Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Иммуно-патогенетические и клинические аспекты генерализованных инфекций в перинатальном и раннем постнатальном периодах. проблемы этиотропнои терапии генерализованных кандидозных инфекций новорожденных 18
1.1. Этиологическая структура перинатальных инфекций 18
1.1.1. Этиологическая структура внутриутробных инфекций 18
1.1.2. Этиологическая структура бактериальных инфекций 22
1.1.3. Влияние внутриутробных инфекций на развитие и течение ранних и поздних инфекций перинатального периода 26
1.1.4. Место грибковых инфекций в структуре перинатальных инфекций 28
1.1.5. Полимикробные инфекции новорожденных 29
1.1.6. Проблемы диагностики инфекций новорожденных и интерпретации полученных данных 37
1.2. Клеточные и гуморальные факторы защиты при перинатальных инфекциях новорожденных 41
1.2.1. Клеточный и гуморальный иммунитет новорожденных, апоптоз иммунокомпетентных клеток и его роль в иммунной защите 41
1.2.2. Особенности формирования механизмов воспаления при генерализованных инфекциях перинатального периода 50
1.2.3. Современные представления о функциональной активности фагоцитирующих клеток крови 54
1.3. Поражение печени при перинатальных инфекциях 57
1.3.1. Особенности функции и морфологии фетальной печени 57
1.3.2. Клинико-лабораторные маркеры нарушения функции печени
1.3.3. Морфологические изменения в печени при перинатальных моно- и сочетанных генерализованных инфекциях различной этиологии 63
1.4. Специфическая терапия генерализованных кандидозных инфекций новорожденных и детей первых месяцев жизни 67
1.4.1. Проблема выбора антимикотических средств в лечении грибковых инфекций перинатального периода. Амфотерицин В — как «золотой стандарт» антифунгальной терапии новорожденных 67
1.4.2. Побочные эффекты терапии амфотерицином и способы преодоления его токсичности в неонатальной практике 69
1.5. Резюме 72
Собственные исследования 74
Глава 2. Клиническая характеристика больных, методы лабораторных и морфологических исследований 74
2.1. Общая клиническая характеристика обследованных больных 74
2.2. Методы лабораторных исследований
2.2.1. Иммунологическое обследование новорожденных 80
2.2.2. Оценка уровня апоптоза среди свежевыделенных клеток крови (лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов) 81
2.2.3. Определение сывороточных медиаторов/цитокинов по величине супрессорной и воспалительной активности сыворотки крови 81
2.2.4. Метод молекулярно-генетической диагностики внутриутробных инфекций у детей 82
2.2.5. Методы пато-гистологического исследования 82
2.2.6. Методы морфометрического анализа ткани печени у новорожденных детей 83
2.2.7. Иммуногистохимическое исследование маркеров апоптоза в клетках печени умерших новорожденных детей 83
2.2.8. Выделение культуры грибов для создания экспериментальной модели генерализованного кандидоза у мышей 84
2.2.9. Экспериментальная модель генерализованной кандидозной
инфекции на мышах линии С57В1/6 84
2.2.10. Морфометрический анализ печени мышей на фоне генерализованной грибковой инфекции и после лечения Амфотерицином В 85
2.2.11. Статистическая обработка полученных результатов 85
2.3. Резюме 86
Глава 3. Клинико-лабораторные закономерности перинатальных моно- и полимикробных инфекций у выживших и умерших новорожденных и детей первых месяцев жизни 87
3.1. Сравнительный анализ результатов этиологической расшифровки генерализованных инфекций 87
3.2. Сравнительный анализ акушерско-гинекологического и соматического анамнеза матерей выживших и погибших пациентов 96
3.3. Сравнительный анализ основных клинических синдромов раннего неонатального периода у выживших и умерших новорожденных при различной этиологии генерализованных инфекций 105
3.4. Микробиологический мониторинг моно- и полимикробных инфекций новорожденных 113
3.5. Результаты клинико-лабораторных исследований моно- и полимикробных инфекций новорожденных, характер функционального поражения печени при них 128
3.5.1.Клинико-лабораторная характеристика бактериальных
инфекций 128
3.5.2. Клинико-лабораторная характеристика TORCH-бактериальных инфекций 135
3.5.3. Клинико-лабораторная характеристика TORCH-бактериально-грибковых инфекций у умерших пациентов 140
3.5.4. Клинико-лабораторная характеристика бактериально-грибковых инфекций 145 3.5.5. Сравнительная клинико-лабораторная характеристика TORCH- инфекций и кандидозных инфекций 149
3.5.6. Сравнительный анализ синдрома цитолиза гепатоцитов у детей с TORCH-инфекциями и при отсутствии инфицирования возбудителями TORCH-комплекса 152
3.5.7. Сравнительный анализ синдрома цитолиза гепатоцитов в зависимости от инфицирования грибами Candida 155
3.5.8. Общая сравнительная характеристика клинических проявлений генерализованных инфекций перинатального периода различной этиологии 158
3.6. Резюме 160
Глава 4. Показатели иммунитета при перинатальных моно- и полимикробных инфекциях у новорожденных и детей первых месяцев жизни 162
4.1. Иммунный статус, уровни апоптоза свежевыделенных клеток крови и интегральная характеристика активности сывороточных медиаторов/цитокинов у здоровых новорожденных 162
4.2. Сравнительный анализ иммунного статуса у детей с моно- и полимикробными инфекциями 166
4.3. Сравнительный анализ апоптоза свежевыделенных клеток крови при генерализованнных инфекциях новорожденных различной этиологии 170
4.4. Сравнительный анализ функциональной активности клеток крови и активности сывороточных медиаторов-цитокинов по интегральным показателям биологической активности сыворотки крови у детей с генерализованными инфекциями перинатального периода различной этиологии 174
4.5. Общая сравнительная характеристика иммунологических изменений при перинатальных моно- и полимикробных инфекциях у новорожденных и детей первых месяцев жизни 178
4.6. Резюме 194
Глава 5. Патоморфологические преобразования в печени при генерализованных перинатальных инфекциях моно- и полимикробной этиологии у новорожденных и детей первых месяцев жизни 195
5.1. Характер и степень деструктивных изменений в печени в зависимости от этиологии инфекции 195
5.2. Репаративные процессы в печени новорожденных в зависимости
от этиологии инфекции 200
5.3. Апоптоз гепатоцитов в зависимости от этиологии генерализованной инфекции 202
5.4. Клинико-морфологическая картина поражения печени у новорожденных в зависимости от этиологии генерализованных
инфекций 214
5.6. Резюме 245
Глава 6. Структурные изменения в печени при генерализованной кандидозной инфекции у мышей линии сва. морфологические изменения в печени мышей при лечении амфотерицином в 249
6.1. Характер морфологических изменений в печени мышей на фоне кандидозного инвазивного процесса в зависимости от длительности инфекции 249
6.2. Морфологические изменения в печени мышей при лечении амфотерицином В 257
6.3. Резюме 259
Общее заключение 260
Выводы 298
Практические рекомендации 301
Список литературы
- диагностики инфекций новорожденных и интерпретации полученных данных
- Определение сывороточных медиаторов/цитокинов по величине супрессорной и воспалительной активности сыворотки крови
- Сравнительный анализ основных клинических синдромов раннего неонатального периода у выживших и умерших новорожденных при различной этиологии генерализованных инфекций
- Сравнительный анализ функциональной активности клеток крови и активности сывороточных медиаторов-цитокинов по интегральным показателям биологической активности сыворотки крови у детей с генерализованными инфекциями перинатального периода различной этиологии
Введение к работе
Актуальность исследования. Внутриутробные инфекции (ВУИ) и неонатальный сепсис являются наиболее актуальными и дискуссионными проблемами современной неонатологии. Новые вопросы в их диагностике и лечении возникают при применении современных методов, использующих молекулярно-биологические и генные технологии, способствующие возросшей выявляемости ВУИ, позволившие пересмотреть взгляд на внутриутробную патологию плода и считать ее преимущественно инфекционной (В. Ф. Учайкин, 2003; Л. Л. Нисевич, 2003).
Круг нерешенных вопросов, связанных с проблемой ВУИ, широк; разноречивы показатели доли ВУИ в структуре перинатальной смертности — от 2 до 65,6 % (Г. А. Самсыгина, Г. Н. Буслаева, 1997; И. С. Сидорова, И. Н. Герниченко,1998; Л. Л. Нисевич, А. Г. Талалаев, 2002; Л. Л. Нисевич,
A. Г. Талалаев, 2003; А. Д. Царегородцев, 2001; Д.В.Комарова, В. А. Цинзер-
линг, 1999; P.H.Wise, et al. 1995; L Barton, et al., 1999; P. Y. A. Ancel, 2001;
R. L. Goldenberg, 2003; B. J. Stoll et al., 2002). При проведении специальных
исследований частота выявления только вирусных инфекций у умерших как в
раннем неонатальном периоде, так и на первом году жизни детей доходит до
88-92% (Л. Л. Нисевич, 2002; О.В.Шарапова, А. А. Корсунский, 2003), при
этом, по мнению Л. Л. Нисевич и А. Г. Талалаева (1999), у подавляющего
большинства умерших детей имеются основания для диагностики врожденного
хронического генерализованного заболевания смешанной вирусной природы.
Эти данные входят в противоречие с официальной статистикой, согласно
которой инфекционные причины в структуре младенческой смертности
составляют только около 7 %. В остальных случаях причинами младенческой
смертности принято считать состояния перинатального периода (50 %), болезни
органов дыхания (15 %), отравления (5 %), врожденные аномалии (23 %),
т. е. состояния как бы неинфекционной природы, что «принципиально
неправильно, и, конечно, вредно, поскольку недооценка инфекционной
природы, как ведущей причины патологии, исключает возможность
реализовать наиболее эффективный этиотропный принцип лечения»
(В. Ф. Учайкин, 2003).
Иммуно-патогенетические взаимоотношения между ВУИ и перинатальными инфекциями бактериальной и грибковой природы остаются неясными; высказывается мнение, что антенатальные вирусные инфекционные процессы могут быть причиной врожденного иммунодефицита, что повышает риск интранатального бактериального или нозокомиального инфицирования и ведет к развитию сепсиса (Н. П. Шабалов, 2000).
По мере расшифровки механизмов антиинфекционной защиты и накопления новых данных происходит эволюция взглядов на природу генерализованных инфекций и сепсиса с трансформацией понимания сути этого патологического процесса: от ведущей роли инфекционного начала к приданию существенного значения реактивности макроорганизма (R. С. Bone, 1996; А. А. Останин, 2002; Ж. А. Ребенок, 2004). Несовершенство диагностических параметров SIRS в возрастном аспекте затрудняет унификацию показателей системного воспаления при септической патологии детского возраста (П.И.Миронов, 2001; Г. В. Яцык 2000; S. В. Brodie, 2000;
B. А. Таболин, 2001; Г. А. Самсыгина, гОП^иеЛ-цІШЯІїШі^йЯ1)'
изучение
сепсиса направлено, в большей мере, в стоцэдф'л щHf р^ртя Особенностей
3! 2*зї№\
ч————. і ,.,-.тшт.лт J«*
эффекторных биохимических структур (токсинов, цитокинов, медиаторов), реализующих воспалительный септический процесс (В. Beutler, 2001; J. Е. Butler, 2002; Н. А. Коровина, 2003). Однако ориентироваться на динамику уровня цитокинов у детей ненадежно, так как первоначальные представления о решающей роли неконтролируемых каскадно-медиаторных процессов в генезе полиорганных повреждений нуждаются в пересмотре с позиций гомеостатических взаимоотношений между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами с уточнением механизмов иммуносупрессии. В связи с этим поиск интегративных показателей системной воспалительной реакции, которые позволили бы оценить тяжесть и прогноз развивающихся септических реакций, особенно актуален для раннего детского возраста (Н. Dollner, 2001; М. С. Banerjea, 2002; А. П. Мощич, Е. Н. Хохлова, 2002).
Насущной потребностью практической медицины является дальнейшее совершенствование способов посмертной дифференциальной диагностики и патоморфологической характеристики состояния поражаемых органов при тяжелых инфекционных заболеваниях с изучением иммунных нарушений в них (М. Chiswick, 1995; V. Dhar, 1998; G. J. Escobar, 1998). Очевидно, что при всех генерализованных ВУИ и постнатальных инфекциях закономерно выявляют поражения печени. В то же время, печень — основной орган гомеостазирования млекопитающих, наиболее крупный компартмент системы мононуклеарных фагоцитов организма, которая, как филогенетически древняя, еще в антенатальном периоде участвует в раннем воспалительном ответе. Изучение особенностей структурной организации и воспалительных реакций в печени в зависимости от этиологии генерализованных инфекций новорожденных позволит разработать методы диагностики и подходы к коррекции развивающихся органных поражений.
Цель работы
Изучить клинические и иммуно-патогенетические закономерности генерализованных инфекций новорожденных и на их основе разработать критерии дифференциального диагноза и прогноза.
Задачи исследования
-
Изучить клинико-лабораторные проявления и выявить критерии дифференциальной диагностики ВУИ (TORCH), бактериальных, грибковых и сочетанньгх инфекций новорожденных.
-
Исследовать количественные и функциональные параметры иммунной системы, оценить характер воспалительных реакций при TORCH-, бактериальных, грибковых и полимикробных инфекциях новорожденных, выявить критерии дифференциального диагноза и прогноза.
-
Исследовать патоморфологические изменения в печени погибших больных детей в условиях перинатального инфицирования различной этиологии. Оценить системность проявлений апоптоза в различных органах.
-
Изучить влияние возбудителей TORCH-инфекций на иммуноморфогенез изменений в печени в условиях перинатального инфицирования бактериальной и грибковой этиологии.
5. Исследовать в эксперименте (у мышей) патоморфологические изменения в печени в условиях спонтанного генерализованного грибкового процесса и на фоне лечения амфотерицином В.
Научная новизна работы
-
Впервые проведена комплексная клинико-иммунологическая оценка генерализованных инфекций перинатального периода моно- и попимикробной этиологии и выявлены особенности иммунопатогенеза, позволяющие разработать критерии дифференциального диагноза и прогноза. В частности показано, что у детей с генерализованными моноинфекциями снижение пролиферативного ответа лимфоцитов ассоциировано с повышенным апоптозом МНК; у детей с TORCH-ассоциированными инфекциями максимальная выраженность иммуносупрессорнои активности сыворотки сопровождается снижением содержания клеток, экспрессирующих антигены 2-го класса гистосовместимости, с последующим нарушением антиген-презентирующей функции моноцитов и ко-стимуляторной функциональной активности Т-клеток; кандидозные и кандида-ассоциированные инфекции сопровождаются максимальным угнетением функциональной активности лимфоцитов (анергией).
-
Впервые изучено влияние персистирующих возбудителей TORCH-инфекций на течение воспалительного процесса и морфогенез изменений в паренхиме печени в условиях перинатального инфицирования бактериальной и грибковой этиологии, которое проявляется индукцией апоптоза гепатоцитов и меньшими масштабами деструктивных изменений.
-
Впервые изучена структурная организация печени и закономерности развивающихся изменений в условиях пролонгированного эксперимента генерализованного инфицирования животных грибами С. albicans, которые проявляются гранулематозным воспалением, деструктивными изменениями в паренхиме печени и внутри гранулем, подавлением пролиферативных процессов, имеющими волнообразную динамику.
Практическая и теоретическая значимость работы. Проведенные исследования позволили разработать клинико-иммунологические и клинико-морфолопгческие дифференциально-диагностические критерии генерализованных инфекций перинатального периода моно- и полимикробной этиологии; предложить клинико-иммунологические критерии тяжести заболевания и риска летального исхода.
Проведенная комплексная оценка клинической картины и морфометрических данных позволила выяснить характер влияния персистирующих возбудителей ВУИ на течение воспалительного процесса и иммуноморфогенез изменений в печени в условиях постнатального инфицирования различной этиологии, а также изучить масштабы и механизмы гибели гепатоцитов (взаимоотношения некроза и апоптоза) и репаративной регенерации при генерализованных инфекциях различной этиологии у новорожденных.
Пролонгированный эксперимент генерализованного инфицирования мышей грибами С. albicans позволил уточнить характер структурных преобразований в печени и морфогенез развивающихся изменений в услових кандидозного и медикаментозного (амфотерицином В) воздействия.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на съезде
инфекционистов СНГ (Суздаль, 1992), на съезде педиатров (Москва, 1995), на
заседаниях областной ассоциации врачей-инфекционистов (Новосибирск, 1995,
1997, 1999, 2002), врачей-педиатров (Новосибирск, 1997, 2000), врачей-
невропатологов (Новосибирск, 1998, 2001-2005), врачей-неонатологов
(Новосибирск, 2004, 2005), анестезиологов-реаниматологов (Новосибирск,
2002), акушеров-гинекологов (Новосибирск, 2004), на науч.-практ. конф.
«Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 1996, 1998,
2000), на научно-практической конференции врачей, посвященной 10-летнему
юбилею детской клинической больницы № 3 и 30-летию кафедры детских
инфекционных болезней НГМА (Новосибирск, 2000), на Всероссийской
конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы:
фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), на научно-практической конференции анестезиологов-реаниматологов и онкологов «Актуальные вопросы современной медицины» (Барнаул, 2004), на международной конференции неонатологов (Атланта, США, 2004). Результаты работы используются на базе МУЗ МДКБ № З, МУЗ МДКБ № 1 и других детских больниц и родильных домов Новосибирска. Материалы работы используются при чтении лекций на факультете усовершенствования врачей (инфекционистов, невропатологов, анестезиологов-реаниматологов).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 302 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, характеристику наблюдений и методов исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации и список литературы, включающий 639 источников (113 отечественных и 526 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 49 таблицами, 74 рисунками и 8 выписками из историй болезни.
диагностики инфекций новорожденных и интерпретации полученных данных
Этиологическая структура внутриутробных инфекций Заболевания, при которых заражение происходит в пренатальном периоде и источником инфекции является материнский организм, обозначаются термином ВУИ. Это понятие отражает сроки попадания микробного агента в организм плода и наличие клинических признаков заболевания, которые могут быть в различной степени выражены уже в момент рождения ребенка или проявляются позднее в перинатальном периоде или в раннем детском возрасте (45).
Данные о нозологической структуре ВУИ вообще и ВУИ, причастных к летальным исходам перинатального периода, противоречивы (69, 70, 51). В частности, в г. Санкт - Петербурге среди 386 новорожденных, умерших в 1994— 1996 гг., ВУИ как основной диагноз выявлены у 25,6% детей, как основной и сопутствующий диагноз — у 42% детей (108). При проведении специальных исследований частота выявления только вирусных инфекций у умерших как в раннем неонатальном периоде, так и на первом году жизни детей в Москве доходит до 88 — 92% (70). Проблема инфекций новорожденных тесно связана с проблемой мертворождаемости, синдромом задержки развития плода (39), формированием пороков развития и тканевых дисплазий (28, 60, 50). Доказано, что антенатальная инфекция может провоцировать мертворождаемость и синдром задержки развития плода посредством множества механизмов, включая прямое инфицирование плода, повреждение плацентарного барьера, болезнь матери. В развитых странах от 10% до 25% мертворождений вызваны инфекцией, в развивающихся странах, при более высоких коэффициентах мертворождаемости, вклад инфекции намного выше. Бактериальные микроорганизмы типа Escherichia coli, GSB и Ureaplasma urealyticum - чаще других возбудителей ассоциируются с рождением мертвого ребенка. Среди вирусных инфекций наиболее важны парвовирусы, цитомегаловирусы, вирусы Коксаки и др. (36). Токсоплазмы, лептоспиры, листерии также могут быть этиологическими факторами мертворожденности (277, 488). По данным Т. О. Klein, J. Remington в США примерно у 1% новорожденных можно выделить вирус цитомегалии, до 15% новорожденных инфицированы хламидиями, у одного на 1000 живорожденных диагностируют токсоплазмоз, герпетическую инфекцию или ветряную оспу. Л. С. Лозовская (55) на основании определения антигенов вирусов у новорожденных Москвы выявила их присутствие при клинически выраженной патологии — у 92,3% детей (в том числе у 74,3% — смешанную инфекцию), а у новорожденных без патологии при рождении — у 23,3%.
Как в отечественной, так и в зарубежной медицинской научной печати чрезвычайно мало публикаций, посвященных аутопсийной диагностике инфекций новорожденных, однако даже при таком ограниченном количестве исследований опубликованные результаты, несмотря на их противоречивость, весьма интересны и демонстративны. Так, в результате проведенных аутопсий 111 младенцев, умерших в одном из стационаров Лос-Анжелеса за 1990-1993г.г. (137) было обнаружено, что инфекция -наиболее частая причина смерти детей (56/111), которая уже в свою очередь сопровождалась РДС новорожденных (24/111), синдромом бронхолегочной дисплазии, врожденными дефектами (15/111). Именно инфекция была абсолютно доминирующей причиной смерти, приписанной РДС или незрелости. Только в одном случае ВЖК было первичной причиной смерти, тогда как у 19 детей (из 111) ВЖК интерпретировали посмертно как вторичную причину смерти на фоне инфекции. К моменту смерти инфекции были подразделены на врожденные (36/56) и приобретенные (26/56). Врожденные инфекции (в течение 48 часов после рождения) проявлялись пневмонией, вызванной микроорганизмами кишечника матери (507). Приобретенные инфекции (по результатам аутопсий) были, главным образом, вызваны дрожжами и госпитальными бактериями, при этом 12 детей были вне периода новорожденности - от 29 до 104 дней. Окончательной непосредственной причиной смерти у этих детей был сепсис, вызванный дрожжами, S. epidermidis, Pseudomonas и вирусом цитомегалии. Вирусы, таким образом, оказались маловероятный этиологией инфекции, приводящей к смерти. (618, 620). Ведущей причиной заболеваемости и смертности новорожденных являлась микробная колонизация и инфекция плацентарных тканей матери, что часто приводит к неблагоприятным результатам беременности, в том числе - преждевременным родам. Плодные оболочки плаценты, - физический и активный барьер на пути микробного вторжения, защищающий зародыша и обеспечивающий безопасность окружающей его внутриматочной среды. Плацентарный эпителий оказывает антимикробное действие и нейтрализует эндотоксины микроорганизмов, которые вторгаются в это «иммунно - привилегированное пространство» (366, 323). Хотя этиология преждевременного родоразрешения до сих пор неизвестна, имеется множество эпидемиологических и иммунологических доказательств того, что именно инфекция — частый причинный фактор в значительном числе преждевременных родов (279, 303). Наиболее частым вариантом материнской инфекции является инфекция, восходящая из нижних половых путей с последующей колонизацией амниотической жидкости, что, в свою очередь, ведет к колонизации дыхательных путей зародыша (367, 368, 370, 511, 589). Даже тривиальная ВУИ, по многочисленным данным, может вызывать усиленный воспалительный ответ, стимулируя цитокиновый каскад и заканчиваясь возможным нарушением развития новорожденного (448). Основной этиологический фактор преждевременного повреждения плодных оболочек и развития
Определение сывороточных медиаторов/цитокинов по величине супрессорной и воспалительной активности сыворотки крови
ПЦР-генодетекция инфекционных возбудителей позволяет проводить определение в одном клиническом образце нескольких вирусов или бактерий, выявляя наличие сочетанных инфекций у пациента. Проведено обследование 135 новорожденных детей, находившихся на лечении в инфекционном отделении патологии новорожденных и недоношенных детей муниципальной детской клинической больницы №3 г. Новосибирска. С учетом наибольшей распространенности среди патогенов, вызывающих развитие ВУИ, методом ПЦР проведена диагностика с целью выявления вируса простого герпеса (ВПГ), цитомегаловируса (ЦМВ), вируса гепатита В (ВГВ), а также возбудителей хламидиоза (Chlamydia trachomatis), микоплазмоза (Mycoplasma hominis) и уреаплазмоза (Ureaplasma urealyticum), токсоплазмоза (Toxoplasma gondii). В течение 2004-2005г.г. после лицензирования соответствующей тест-системы проводилась также детекция РНК вируса краснухи. Для исследования использовали образцы крови (0,5-1,0 мл), мочи (1,0-1,5 мл), цереброспинальной жидкости (0,5 мл).
Для исследования частоты и значения персистирующих инфекций, вызванных возбудителями внутриутробных инфекций, методом ПЦР проведена диагностика патогенов ВУИ в тканях 45 новорожденных, умерших от ГИ бактериальной и бактериально-грибковой природы. Для исследования использовали ткани печени (37), селезенки (17), почек (17), легких (15), мозга (16), сердца (12). Для проведения исследования использовали тест-системы, выпускаемые ЗАО "Вектор-Бест". Для диагностики токсоплазмоза использовали иммуноферментный анализ, выполнявшийся в клинико-диагностической лаборатории ЗАО "Вектор-Бест".
Аутопсию умерших новорожденных проводили в первые сутки после смерти. Исследовали нижний эпифиз бедра для определения максимального диаметра ядра окостенения. Для микроскопического исследования брали по 1-2 образца левой доли печени. Для световой микроскопии образцы печени фиксировали в 10 %-ом растворе формалина, обезвоживали по стандартной методике в серии этилового спирта и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином в комбинации с реакцией Перлса, по ван Гизону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили ШИК-реакцию. Просмотр препаратов и микрофотосъемка проводились на световом микроскопе Jenaval (фирмы Carl Zeiss, Jena, Германия).
Стандартное морфометрическое исследование включало подсчет объемной плотности (Vv) очагов дистрофически и некротически измененных гепатоцитов, отражающих выраженность алтеративных изменений в паренхиме печени; объемной плотности (Vv) двуядерных гепатоцитов и их численной плотности (Nai), позволяющие характеризовать компенсаторные репаративные реакции паренхимы печени. Достоверность сравниваемых величин оценивали по критерию Стьюдента. Различия считались достоверными при р 0505.
Материалом для исследования служил парафиновые срезы толщиной 1-3 мкм. Просмотр препаратов и микрофотосъемку проводили на световом микроскопе Jenaval (фирмы Carl Zeiss, Jena, Германия). Для иммуногистохимических реакций использовали следующие моноклональные антитела и Novostain Super ABC Kit производства Novocastra Lab. Ltd (United Kindom): 1) p 53 Protein (DO-7) (RTU-p53-D07); 2) bcl2 Oncoprotein (RTU-bcl-2; 3) p57 Protein (Kip2) (NCL-p57); 4) cytoceratin 19 (NCL-CK19); 5) КІ67 Antigen (NCL-L-Ki67-MM1).
После депарафинирования срезы обрабатывали в СВЧ печи для открытия антигена при температуре 120 в течение 7 минут, затем подавляли активность эндогенной пероксидазы 1,5% водным раствором перекиси водорода. Для блокирования неспецифических реакций срезы инкубировали с блокирующей сывороткой из набора. Инкубацию срезов с моноклональными антителами проводили 30-60 минут при комнатной температуре во важной камере. Промывали в PBS (рН 7,2-7,4). Затем срезы инкубировали с биотинированными атителами (affinity-purified antiimmunoglobulin, panspecific), использовали ABC комплекс фирмы Novocastra Lab. Ltd (United Kindom). Пероксидазу выявляли раствором диаминобензидина или VIP (наборы Vector Lab., USA). В качестве отрицательного контроля пропускали использование первых антител. Положительные контроли использовали по рекомендации фирмы-производителя первичных антител.
Культура C.albicans №483 была получена от больного новорожденного Лепилина А. (история болезни № 6487). Грибы выращивали на плотном агаре Сабуро при 37С в течение 2-х суток, смывали дистиллированной водой, суспензию центрифугировали при 1500g в течение 15 минут и готовили суспензию клеток гриба в стерильном физиологическом растворе. Полученную таким образом взвесь клеток C.albicans вводили однократно интраперитонеально в дозе 2,5x109 микробных тел С. albicans в объеме 0,2мл изотонического раствора NaCl.
Сравнительный анализ основных клинических синдромов раннего неонатального периода у выживших и умерших новорожденных при различной этиологии генерализованных инфекций
Ведущим клиническим синдромом и у выживших и у погибших больных 1-й группы в первые дни поступления в стационар был токсикоз в сочетании с пневмонией и локальными гнойными очагами (у выживших детей) и токсикоз в сочетании с полиорганной дисфункцией (у погибших детей). В процессе наблюдения детям, как правило, проводили лабораторное обследование с целью исключения диагноза «Сепсис». Все погибшие дети, по данным секционного исследования, имели признаки септического поражения внутренних органов. Частота вовлечения печени в генерализованый инфекционный процесс нарастала соответственно нарастанию тяжести болезни и ухудшению в состоянии ребенка.
В связи с отсутствием на сегодняшний день четких критериев неонатального сепсиса, этот термин не использовали в данной работе и трактовали как генерализованную инфекцию. Учитывая отсутствие в педиатрической практике надежных и достоверных клинических и лабораторных критериев SIRS-синдрома, наличие у 68% выживших и 60% умерших детей верифицированной микробиологическим обследованием бактериемии, с целью выяснения корреляции между выраженностью воспалительной реакции, степенью и характером печеночной дисфункции, клиническая картина у всех детей 1-й группы (и выжившие, и погибшие) была проанализирована исходя из критериев степени выраженности SIRS реакции и органных дисфункций по Bone (162, 42) с исследованием закономерностей поражения печени при этом (табл.24). Т.к. критериев SIRS синдрома, предложенных R. С. Bone, недостаточно для верификации воспалительной реакции у детей (и, особенно, у новорожденных), в целях большей объективизации результатов сравнительного анализа были использованы также дополнительные критерии (84): 1) фебрильная лихорадка свыше 3-х дней; 2) брадикардия и/или синдром глубокого угнетения функций ЦНС; 3) отечный синдром и/или генерализованная склерема; 4) дыхательные расстройства, не связанные с СДР и пневмонией; 5) геморрагический синдром; 6) желтушный синдром; 6) спленомегалия; 7) нарушения микроциркуляции. Результаты сравнительного анализа проявлений воспалительной реакции и органных дисфункций у выживших и умерших детей с оценкой коэффициентов корреляции и показателей относительного риска в развитии угрожающих жизни состояний при бактериальных инфекциях представлены в таблицах 24 и 25.
Выявлено, что такие показатели, как температура, лейкоцитоз, нарушения микроциркуляции были типичными критериями бактериальных инфекций у новорожденных и не имели достоверных различий в степени выраженности и встречаемости среди выживших и умерших детей, а потому их информативность в развитии угрожающих проявлений SIRS-реакций мала. С целью определения наиболее значимых критериев тяжести системной воспалительной реакции были расчитаны показатели относительного риска и корреляционные коэффициенты для анализируемых параметров (табл. 25).
Относительный риск развития угрожающей жизни больного системной воспалительной реакции возрастал с появлением отечного и геморрагического синдромов, в меньшей степени - спленомегалии, при которой существенным оказалось не столько наличие спленомегалии, сколько размеры селезенки - в см из-под реберной дуги (рис. 8).
Varl - размеры печени в см из-под реберной дуги у 75% умерших детей, Var2 — размеры печени в см из-под ребеной дуги у 75% выживших детей Рис.9. Сравнительные размеры печени у детей 1-й группы Т.о., как следует из данных таблиц 24 и 25 и рисунка 9 , поражение печени в виде гепатомегалии, гипербилирубинемии (преимущественно за счет длительно сохранявшихся нарушений конъюгации билирубина), цитолиза, коррелирующего со степенью тяжести системной воспалительной реакции, а также нарушение белково-синтетической функции было характерным для генерализованных бактериальных инфекций и оказалось одним из маркерных признаков угрожающего жизни больного состояния (рис 10). Признаков холестаза в лабораторных данных больных 1-й группы обнаружено не было.
Из данных рисунка 10 отчетливо видны отличия в активности ферментемии, отражающей интенсивность цитолиза гепатоцитов, у новорожденных с тяжелыми проявлениями генерализованной бактериальной инфекции по сравнению с аналогичным синдромом при бактериальной инфекции, завершившейся выздоровлением детей.
Сравнительный анализ функциональной активности клеток крови и активности сывороточных медиаторов-цитокинов по интегральным показателям биологической активности сыворотки крови у детей с генерализованными инфекциями перинатального периода различной этиологии
В отдельных случаях портальные тракты были склерозированы. Отмечали признаки внутрипеченочного холестаза. Объем деструктивных изменений в паренхиме печени больных в этой группе был больше, чем во 2-й и 3-й группах за счет дистрофических изменений гепатоцитов. Объем некрозов в 1-й группе был наибольшим среди исследованных групп. Объем и численная плотность двуядерных гепатоцитов не отличались от таковых показателей во 2-й и 3-й группах, а в сравнении с контрольной и 4-й группами были меньше, отражая низкий уровень регенерации.
Морфологическая картина поражения печени коррелировала с клинической картиной. У умерших больных выявляли признаки выраженного инфекционного токсикоза, лихорадку от субфебрильной до фебрильной, гепатомегалию в сочетании с максимальной среди больных всех групп ферментемией и нарушением основных функций печени на фоне прогрессирующих проявлений полиорганной недостаточности.
Клинический пример 5 (выписка из истории болезни). Мальчик И., д.р. 29.05.01г. Беременность у матери первая, протекала с гестозом во второй половине, лихорадкой в родах. Вес при рождении 2950г., длина 51см. Выписаны на 8-е сутки в связи с инфекцией у матери (диагноз в выписке не отражен). Через 2 дня после выписки был госпитализирован в ЦРБ с.Кочки (НСО) с остеомиелитом правой бедреной кости. Получал антибактериальную терапию (линкомицин, гентамицин), переливания СЗП, эритроцитарной массы. Был выписан через 2,5 недели терапии из стационара с клиническим и рентгенологическим улучшением. Через 2 суток после выписки был госпитализирован повторно с симптомами инфекционного токсикоза, энтероколита, гипотрофии II степени, железодефицитной анемии II степени. Общий анализ крови при поступлении: Лейкоциты - 9,9-109/л, нейтрофилы -59%, лимфоциты - 31%, моноциты - 10%. Эр. - 2,4-1012/л, НЬ - 67г/л. Была вновь начата антибактериальная терапия комбинацией антибиотиков (АМГ +
ЦСП), инфузионная терапия, переливания СЗП. Эффекта от проводимой терапии получено не было, токсикоз нарос, присоединились симптомы поражения легких в виде двусторонней пневмонии, почек (пиелонефрит). В связи с прогрессирующей тяжестью болезни и неэффективностью проводимой терапии ребенок был переведен в ОРИТ МДКБ№3 г. Новосибирска. Возраст на момент госпитализации - 26 дней. Состояние при поступлении было очень тяжелым, температура - 35,3С, ЧСС - 80 в минуту, ЧД - 40 в минуту, АД 60/30 мм.рт.ст., SaCb - 87%. Признаки ИТШ II степени, комы II степени (по Шахновичу). Была резко выраженной бледность кожного покрова, дистальный акроцианоз, диффузная «мраморность» кожи. «Нитевидный» пульс, тоны сердца были глухими. Дыхание в легких с обеих сторон было резко ослабленным, выслушивали влажные мелкопузырчатые хрипы. С поступления определяли гепатоспленомегалию (печень выстояла из-под ребра на 3,5см, селезенка - на 1,5 см.). ИВ Л с поступления.
Результаты лабораторного и инструментального обследования. Общий анализ крови с поступления и в динамике: от 27.06.01г.. Лейкоциты -14,6-109/л, нейтрофилы - 59%, лимфоциты - 38%, моноциты - 3%, Эр. -2,1-1012/л, НЬ - 57г/л.; 29.06.01г. - Лейкоциты - 11,2-109/л, нейтрофилы - 78%, лимфоциты - 18%о, моноциты - 4%, Эр. - 4,1-1012/л, НЬ - 120 г/л.; 3.7.01г. Лейкоциты — 15,5-109/л, нейтрофилы - 76%, лимфоциты - 22%, моноциты — 2%, Эр. - 3,Н012/л, НЬ - 106 г/л.; 5.0.7.01г. Лейкоциты - 18,9-109/л, нейтрофилы - 81%, лимфоциты - 16%, моноциты - 3%, Эр. - 2,7-1012/л, НЬ -71 г/л. Биохимическое обследование: Общий белок — 35 г/л, альбумины - 71%, глобулины - 28%, из них - а! - 2,9%, а2 - 2,9%, р - 12,7%, у - 8,1%. Общий билирубин — 67 мкмоль/л, мочевина - 15,4 ммоль/л, креатинин - 257 мкмоль/л, ПТИ - 84%, АЛТ - 5,1 ммоль/л, ACT - 3,2 ммоль/л., ПТИ - 55%, глюкоза - 2 ммоль/л. На протяжении всего времени болезни продолжали определять высокие ферменты печени (АЛТ - 4,5; 4,1; 2,4 ммоль/л, ACT - 2,3; 1,3; 1,1 ммоль/л), низкое содержание общего белка при низком ПТИ (несмотря на проводимую коррекцию), высокое содержание мочевины, креатинина, натрия.
При посеве крови на стерильность был выделен Acinetobacter. На рентгенограмме легких выявили двустороннюю перибронхиальную и периваскулярную инфильтрацию, КТИ - 0,6.
Проводили интенсивную терапию с использованием комбинированной антибактериальной терапии, сочетания вазопрессоров, внутривенного иммуноглобулина, инфузионой терапии (маннитол, СЗП, эритроцитарная масса, альбумин, контрикал и т.д.).
С вечера первых суток пребывания в ОРИТ присоединилась гипертермия до 38,9С и олигурия; до наступления летального исхода температура держалась на уровне 37,8С - 38,6С. На 3-й сутки пребывания в ОРИТ появились симптомы ДВС-синдрома, пастозность в отлогих местах туловища, наросли признаки динамической кишечной непроходимости, развилась анурия. В последующие дни явления полиорганной недостаточности прогрессировали, ОПН разрешить не удалось, сформировались обширные гипостазы, мозговая кома наросла до I степени, и на 8-е сутки от момента госпитализации ребенок умер.
Клинический диагноз: Сепсис, септикопиемическая фаза (Acinetobacter), двусторонняя пневмония, пиелонефрит, энтероколит, стеатогепатит. ИТШ II, СПОН (ОПН, ДВС, ОНГМ, РДС, ИВЛ). Гипотрофия II степени.
Патологоанатомический диагноз: Сепсис, септикопиемия (Acinetobacter): двусторонняя пневмония, апостоматозный пиелонефрит, катаральный энтероколит, спленит, жировая дистрофия печени III степени, ОНГМ.
Результаты гистологического исследования органов. Легкие - дольковая сливная пневмония, экссудат с наличием эритроцитов, альвеолоцитов, макрофагов, полинуклеаров. Сердце - паренхиматозная дистрофия кардиомиоцитов, плазматическое пропитывание стенок сосудов. Почки — множественные преимущественно в корковом слое очаги продуктивного распада полинуклеаров. В проксимальном и дистальном отделах нефрона множественные зернистые цилиндры, в дистальном отделе - полинуклеары + явления пролиферации эпителия.
