенаправленного совершенствования комплексной терапии туберкулеза, включая и патогенетические средства, способствующие оптимизации функционирования систем защиты организма больного.
В настоящее время создан и введен в медицинскую практику ряд лекарственных средств метаболического действия, среди которых для фтизиатрии большой интерес представляет отечественный препарат глутоксим - производное тиопоэтинов. Являясь структурным аналогом окисленного глутатиона, глутоксим обладает высокой биодоступностью, модулирующим воздействием на внутриклеточные процессы тиолового обмена, способствует инициации системы цитокинов, активации фагоцитоза (Кожемякин Л.А., Балазовский М.Б., 1996,1997; Кожемякин Л.А. и др., 1999; Антушевич А.Е. и др., 2002).
Глутоксим показал высокую эффективность как средство профилактики и лечения вторичных иммунодефицитных состояний, ассоциированных с радиационными, химическими и инфекционными факторами, острых и хронических вирусных гепатитов В и С, а также послеоперационных осложнений (Тиглиев Г.С. и др., 1999; Жданов К.В., 2000; Орлов СВ., 2000; Лисянская АС и др., 2001; Суворова К.Н. и др., 2002).
Настоящее исследование посвящено изучению основных сторон фармакологической активности глутоксима как средства оптимизации комплексной терапии туберкулеза.
На основании экспериментально-клинических исследований, проведенных
в Санкт-Петербургском НИИ фтизиопульмонологии, НИИ фтизиопульмоно-
логии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, Центральном
НИИ туберкулеза РАМН решением Фармакологического комитета Минздра
ва России от 28.11.02 препарат глутоксим разрешен к применению при тубер
кулезе легких. ^-^
Цель работы. На основе экспериментальных исследований определить возможность использования производного тиопоэтинов глутоксима в качестве средства сопровождения химиотерапии туберкулеза.
Задачи исследования
1. В условиях in vitro изучить действие глутоксима на рост МБТ и специфическую активность противотуберкулезных препаратов.
Изучить влияние глутоксима на эффективность этиотропного лечения мышей, зараженных чувствительной культурой М. bovis-bovinus 8.
Исследовать влияние глутоксима на эффективность этиотропной терапии мышей, зараженных клиническим полирезистентным изолятом МБТ.
Изучить гепатозащитную активность глутоксима при поражении печени противотуберкулезными препаратами.
Изучить действие глутоксима на процессы репаративной регенерации в легких и печени.
Научная новизна. В результате проведенного исследования впервые в эксперименте обоснована возможность применения нового препарата глутоксима в качестве средства сопровождения этиотропной терапии туберкулеза, вызванного микобактериями с различными биологическими свойствами. Установлены механизмы реализации лечебного действия глутоксима при экспериментальном туберкулезе. Дана комплексная характеристика свойств глутоксима, обеспечивающих коррекцию гепатотоксических проявлений химиотерапии туберкулеза. Раскрыты ранее неизвестные свойства глутоксима -стимулировать регенеративные процессы в тканях легких и печени.
Практическая значимость работы. Выявленные в экспериментальных исследованиях особенности фармакодинамики глутоксима позволят более обоснованно наметить показания к его использованию для лечения больных туберкулезом, что повысит эффективность терапии, снизит риск токсигенности этиотропных средств.
Разработана и внедрена в лабораторную практику Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии оригинальная методика оценки эффективности новых лекарственных средств, схем, а также вирулентности МБТ, выделенных от больных туберкулезом легких, на основе морфометрического измерения объема пораженной легочной ткани.
Основные положения, выносимые на защиту:
Включение глутоксима в комплексное лечение экспериментального туберкулеза, вызванного микобактериями с различной биологической характеристикой, существенно повышает эффективность этиотропной терапии. Под влиянием глутоксима регистрируются повышение спонтанной и индуцированной продукции супероксидных радикалов макрофагами, стимуляция их поглотительной и переваривающей способности, обеспечивающих завершенность фагоцитоза микобактерий.
Значимый вклад в повышение результатов лечения туберкулеза вносит способность глутоксима корригировать структурно-метаболические нарушения печени, возникающие под влиянием противотуберкулезных препаратов, за счет нормализации активности аминотрансфераз и перекисного окисления липидов, снижения концентрации билирубина, активации микросомального окисления, улучшения гемодинамики, восстановления гистоархитектоники органа.
Глутоксим, оказывая стимулирующее влияние на процессы репарации, способствует восстановлению в более сжатые сроки массы и архитектоники регенерирующей ткани легких и печени, улучшению условий регенерации.
Реализация результатов работы. На предложенный способ лечения туберкулеза легких с использованием глутоксима получен патент № 2197984 RU Способ лечения различных форм туберкулеза, в том числе резистентных к противотуберкулезной химиотерапии / Л.А. Кожемякин, М.И. Перельман, Г.Б. Соколова, Л.А. Иванова, С.Н. Васильева, Н.В. Сапожникова, Ю.В. Корнеев.
Результаты исследования внедрены в практику научно-исследовательской и лечебной работы Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии, а также в учебный процесс на кафедре фтизиатрии Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования и на кафедре терапии с курсом клинической фармакологии Санкт-Петербургской Государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова.
Апробация материалов диссертации. Основные положения работы доложены и обсуждены на Региональной научно-практической конференции (Санкт-Петербург, 1999); II Международной Ассамблее «Новые медицинские технологии» (Москва, 2000); на 11,12 и 13 Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва 2001, 2002; Санкт-Петербург, 2003); на VII Российском съезде фтизиатров (Москва, 2003).
По результатам исследования опубликовано 10 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, трех глав с изложением использованных методов и результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 340 источников, в том числе 247 отечественных и 93 иностранных. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 11 рисунками.
Гепатотоксические реакции противотуберкулезных препаратов и их коррекция в процессе химиотерапии туберкулеза
В структуре осложнений химиотерапии туберкулеза значительное место (до 65%) отводится поражениям печени - органа, который играет главную роль в метаболизме ксенобиотиков (Елизаров Б.М., Владимирова М.И., 1990; Адамович Н.В. и др., 1992; Лопатин А.С., 1992; Гурылева М.Э., 1994; Мяки-шева Т.В. и др., 2000; Новикова Т.И. и др., 2001; Панова Л.В., 2001; Эвия Л., 2002; Гельберг И.С. и др., 2002).
В литературе указывается, что гепатотоксические реакции на противотуберкулезные препараты развиваются, в основном, в первые два месяца лечения в виде незначительных, а в 1,7-30% случаев - неустранимых нарушений функции печени, требующих отмены препаратов - «виновников» (Лобина З.С. и др., 1990; Ерохин В.В. и др., 1991; Гурылева М.Э., 1994; Тельных Ю.В., 1999; Мишин В.Ю. и др., 2000; Чуканов В.И., 2001; Колпакова Т.А., 2002; Егоров Е.А., 2003; Хрулева Т.С. и др., 2003). Общепризнано, что залогом эффективного лечения туберкулеза является полноценная и адекватная этиотропная терапия, именно на первом этапе, в период формирования темпов инволюции туберкулезного процесса. Таким образом, существует тесная взаимосвязь между результативностью химиотерапии и состоянием печени.
Комбинированное применение во фтизиатрии противотуберкулезных средств обусловливает сложность идентификации повреждающего агента. Тем не менее, в литературе существует статистика, отражающая частоту возникновения функциональных расстройств под воздействием отдельных этио-тропных препаратов и ее взаимосвязь с метаболизмом препаратов в печени. Так, для изониазида эти цифры варьируют от 0,5 до 75%, пиразинамида - от 10 до 61,1%, рифампицина - 0,4-43,5%, этионамида и протионамида - 5-43,1%, этамбутола - 3,8-16,7% (Елизаров Б.М., Владимирова М.И., 1990; Адамович Н.В. и др., 1992; Гурылева М.Э., 1994; Охтяркина В.В. и др., 2000; Васильева И.А. и др., 2001; Панова Л.В., Овсянкина Е.С., 2003). Значительный удельный вес прогрессирующих форм туберкулеза с полирезистентностью возбудителя вынуждает использовать в современной терапии комплекс этио-тропных средств (4 -7 препаратов) с обязательным назначением препаратов резерва. Закономерно, что в этих условиях повышается риск и выраженность гепатотоксических реакций (Скакун Н.П., Табачук О.Е., 1991; Ерохин В.В. и др., 1991; Соколова Г.Б., 2000; Мишин В.Ю., Степанян И.Э., 2000; Новикова Т.Н. и др., 2001; Никонов С.Д. и др., 2002; Гельберг И.С. и др., 2002; Колпако-ва Т.А., 2002; Чернов А.О., 2003).
Несмотря на актуальность проблемы поражений печени противотуберкулезными препаратами, патогенез их глубоко не изучен. В многочисленных публикациях, посвященных этому вопросу, главным образом, констатируется частота развития побочных явлений, биохимические и гистологические свидетели токсичности противотуберкулезных препаратов, а порой лишь описываются отдельные случаи из клинической практики.
Анализ литературы свидетельствует о том, что гепатотоксины независимо от химической природы усиливают в печени свободнорадикальные процессы и обусловленное ими перекисное окисление липидов (ПОЛ) клеточных мембран (Логинов А.С., Матюшин Б.Н., 1996; Зайцев В.Г. и др., 2003; Кинзирская Ю.А. и др., 2003; DeLeve L.D., Kaplonitz N., 1995; Lee W.M., 1995; Sturgill M.G., Lambert G.H., 1997). Токсическое действие ксенобиотиков реализуется на уровне фосфолипидной матрицы и липопротеидных ферментных комплексов, интегрированных в гидрофобную зону внутриклеточных мембран гепа-тоцитов (Губский Ю.И., 1986).
Под действием гепатотоксинов нарушаются системы конъюгации и анти-оксидантной защиты, создаются условия для накопления активных форм кислорода (АФК) и высокореактивных реакционных метаболитов (Бобырев В.Н., 1997). АФК инициируют ПОЛ, что приводит к химической модификации компонентов мембран, нарушению их жидкостно-мозаичной структуры и резкому повышению их гидрофильности, набуханию органелл, последующему выходу в цитоплазму, а затем и в кровь ряда ферментов, АФК и продуктов липопероксидации (Губский Ю.И., 1987; Логинов А.С., Матюшин Б.Н., 1996; АруинЛ.И., 1998).
Набухание митохондрий в сочетании с угнетением ферментных систем транспорта электронов в мембранах эндоплазматического ретикулума приводит к нарушениям энергетического обмена: разобщению дыхания и окислительного фосфорилирования и активации гепатоцеллюлярного апоптоза (Ару-ин Л.И., 1998). Повышение проницаемости мембран эндоплазматического ретикулума приводит к увеличению внутриклеточного содержания Са + и активации фосфолипазы Аг, вызывающей гидролитическое расщепление фосфо-липидов и нарушение синтеза простагландинов (Губский Ю.И., 1986).
Лабилизация мембран лизосом ускоряет процессы «переваривания» внутриклеточных структур, завершая цитолиз - ведущий патоморфологический синдром токсического поражения печени любой этиологии (Саратиков А.С., Венгеровский А.И., 1995). Окислительная инактивация метаболитами ПОЛ мембраносвязанных ферментных комплексов, прежде всего, цитохрома Р-450 (основного компонента микросомальной монооксигеназной системы печени) усугубляет токсикоз (Саратиков А.С., Венгеровский А.И., 1999). В патогенезе токсических повреждений печени имеют значение нарушение физиологической регенерации, индукция синтеза соединительной ткани и формирование фиброза. В печени токсичные субстанции, достигая плазмо-леммы звездчатых ретикулоцитов и нейтрофилов, активируют флавинзависи-мую НАДФН-оксидазу, способную генерировать (V и перекись водорода, а также индуцируют высвобождение цитокинов (Маянский А.Н., Маянский ДН., 1989).
Таким образом, при воздействии гепатотоксинов развивается сложный симптомокомплекс, в основе которого лежит усиление ПОЛ, частичная или полная деструкция мембран, снижение каталитической активности мембра-носвязанных белков и ферментов, грубые расстройства антитоксической функции печени, приводящие к токсемии, потенцирующей повреждающее действие гепатотропных агентов (Голиков С.Н. и др., 1986).
Анализ литературных данных позволяет констатировать, что общебиологические механизмы реализации токсического действия ксенобиотиков на печень характерны и для противотуберкулезных препаратов.
Более детально изучено гепатотоксическое действие изониазида и рифам-пицина. Показано, что эти препараты нарушают функцию микросомальных монооксигеназ эндоплазматического ретикулума печени, причем комбинированное их использование усугубляет эти нарушения (Gangadharam P.R.J., 1986; Aoyagi Т., 1987). В экспериментальных и клинических исследованиях установлен энерготоксический эффект под влиянием большинства противотуберкулезных препаратов - изониазида, рифампицина, пиразинамида, стрептомицина, ПАСК, этионамида (Процюк Р.Г., Радловская З.Т., 1990; Ангелов Е. и др., 1990; Абдуллаев Р.Ю. оглы, 1993; Гурылева М.Э., 1994).
Моделирование туберкулезной инфекции и показатели эффективности ее лечения
Глутоксим представляет собой химически синтезированное соединение -гексопептид со стабилизированной дисульфидной связью бис (гамма-L-глутамил) -L- цистеинил -бис- глицин динатриевая соль с суммарной формулой C20H32O16N6. По химической структуре глутоксим является аналогом окисленного глутатиона. Препарат создан специалистами ЗАО «ВАМ - исследовательские лаборатории» (Санкт-Петербург).
Всего выполнено 12 серий опытов in vitro, эксперименты проведены на 793 животных, характеристика которых представлена в таблице 1.
В качестве тест-штаммов использовали лабораторные культуры МБТ, чувствительные к противотуберкулезным препаратам: М. tuberculosis H37RV, М. bovis- bovinus 8, М. tuberculosis «Academia».
Микобактериальную суспензию для экспериментов in vitro готовили следующим образом. Выросшую на картофельно-глицериновой среде Павловского трехнедельную культуру МБТ, снимали платиновым шпателем, высушивали стерильной фильтровальной бумагой и взвешивали, исходя из расчета, что в 1 мг полувлажной бактериальной массы содержится 100 млн. микробных клеток. Культуру МБТ тщательно растирали в ступке и суспензировали фи-зиологическим раствором по 5 стандарту оптической плотности (1x10 микробных тел в 1 мл суспензии).
Влияние глутоксима на рост микобактерий определяли стандартным методом двукратных серийных разведений в жидкой синтетической среде Сотона с 10% нормальной лошадиной сыворотки. Диапазон исследуемых концентраций
глутоксима составлял от 100 до 0,195мкг/мл. Контролем служили пробирки, содержащие среду без препарата. Далее во все пробирки засевали по 0,2 мл микобактериальной взвеси, используя оригинальную методику поверхностного наслоения, разработанную в лаборатории микробиологии туберкулеза СПбНИИФ. Опыты повторяли дважды. Результаты оценивали после 10-12 суток экспозиции пробирок в термостате при +37С по наличию или отсутствию микобактериальной пленки на поверхности среды.
Для изучения влияния глутоксима на специфическую активность противотуберкулезных препаратов использовали метод дозированного посева суспензии штамма М. tuberculosis H37RV на плотные питательные среды после предварительной экспозиции в жидкой среде Сотона с 10% сыворотки, содержащей исследуемые вещества. По этой методике противотуберкулезные препараты в сочетании с глутоксимом и без него разводили средой Сотона до требуемых концентраций и помещали в центрифужные пробирки, куда добавляли микобактериальную суспензию плотностью 10б микробных клеток /мл. Общий объем среды инкубации составлял 2,0 мл. Экспозиция в термостате при +37С в течении 1 суток. Во время инкубации в термостате штативы с пробирками трижды в день тщательно встряхивали для лучшего контакта МБТ с препаратами. После экспозиции в термостате пробирки центрифугировали (15 минут при 1500 оборотов), осадок отмывали от препаратов, затем ре-суспензировали в солевом растворе среды Школьниковой и производили необходимое количество 10-кратных серийных разведений до конечной плотности ЮМ О2 клеток/мл с последующим посевом по 0,2 мл на 4 пробирки среды Левенштейна-Йенсена. Через 1-2 месяца инкубации в термостате производили подсчет выросших колоний МБТ в опыте и контроле по следующей схеме: до 50 колоний - подсчитывали полностью; более 50 колоний (колонии занимают 1/2 поверхности питательной среды) - условно принимали за 100; несосчиты-ваемое количество колоний - за 200; сливной рост - 300.
В качестве экспериментальных животных использовали белых беспородных половозрелых мышей-самцов массой 18-22 г. Заражение животных проводили двухнедельными культурами М. bovis -bovinus 8 (лабораторный штамм, чувствительный к традиционным противотуберкулезным препаратам), а также клиническим изолятом №5419 СПбНИИФ, выделенным от больного с впервые выявленным туберкулезом, с устойчивостью к изониазиду (10 мкг/мл), рифампицину (40 мкг/мл) и стрептомицину (50 мкг/мл).
В качестве экспериментальной модели использовали модель генерализованного туберкулеза, воспроизводимого введением в боковую хвостовую вену мыши микобактериальной суспензии. Инфицирующая доза составляла 0,1 мг культуры МБТ в 0,2 мл физиологического раствора.
Лечение животных начинали после развития туберкулезного процесса, который тестировали по общему состоянию мышей (снижение активности и потребления кормов, затрудненное дыхание, уменьшение массы тела), а также на основании визуального обнаружения в легких эвтаназированных зараженных особей многочисленных субмилиарных или милиарных очагов поражения.
Глутоксим применяли в средних терапевтических дозах в пересчете на поверхность тела животных при монотерапии в дозах 10 мг/кг и 20 мг/кг (подкожно) или на фоне этиотропных средств в дозах 10,20 и 40 мг/кг (подкожно). Для лечения мышей, зараженных М. bovis-bovinus 8, использовался комплекс противотуберкулезных препаратов: 1) изониазид (10 мг/кг, подкожно) + рифампицин (10 мг/кг, внутрь); 2) изониазид (10 мг/кг, подкожно) + рифампи-цин (10 мг/кг, внутрь) + пиразинамид (20 мг/кг, внутрь). Лечение мышей, зараженных устойчивым штаммом, осуществлялось по двум схемам: 1) рифабу-тин (7,5 мг/кг, внутрь) + циклосерин (8 мг/кг, внутрь) + протионамид (20 мг/кг, внутрь) + этамбутол (20 мг/кг, внутрь); 2) изониазид (25 мг/кг, подкожно) + амикацин (30 мг/кг, подкожно) + офлоксацин (20 мг/кг, внутрь) + этамбутол (50 мг/кг, внутрь). Средняя продолжительность курса комплексного лечения составляла 8 недель. В каждой серии опытов присутствовали группы интактных (незараженных, нелеченных) и зараженных нелеченных животных (контроль заражения). Животных выводили из опыта в два этапа - через 4 и 8 недель комплексной терапии путем декапитации. Эффективность лечения оценивали с учетом следующих показателей: 1) продолжительность жизни животных; 2) динамика массы тела (разница в массе тела в начале и конце опыта); 3) коэффициентов массы легких, селезенки, печени; 4) макроскопической оценки степени пораженности легких; 5) высеваемости МВТ из гомогенатов селезенки; 6) гистологической оценки пораженности легких. При развитии туберкулезного процесса масса паренхиматозных органов увеличивается, в то время как масса тела животных уменьшается, поэтому коэффициенты масс органов служат критерием их пораженности (Давыдова В.М., 1963). Этот показатель рассчитывали по формуле и выражали в условных единицах.
Изучение влияния глутоксима на эффективность этиотропного лечения мышей, зараженных культурой M.bovis-bovinus
Наметив использовать глутоксим в качестве средства комплексной терапии туберкулеза, представлялось необходимым определить его влияние на рост микобактерий туберкулеза. Результаты исследований, полученных в опытах in vitro в отношении трех лабораторных культур M.tuberculosis H37RV и «Academia», М. bovis-bovinus 8, представлены в таблице 2.
Глутоксим не обладает ингибирующей активностью на микобактериаль-ную суспензию высокой плотности (10б клеток/мл). Рост микобактериальной пленки наблюдается во всех пробирках, содержащих глутоксим в концентрациях от 100 мкг/мл до 0,195 мкг/мл. При всех испытанных концентрациях глутоксима не обнаружено отличий в скорости появления и интенсивности роста микобактериальной пленки по сравнению с контролем. Повторные опыты дали идентичные результаты.
В следующих сериях опытов было изучено влияние глутоксима на специфическую активность противотуберкулезных препаратов (изониазид, рифам-пицин, стрептомицин, этамбутол). В качестве тест-культуры использовали суспензию М. tuberculosis H37RV, плотностью 100-1000 клеток/0,2мл. Последовательно исследовали глутоксим в сочетании с одним, двумя и тремя противотуберкулезными препаратами. Последние использовали в заведомо активных дозах (10 мкг/мл), глутоксим -100 мкг/мл. Результаты экспериментов отражены в таблицах 3 и 4.
Как следует из представленных в таблицах 3 и 4 данных, ни в одном случае не было получено потенцирующего или антагонистического влияния глутоксима на специфическую активность классических противотуберкулезных препаратов.
При этом, как при односуточном воздействии изолированными этиотроп-ными средствами, так и в сочетании с глутоксимом, наблюдался рост единичных колоний МБТ. Проведенные эксперименты показали, что подавление роста МБТ происходило только за счет бактерицидного действия использованных противотуберкулезных препаратов.
Таким образом, в опытах in vitro глутоксим не обладает непосредственным ингибирирующим эффектом на рост МБТ, а также не оказывает влияния на специфическую активность известных противотуберкулезных препаратов (изониазида, этамбутола, стрептомицина).
Влияние глутоксима на течение экспериментального туберкулеза в условиях монотерапии или на фоне этиотропных средств оценивалось на 355 мышах в трех сериях опытов. В первой серии опытов было изучено влияние глутоксима в условиях монотерапии на течение генерализованной туберкулезной инфекции. Препарат применяли в дозах 10 и 20 мг/кг, подкожно на третий день после инокуляции инфекта. Наблюдение за животными длилось до 50-го дня после заражения. Результаты этого эксперимента показали, что глутоксим в выбранных дозах не оказывал существенного влияния на характер течения туберкулезного так и опытных при макроскопическом исследовании обнаруживалось распространенное туберкулезное поражение. У животных, выведенных из опыта по завершению срока наблюдения, также имели место обширные специфические изменения в легочной ткани, индексы поражения легких достигали 3,97±0,04 - 4,08+0,11 усл. ед., в посевах гомогенатов ткани селезенки регистрировался массивный рост микобактерий (до 300,0 КОЕ). В следующей серии опытов исследовалась эффективность использования глутоксима (в дозах 10 и 20 мг/кг) в терапии генерализованного туберкулеза на фоне двух основных про тивотуберкулезных препаратов изониазида и рифампицина. Лечение животных начинали на 10 день после заражения, когда в легких были обнаружены множественные субмилиарные очаги специфического воспаления. Длительность курса комплексной терапии составила 2 месяца, контроль за результатами лечения осуществляли в динамике с периодичностью в один месяц. Полученные результаты в ходе первого обследования животных (один месяц терапии) отражены в таблице 6. У нелеченных зараженных мышей показатели тяжести течения заболевания достаточно высоки: летальность -73,3% (выжило 4 из 15 животных), коэффициенты массы легких, печени и селезенки - 3,35±,038 усл. ед., 7,08±0,47 усл. ед. и 2,45±0,78 усл. ед. (соответственно), индексы поражения легких - 3,91±0,07 усл. ед., высеваемость микобактерий из селезенки - 300,0 КОЕ.
Изучение гепатозащитной активности глутоксима
Глутоксим (40мг/кг) полностью нормализовал нарушенное противотуберкулезными препаратами перекисное окисление липидов (таб. 22). При этом содержание МДА в гомогенатах печени животных этой группы снизилось до установленной нами нормы 6,94±0,44 нмоль/г и 6,59±0,38 нмоль/г (интактные крысы).
При морфологическом исследовании срезов печени крыс, получавших глутоксим в комплексе с противотуберкулезными средствами, отмечена тенденция к нормализации структуры печени, причем более отчетливая при использовании глутоксима в дозе 40 мг/кг. При этом печеночные балки имели правильное радиальное направление, и хотя гепатоциты были несколько увеличены в размерах, форма их сохранялась (рис. 8). Под влиянием глутоксима наблюдалось улучшение гемодинамики печени (таб. 23). Коэффициенты эффективной васкуляризации как в центральной, так и в периферической частях долек статистически не отличались от соответствующих показателей в ин-тактной группе и в 3,8-4,5 раза превышали цифровые данные животных, получавших только противотуберкулезные средства.
Таким образом, при изучении влияния глутоксима на морфофункциональ-ное состояние печени при экспериментальном ее повреждении противотуберкулезными средствами было показано, что исследуемый препарат обладает способностью существенно снижать выраженность структурно-метаболических нарушений печени.
В другой серии опытов на мышах (п=51) изучалось влияние глутоксима на фармакодинамику гексенала (гексеналовый сон). Эта модель позволяет судить об активности микросомальных ферментов печени.
Перед началом исследования животных разделили на 3 группы. Мыши опытной группы получали глутоксим в эффективной дозе 40 мг/кг (подкожно). Контрольными служили две группы мышей: первая - интактный контроль, вторая - группа сравнения, где использовали известный гепатопротек-тор эссенциале (80 мг/кг, внутрь). Постановку гексеналового теста осуществляли после тридцатидневного введения исследуемых веществ.
Как следует из таблицы, длительность гексеналового сна у интактных животных составила 61,92 минуты. Глутоксим оказывал существенное влияние на фармакодинамику гексенала. Так, под влиянием глутоксима продолжительность снотворного эффекта гексенала сократилась на 49,34 % и составила 30,55 минуты против 61,92 минуты в интактном контроле (р 0,002). Как видно из таблицы 24, выраженность ослабляющего действия глутоксима на снотворный эффект гексенала была сопоставима с аналогичной активностью стандартного гепатопротектора эссенциале (30,55 минут и 32,16 минут, соответственно).
Таким образом, на модели гексеналового сна мышей установлено, что глутоксим на уровне эссенциале оказывает стимулирующее влияние на активность микросомальных ферментов печени, что выражалось в сокращении продолжительности наркотического сна.
Влияние глутоксима на регенераторные процессы в легочной ткани определяли в опытах на 66 крысах по скорости развития и качеству течения компенсаторной гипертрофии легких на разных сроках после левосторонней пневмонэктомии (таб. 25, рис. 9). Видно, что у животных, получавших глуток-сим, происходит более полное и быстрое нарастание массы единственного правого легкого. Так, начиная с 10 суток наблюдения и в последующие сроки после пневмонэктомии, сухая относительная масса правого легкого опытных животных достоверно превышала соответствующие показатели контрольной группы (125,2+4,9 мг против 103,7±4,2 мг, р 0,05). Уже к 10 дню после операции сухая относительная масса единственного легкого у крыс, леченных глу-токсимом, приближалась к величине сухой относительной массы легких ин-тактных животных (125,2 ±4,9 мг и 138,8±3,9 мг). У контрольных крыс даже на 25 сутки после операции сухая относительная масса правого легкого (107,8 ±4,4 мг) не достигает интактного уровня (138,8±3,9 мг).
При изучении гистологических срезов тканей правого легкого контрольных крыс на ранних сроках после операции (1 и 4 сутки) отмечались более выраженные, чем у опытных животных, нарушения кровообращения в виде полнокровия, очаговых кровоизлияний в альвеолы и отека легочной ткани. В последующие сроки исследования (10 и 14 сутки) имелась тенденция к уменьшению размеров и количества геморрагических очагов и отечности легочной ткани. У всех животных контрольной группы, начиная с первых суток после оперативного вмешательства, обнаруживались отчетливые эмфизематозные проявления в виде расширения просветов альвеол, межальвеолярные перегородки в кортикальных отделах легкого, а у отдельных животных и в глубине легкого, были истончены, обеднены клеточными элементами и капиллярами.
