Характер аутоиммунных нарушений и уровень цитокинов воспаления при хроническом вирусном гепатите С [Электронный ресурс] Сундукова Анна Николаевна

Содержание к диссертации

Введение

Часть 1. Обзор литературы 10

Глава 1. Вирусологическая характеристика НСV-инфекции 10

Глава 2. Современные представления о иммунопатогенезе HCV-инфекции 15

Глава 3. Характеристики органоспецифических и неорганоспецифических аутоантител, криоглобулинов и ревматоидного фактора при HCV-инфекции 23

Глава 4. Роль регуляторных цитокинов в течении хронической HCV-инфекции 29

Часть 2. Собственные наблюдения 33

Глава 1. Материал и методы обследования 33

Определение ANA, АМА, ASMA, КГ, РФ и ИЛ-1/3, ИЛ-6, ФНО-а в сыворотке крови больных ХГС 34

Глава 2. Общая клиническая характеристика больных хроническим вирусным гепатитом С 40

Глава 3. Показатели уровней аутоантител (ASMA, АМА, ANA, anti-LKM-1) у обследованных больных ХГС 51

Глава 4. Показатели уровней криоглобулинов и ревматоидного фактора у больных ХГС в зависимости от степени активности заболевания 63

Глава 5. Показатели уровней ИЛ-1/3, ИЛ-6 и ФНО-а у больных ХГС с аутоиммунными нарушениями и при их отсутствии 69

Глава 6. Определение антител к структурным и неструктурным белкам у больных ХГС в зависимости от степени активности заболевания 76

Заключение 79

Выводы 91

Практические рекомендации 92

Приложение 93

Список литературы

• Характеристики органоспецифических и неорганоспецифических аутоантител, криоглобулинов и ревматоидного фактора при HCV-инфекции
• Определение ANA, АМА, ASMA, КГ, РФ и ИЛ-1/3, ИЛ-6, ФНО-а в сыворотке крови больных ХГС
• Показатели уровней аутоантител (ASMA, АМА, ANA, anti-LKM-1) у обследованных больных ХГС
• Показатели уровней ИЛ-1/3, ИЛ-6 и ФНО-а у больных ХГС с аутоиммунными нарушениями и при их отсутствии

Введение к работе

Инфекция, вызванная вирусом гепатита С (HCV), является глобальной проблемой здравоохранения многих стран мира, в том числе и России. Установлено, что в мире имеется 200 млн. инфицированных вирусом гепатита С, в том числе 5 млн. в Европе [83]. Заболеваемость гепатитом С в России за истекшие пять лет выросла более чем в 6 раз - с 3,2 до 21,2 на 100 тысяч населения (1998-2002 г.г.) [22], [30].

Острый гепатит С в 20% случаев заканчивается выздоровлением, с исходом в хронические гепатиты - 70%, на долю циррозов печени приходится 40% и гепатоклеточная карцинома составляет 60% случаев [5]. Отличительной особенностью вируса гепатита С является его высокая гетерогенность с образованием множества одновременно существующих, иммунологически различающихся антигенных вариантов, обладающих значительными возможностями адаптации и способностью избегать надзора иммунной системы хозяина [31].

Более подвержены инфицированию HCV подростки и лица молодого возраста. Высокий уровень хронизации с возможным исходом в цирроз и гепатоклеточную карциному печени определяют повышенное внимание к этому заболеванию, актуальность и значимость его дальнейшего изучения. Установлено, что вирус гепатита С вызывает не только поражение печени, но и дает многочисленные внепеченочные проявления, связанные с индукцией иммунных комплексов или развитием аутоиммунных процессов [31], с HCV- инфекцией может быть ассоциирован мембрано-пролиферативный гломерулонефрит, синдром нейропатии, изменения кожи, артрит, тиреоидит, синдром Шегрена, что подтверждается серологическими маркерами аутоиммунных нарушений.

Основными клинико-лабораторными показателями аутоиммунных нарушений в сыворотке крови больных хроническим вирусным гепатитом С являются органоспецифические (АТТГ, антитромбоцитарные антитела, антитела к

ДНК и нуклеопротеинам, антитела к кардиолипину) и неорганоспецифические аутоантитела (ASMA, ANA, АМА, anti-LKM-1), а также ревматоидный фактор и криоглобулины. Выявлено, что уровень этих аутоиммунных нарушений у больных ХВГС достоверно выше, чем у неинфицированных лиц в популяции в целом. Несмотря на то, что аутоиммунные процессы изучаются при ХГС на протяжении 10 лет, с момента внедрения тест-систем, выявляющих инфицированность HCV, роль и место аутоиммунных нарушений при данном заболевании до сих пор остается неясным. Поэтому представляет особый интерес изучение аутоиммунных нарушений у больных хроническим вирусным гепатитом С в сопоставлении с активностью процесса.

Цель работы

Изучить характер аутоиммунных нарушений при хронической HCV-инфекции в сопоставлении с уровнем цитокинов воспаления в группах больных с различной степенью активности инфекционного процесса.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать уровни аутоантител (ASMA, АМА, ANA, anti-LKM-1) у больных ХВГС с различной степенью активности процесса.

2. Установить наличие криоглобулинов и ревматоидного фактора у тех же больных.

3. Изучить клинические проявления у больных ХВГС с наличием аутоантител, ревматоидного фактора, криоглобулинов и без них в группах пациентов с минимальной, умеренной и высокой степенью активности.

4. Исследовать уровни ИЛ-1р\ ИЛ-6 и ФНО-ос у больных ХВГС с аутоиммунными нарушениями в сопоставлении с больными ХВГС без аутоиммунных нарушений.

5. Определить наличие антител к структурным и неструктурным белкам при ХГС в группах больных с различной степенью активности инфекционного процесса.

Научная новизна

Впервые у больных с хронической HCV-инфекцией комплексно изучены наличие аутоантител (ASMA, АМА, ANA, anti-LKM-1), уровней воспалительных цитокинов (ИЛ-1'Р, ИЛ-6, ФНО-а), криоглобулинов, ревматоидного фактора в группах пациентов различных по степени активности заболевания.

Наличие аутоантител (ASMA, АМА, ANA, anti-LKM-1) у больных ХГС обнаружено в 55% случаев. Установлено, что присутствие аутоантител оказывает влияние на степень активности и скорость прогрессирования патологического процесса при ХГС.

Выявлено, что у больных ХГС на фоне персистенции вируса гепатита С активности патологического процесса соответствует высокий уровень ФНО-а и наличие ревматоидного фактора.

Впервые был проведен корреляционный анализ между, наличием аутоантител (ASMA, АМА, ANA, anti-LKM-1), уровнем основных регуляторних цитокинов (ИЛ-1(3, ИЛ-6, ФНО- а) и выраженностью цитолитического синдрома у больных ХГС.

Установлено, что у больных ХГС имеется прямая корреляционная связь между наличием ревматоидного фактора, высоким уровнем ФНО-а с выраженностью цитолитического синдрома. Показано наличие корреляционной связи между выявлением аутоантител и уровнем ИЛ-ір в группах больных с цитолитическим синдромом.

Апробация работы и внедрение в практику

Работа выполнена на базе областной клинической больницы им.Н.Н.Бурденко г.Пензы, отделения гепатологии (2000-2003гг.).

Тема диссертационной работы является фрагментом комплексной темы кафедры инфекционных болезней Московской медицинской академии им. М.М.Сеченова (зав. кафедрой, член-корреспондент РАМН, профессор С.Г.Пак),

«Механизмы регуляции функциональных систем организма в условиях интоксикации» № 1970007158.

Рекомендации, полученные в результате исследования, внедрены в практику на кафедре инфекционных болезней ММА имени И.М.Сеченова и ОКБ имени Н.Н.Бурденко г.Пензы.

Все основные положения диссертации опубликованы в виде статей и тезисов докладов.

Материалы диссертационной работы были доложены на научно-практической конференции «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии» (22-23 мая 2003 года, г.Москва), на IV съезде инфекционистов России (28-31 октября 2003 года, г. Санкт-Петербург) и на научно-практической конференции КИБ № 2 5 июня 2003 года.

Работа апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней ММА имени И.М.Сеченова, лаборатории по изучению токсических и септических состояний кафедры инфекционных болезней.

Практическая значимость

В результате исследования установлено, что наличие аутоантител у больных ХГС дает возможность предполагать более выраженный цитолитический процесс в печёночной ткани. Среди больных ХГС с наличием аутоантител наиболее значимым показателем цитолитического процесса является ревматоидный фактор.

У больных ХГС рекомендуется исследование сыворотки крови на наличие ФНО-а и ревматоидного фактора, так как выявлена их прямая связь с выраженностью патологического процесса в печени. Следовательно, для подтверждения степени активности инфекционного процесса у больных ХГС показано исследование сыворотки крови на РФ и ФНО-а.

Часть 1. Обзор литературы Глава 1. Вирусологическая характеристика HCV-инфекции

История изучения HCV берёт своё начало в 1989 году. Группа американских исследователей под руководством M.Hoyghfon [58], впервые идентифицировала вирус гепатита С как этиопатогенетическую причину формирования хронического поражения печени. Позднее был разработан метод обнаружения сывороточных антител к рекомбинантному белку этого вируса. Вирусный гепатит С явился первым вирусом, существование которого удалось подтвердить на основе характеристики последовательности нуклеотидов, задолго до его электронно-микроскопической визуализации [100].

Было установлено, что HCV-вирус принаделжит к семейству Flaviviridae, роду Hepacivirus. Геном HCV представлен однонитевой линейной молекулой РНК, положительной полярности протяженностью около 9600 нуклеотидов.

Результаты многочисленных исследований строения генома HCV; строения и свойств белков HCV обобщены в ряде обзоров [47], [54], [72], [151], [108]. Установлено, что геном HCV содержит два некодирующих региона и одну большую открытую рамку считывания, кодирующую структурные и неструктурные белки вириона. Открытая рамка считывая кодирует полипептид, величина которого варьирует у разных изолятов от ЗОЮ до 3033 аминокислотных остатков [149] (рис.1). Он расщепляется вирусными и клеточными сигнальными протеазами на 4 структурных и 6 неструктурных белков. Гены, кодирующие структурные белки, располагаются в 5' области, неструктурные - в 3' области.

Высококонсервативному 5'-некодирующему региону (341-344 нуклеотидов) принадлежит роль в инициации трансляции.

Трансляция открытой рамки считывания ведет к синтезу большого полипептида - предшественника в ЗОЮ - 3033 аминокислот (в зависимости от субтипа вируса). Функция 3'- некодирующего региона на другом конце генома, в котором выделют 3 участка, недостаточно изучена. Открытая рамка считывания

(-9000 нуклеотидов) кодирует большой полипептид-предшественник (3000 аминокислот).

В цитоплазме или эндоплазматическом ретикулуме клетки хозяина полипептид подвергается процессингу, который происходит с участием протеаз хозяина и вируса, ведущий к образованию 10 белков (4 структурных и 6 неструктурных) [89].

К 4 структурным протеинам вириона относятся: белок нуклеокапсида CORE (С) и два белка оболочки -ENVELOP(Ej и Е2), являющиеся внешней гликопротеиновой оболочкой вириона, а так же белок (р 7).

CORE - протеин - основной вирусный структурный белок, который формирует вирусный нуклеокапсид, с этим белком связывают выраженность прямого цитопатического эффекта HCV. Показано, что соге-протеин модулирует транскрипцию и трансляцию некоторых клеточных генов,, обладает онкогенным потенциалом, может взаимодействовать с рецепторами В-лимфотоксина, с рецептором фактора некроза опухоли TNF_b модулировать ответ иммунной системы хозяина, опосредованный апоптозом лимфоцитов [41].

Поверхностные белки Ei и Е2 являются основными гликопротеинами вирусной оболочки HCV. Геном, кодирующий эти белки имеет участки с высокой частотой замены аминокислотных остатков, которые называются вариабельными - HVR2 и гипервариабельными HVR1 зонами.

Белки Ei и Е₂ высоковариабильны, что позволяет вирусу избегать иммунного надзора и длительно персистировать в организме [93], [87], [142]. Предполагается, что оболочечные белки определяют к тканям и клеткам мембран тропизм вируса. Установлено, что рекомбенантный Е₂ белок взаимодействует in vitro с СР81, который, как полагают, является рецептором для ВГС [132]. Связывание белка Е₂ HCV с белком СР81 приводит к снижению активации В-лимфоцитов, что способствует клональной пролиферации и продукции аутоантител [132], [76]. Неструктурные белки представлены следующими 6 белками: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. Они представляют собой ферменты и регуляторные пептиды.

NS2 белок образуется при аутокаталитическом расщеплении протеазой NS2/NS3. Активная* область этой протеазы содержит G - концевой NS2 и N -концевой NS3:

Белок NS3 - содержит серин-протеиназу, которая играет большую роль в заключительном этапе сборки вириона - разрезании неструктурных белков. В протеазном домене обнаружена очень слабая иммунногенность.[ 155].

С — . концевой домен белка NS3 обладает АТФазной/геликазной активностью, которая катализует «КЭП» синтез в геномной РНК [66]. Иммунный ответ на NS3 локализован в этом домене [155]; [105]:

Полипептид NS4 содержит 2. белка - NS4A и NS4B: Первый белок
выполняет роль кофактора сериновой протеазы- [45]. Вероятно^ что второй белок
принимает участие в образовании BFC - репликативного комплекса. Эпитопы в^;
NS4B генотип - специфичны. В: этом протеине также найдены; Т-эпитопы.
Наличие антитела к NS3 и NS4 белка, HGV встречается, у больных, как. с
хроническим, так и с острым вирусным гепатитом Є [Г57]! '.;

Область NS5 состоит из 2 белков - NS5A и: NS5B: Протеин NS5A интенсивно фосфорилирован. Предполагается; что он: является компонентом репликативного комплекса вируса. В инфицированной клетке этот белок локализуется около ядерной периплазматической мембраны вместе с белком NS5B. NS5B функционирует как РНК - зависимая- РНК-полимераза; Из-за отсутствия 3'-5- - экзонуклеарной активности. С этой РНК - полимеразой связана способность вирусов: к множеству точечных мутаций, что приводит к формированию квазивидов HCV [45].

Изучение гетерогенности нуклеотидных последовательностей регионов core, Е] и NS5 различных изолятов HCV, полученных в разных регионах мира, легло в, основу генотипической классификации HGV по P.E.Simmonds (1999г.). Все изоляты вируса візависимости от степени сходства генома подразделяются на 6 больших групп - генотипов. Внутри, которых выделяют подтипы. На данный момент описано более 100^і подтипов с различной частотой встречающиеся в разных регионах мира. Основные генотипы- 1, 2. 3 (особенно их подтипы 1а, 1в,

2а, 2в, За) - широко распространены. В США, Европе преобладает 1 генотип. Генотип 4 наиболее распространен в Центральной Африке, Египте. Генотип 5 преобладает на юге Африки, генотип 6 в Юго-Восточной Азии [31]. В России преобладает генотип 1в, составляя в различных регионах от 50% до 83% всех изолятов, реже встречаются За, 1а, 2а [16], [14].

В состав различных тест-систем по выявлению anti-HCV входят разнообразные сочетания антител, на основании которых разработан ряд тест-систем: 1-го поколения, И-го поколения, Ш-го поколения, IV-ro поколения. Наиболее распространенными являются системы Ш-го поколения. Их использование на первых этапах, по свидетельству ряда авторов, позволило выявить ОВГС на основании персистенции anti NS3[46],[66],[86],[99]. Но рост числа наблюдений за больными ОВГС и ХГС показал, что эти антитела не являются специфичными для острой инфекции. Разноречивость литературных данных в отношении диагностического значения антител к структурным и неструктурным белкам ВГС заставляют проводить дальнейшие исследования по сопоставлению активности процесса и выявляемостью антител к различным белкам НСV.

(poly A)

Открытая рамка

Трансляция, предшествующий полипротеин

H₂N

X El

'E2/NS1' NS2|
J I

^-JP-»!

^^

"NS5 * COOH

Протеазное расщепление

С El NS3

NS4 NS5

I I I I I 4 I

Хели
ENV ENV ? каза ? Репликаза

Рисунок 1. Схема организации генома вируса гепатита и функции генома гепатита С (М.С.Балаян, М.И.Михайлов)

Характеристики органоспецифических и неорганоспецифических аутоантител, криоглобулинов и ревматоидного фактора при HCV-инфекции

ANA - антиядерные антитела встречаются при заболеваниях соединительной ткани, аутоиммунном гепатите 1 типа в 95% случаях, а так же при синдроме Шегрена. При других заболеваниях они встречаются достоверно редко. При хроническом вирусном гепатите С ANA в сыворотке крови выявляются чаще у женщин, чем у мужчин и, как правило, в низких диагностических титрах [156], [43]. С большими колебаниями в выявляемое в исследованиях «здорового населения» ANA встречается в единичных случаях и у лиц старше 60-ти лет [11].

ASMA - антитела к гладкой мускулатуре относятся к классу JgM, и по своему характеру это антитела к S - актину гладких и скелетных мышц. Они присутствуют приблизительно у 70% больных аутоиммунным гепатитом 1 типа и выявляются у 50% больных ПБЦ [31], часто обнаруживаются при ревматологических заболеваниях [107]. Данные по встречаемости ASMA при ХВГС очень противоречивы и колеблются от 5 до 65%о случаев [147], [51], [107]. Появление ASMA можно рассматривать как следствие глубоких повреждений клеток печени, так как антиген этих аутоантител располагается в цитоскелете печеночных клеток и на поверхности клеточной мембраны [31]. В то же время ASMA транзиторно могут выявляться у 7% «здорового населения» в низких диагностически не значимых титрах.

АМА - антимитохондриальные антитела. Они не относятся к видоспецифичным или органоспецифичным аутоантителам. АМА в 100% случаев установлены у больных ПБЦ и служат основным патогномоничным маркерам в титре 1:40 для этого заболевания. Основной антиген АМА связан с митохондриями. Антигены, против которых направлены эти аутоантитела, находятся на внутренней мембране митохондрий [31]. Для заболевания ПБЦ характерен антигенный компонент М2, который входит в состав пируватдегидрогеназного комплекса (ПДГ) ферментов митохондрий. АМА к антигену М4 выявляется при перекрестном синдроме с АИГ, образование антител к некоторым митохондриальным антигенам не связано с ПБЦ. К ним относятся АМА МЗ, которые вырабатываются при лекарственном гепатите, АМА М5 при системных заболеваниях соединительной ткани [31]. Т-клеточным реакциям принаделжит главная роль в образовании АМА. Предполагают, что желчные протоки повреждаются с их участием [31]. Не исключено, что повреждение клеток желчных протоков происходит при активации Т-лимфоцитов с последующим вовлечением В-лимфоцитов и продукцией аутоантител [31].

Другая версия на образование АМА принадлежит перекрестным реакциям антигена клеток желчных протоков и микроорганизмов [31]. АМА перекрестно реагирует с субклеточным компонентом грамотрицательных и грамположительных бактерий [31]. Белки, чувствительные для АМА, выявляются в некоторых видах энтеробактерий и вероятно эти аутоантитела изначально направлены против антигенов энтеробактерий. Этим и объясняется частота обнаружения АМА у больных ХВГС без признаков ПБЦ.

По данным ряда авторов, частота обнаружения АМА при ХВГС колеблется от 1 до 8% [34], [118], [90], [71], [53], [51], [107]. Патогенетическое значение этих аутоантител не установлено. У здоровых лиц АМА, в том числе к пируватдегидрогеназе отсутствуют [20].

Anti-LKM-1 -являются антителами к микросомам печени и почек 1 типа.

Anti-LKM-1- впервые были описаны Rizzetto в 1973 г., их наличие является серологическими маркерами АИГ П типа [ПО]для них характерна гомогенность и реагирование со строго определенными линейными эпитопами Р450 2D6, в то время как при ХВГС а - LKM1 направлены против антигенных участков белков Р450 11D6, гетерогенны и выявляются в низких титрах [112], [95]. При ХВГС встречаемость а-LKM-l от 0 до 20% [101], [34], [90], [59], [71]. Возможно наличие а-LKM-l при ХВГС связано с гетерогенностью микросомных антигенов и может как иметь, так не иметь клинического и патогенетического значения.

Однако, ряд авторов считают, что у больных ХВГС с anti-LKM-І наблюдается более тяжелое поражение печени [101], [42], [79], [116], [111]. При ХВГС сочетающейся с тромбоцитопенией обнаруживались антитромбоцитарные антитела [112]. Выявление антител к тиреоглобулину у больных с хронической HCV-инфекцией составило от 10 до 15 % по данным разных авторов [53], [134].Выявление антител к кардиолипину составило до 22% [26], [109].

Серопозитивность одновременно по ANA и ASMA встречаются крайне редко, и не превышают 4-7% случаев [8], [107]. Присутствие аутоантител у больных ХВГС может приводить к более тяжелому поражению печени, что подтверждается биохимически и гистологически, однако аутоантитела не связаны с этиологическим фактором и до сих пор не ясно имеют ли они патогенетическое и клиническое значение. В то же время с наличием аутоантител связаны аутоиммунные заболевания, частота которых у больных ХГС достоверно выше, чем у неинфицированных ВГС. Частота иммунноопосредованных заболеваний и синдромов у HCV-инфицированных достигает 23%. Изучена роль HCV, как основного этиологического фактора при смешанной криоглобулинемии (криоглобулинемический синдром, криоглобулинемический гломерулонефрит) [84].

Доказана этиологическая значимость HCV для В-клеточной лимфомы, синдрома Шегрена, иммунной тромбоцитопении, аутоиммунного тиреоидита, красного плоского лишая [84]. Для больных гепатитом С характерна большая частота встречаемости сахарного диабета 1 типа по сравнению с неинфицированными лицами [85].

Определение ANA, АМА, ASMA, КГ, РФ и ИЛ-1/3, ИЛ-6, ФНО-а в сыворотке крови больных ХГС

Определение уровней се-LKM-l проводилось методом, основанным на твердофазном иммуноферментном анализе (набор реагентов Ymmulisa Anti-Liver-Kindey Mikrosomal (OJ-LKM-1) Antibodl E L A I S A YMMCO Diagnostic США).

Контроли, калибраторы и образцы сыворотки крови инкубировались в микролунках, обработанных антигеном LKM-1, в результате чего специфические антитела к LKM-1, присутствующие в сыворотки крови, связывались с антигеном. Не связавшиеся антитела и другие белки крови удалялись промывкой микролунок. Связывающиеся антитела инкубировались с антителами к JgG человека, конъюгированными с ферментом. Несвязавшийся конъюгат удалялся путем промывки микролунок. Затем в лунки вносился специфический субстрат фермента (pNPP). Присутствие антител обнаруживалось по появлению окрашивания, которое возникло в результате превращения субстрата в окрашенный продукт реакции. Далее с помощью автоматического фотометра при длине волны 405 нм определялась интенсивность окрашивания, которая была пропорциональна концентрации антител. Полуколичественная оценка результатов проводилась методом построения калибровочной кривой. Метод не требует особых условий проведения исследований, достаточно точен и прост в исполнении.

Определение ANA, АМА, ASMA и КГ в сыворотке крови больных ХГС

Определение ANA, АМА, ASMA и КГ проводилось методом непрямой иммунофлуоресценции (набор реагентов ATS COMVY-1 YMMC Diagnistic США). В методе непрямой иммунофлуоресценции исследуемые сыворотки наносились на тканевые срезы субстрат-НЕ-2/мыши и инкубировались в течении 30 мин. для связывания антител с тканевым субстратом. Несвязанные антитела удалялись промыванием. Связавшиеся антитела класса Jg инкубировались с меченными флуоресцентными козьими антителами против Jg человека. Результаты оценивались с помощью флуоресцентного микроскопа. На присутствие антител ANA, АМА, ASMA указывала характерная флуоресценция яблочно-зеленого цвета, обнаруживаемая в соответствующих гистологических структурах.

При определении в образцах ANA учитывалась только область специфического ядерного окрашивания почечных срезов и клеток НЕ-2. АМА обнаруживалось по специфическому окрашиванию почечных канальцев, ASMA -по окрашиванию стенок кровеносных сосудов почек. Титр антител, т.е. величину обратную наибольшему разведению, при котором еще наблюдается положительная реакция, определялся исследованием серийных разведений сыворотки, давшей положительную реакцию при первичной проверке. Результаты по ANA, АМА, ASMA считались отрицательными, если определяемый титр этих; аутоантител был меньше 10 на тканевых субстратах.

Определение криоглобулинов

Определение криоглобулинов проводилось качественным методом. Сыворотка крови инкубировалась при комнатной температуре до образования фибринового сгустка, который осаждался центи фугированием при 3000 об\мин в течение 15 минут. Отобранная сыворотка помещалась в холодильнике при температуре +4С сроком на 7 дней. После чего оценивались результаты визуализационным методом.

Определение ревматоидного фактора

Ревматоидный фактор (РФ) определялся в сыворотке полуколичественным методом латекс-агглютинации на слайде производства фирмы HUMAN (Германия). Метод основан на реакции агглютинации между ревматоидным фактором в исследуемой сыворотки и человеческим иммуноглобулином класса G (Jg), нанесенным на полистироловые латексные частицы. Результаты оценивались через 2 минуты при ярком искусственном освещении. Положительные и отрицательные контроли использовались с каждой серией образцов для более четкой идентификации агглютинации. Четкая агглютинация указывала на содержание РФ более, чем 20 МЕ/мл в неразбавленном образце. Латексные реагенты, контрольные и исследуемые сыворотки были доведенные до комнатной температуры. Далее помещали в отдельные лунки исследуемую сыворотку 40 мкл и положительные и отрицательные контроли. В каждый образец сыворотки добавляли 1,0% РФ-латексный реагент, тщательно перемешивали и распределяли сыворотки по каждой лунке, далее, в течение 2 минут, покачивали пластинку таким образом, чтобы смесь медленно вращалась внутри, результат оценивался" при ярком освещении через 2 минуты. Сыворотку с положительным результатом исследовали полуколичественным методом. Для полуколичественного определения образцы разводят глицериновым буфером. Титр антител определяют как последнее разведение, при котором наблюдается картина агглютинации. Концентрацию РФ в положительных образцах (в Мед/мл) оценивают в результате-умножения титра на коэффициент пересчета 12.

Показатели уровней аутоантител (ASMA, АМА, ANA, anti-LKM-1) у обследованных больных ХГС

При анализе полученных данных аутоантитела установлены у 52 больных ХГС, что составляет 55%. При изучении проявлений аутоиммунных нарушений у пациентов первой группы получены следующие результаты: сочетание anti-LKM-1, ASMA, ANA, АМА не встречалось; сочетание ASMA, ANA, АМА выявлено у одного больного в диагностически значимых титрах последовательно 1:80, 1:40, 1:40; сочетание ASMA, АМА выявлено в значительном количестве случаев у пяти пациентов в следующих титрах соответственно (рис.5): 1:40, 1:40 — 2 пациента; 1:80, 1:20 - 2 пациента; 1:160, 1:40-1 пациент. Во второй группе больных при изучении аутоиммунных нарушений выявлены следующие данные: сочетание antl-LKM-1, ASMA, ANA, AMA не встречалось; сочетание ASMA, ANA, AMA не выявлено ни у одного пациента; сочетание ASMA, AMA выявлено у двух больных в титрах: 1:40, 1::20-1 пациент; 1:160, 1:80-1 пациент; сочетание ANA, AMA выявлено у одного пациента в титрах 1:40, 1:40, anti-LKM-1 у четырех пациентов.

В третьей группе больных ни у одного пациента одновременно anti-LKM-1, ASMA, AMA и ANA не обнаружились, в то же время у двух пациентов обнаружены следующие сочетания ASMA и АМА в титрах: 1:40, 1:20 — 1 пациент; 1:160, 1:80-1 пациент; сочетание ANA, АМА выявлено у одного пациента в титрах 1:40, 1:40, anti-LKM-1 обнаружены у двух пациентов. В первой группе (n=28) ASMA выявлялись в диагностически значимых титрах 1:40 и выше у 6 (21,4%) больных. Во второй группе (п=39) в диагностически значимых титрах 1:40 и выше ASMA выявлялись у 12 (30,7%) пациентов. В третьей группе (n=27) ASMA в диагностически значимых титрах 1:40 и выше определилась у 8 (29,6%). Следовательно, частота выявления ASMA в диагностически значимых титрах не зависит от степени активности ХГС. Частота выявления ANA у больных ХГС в зависимости от степени активности заболевания представлена в таблице 16.

В первой группе (n-28) ANA выявились в диагностически значимых титрах 1:40 и выше у 2 (7,1%) больных.

Во второй группе больных (n=39), ANA обнаружились в диагностически значимых титрах 1:40 и выше у 1 (2,5%) больного. В третьей группе больных (п=27) в диагностически значимых титрах 1:40 и выше у 1 (3,7%) больного. Следовательно, у наблюдавшихся больных ХГС различий в выявляемое ANA от активности заболевания не было установлено. Частота выявления ANA у больных ХГС представлена на рисунке 9.

Частота выявления АМА у больных ХГС представлена в таблице 16 и на рисунке 10. Из таблицы 16 видно, что в первой группе больных АМА определялись в титрах 1:40 и выше у 4 (14,3%) пациентов. Во второй группе больных АМА в титре 1:40 и выше выявлены у 5 (12,8%) больных.

В третьей группе АМА в диагностически значимых титрах выявлены у 4 (14,8%) пациентов. Из вышеизложенного следует, что равномерное умеренное повышение АМА наблюдается у больных в первой и второй группах и более-выражено у больных в третьей группе.

Anti-LKM-1 в первой группе больных ХГС выявлены у 3 (10,7%), во второй. группе Anti-LKM-1 обнаружены у 4 (10,2%), в третьей группе Anti-LKM-1 встречались у 2 (7,4%) больных.

Как уже упоминалось, существуют различные точки зрения на патогенетическое значение аутоантител, причем часть авторов считает, что они не имеют клинического значения, другие же указывают на более тяжелое течение HCV-инфекции у больных с аутоантителами. В связи с этим представляло интерес изучить динамику биохимических показателей у больных ХГС с наличием аутоиммунных нарушений и без них в сопоставлении с активностью процесса. Сравнительная характеристика биохимических показателей у больных ХГС с различной степенью активности заболевания представлена в таблице 17. - достоверные отличия показателей от нормы # - достоверные отличия между группами Анализ таблицы 17 показал, что у больных первой группы (АЛТ=40МЕ) с наличием аутоиммунных нарушений, показатели цитолиза (АЛТ, ACT), уровень билирубина, ГГТ, ЩФ, общего белка, альбумина, тимоловой пробы достоверно не отличаются от группы больных ХГС без этих нарушений.

Сравнительная характеристика биохимических показателей больных П-ой группы (АЛТ=41 - 81МЕ) представлена в таблицах 18.

Показатели уровней ИЛ-1/3, ИЛ-6 и ФНО-а у больных ХГС с аутоиммунными нарушениями и при их отсутствии

Роль воспалительных цитокинов (ИЛ-1/3, ИЛ-6 и ФНО-а) в каскаде иммунологических реакций, определяющих исход инфекционного процесса, описана в литературе.

Целью нашего исследования являлось изучение уровней ИЛ-1/3, ИЛ-6 и ФНО-о: у больных ХГС с различной степенью выраженности цитолитического синдрома.

Характеристика уровней ИЛ-1/3, ИЛ-6 и ФНО-о; у больных ХГС первой группы по подгруппам (подгруппа 1 - больные с аутоантителами, подгруппа 2 — больные без аутоантител) представлена в таблице 30 и на рисунке 15. Уровень ИЛ-1/3 в подгруппе с наличием аутоантител был достоверно повышен (р 0,05) по сравнению с контрольной группой и подгруппой без наличия аутоантител. Уровень ИЛ-6 у больных ХГС в подгруппе с аутоантителами превышал контрольные значения, но был ниже в сравнении с подгруппой без наличия аутоантител. Значения ФНО-о: в подгруппе с аутоантителами превышал контрольные значения, но был снижен относительно показателей подгруппы без аутоантител.

Из вышеизложенного следует, что выявлены различия в показателях ИЛ-6, ИЛ-1(3 и ФНО-а между подгруппами с наличием аутоантител и их отсутствием. Значение ИЛ-6, ИЛ-1(3 были достоверно выше в подгруппе с наличием аутоиммунных нарушений. Уровень ФНО-а был достоверно ниже в подгруппе больных с наличием аутоантител.

Во второй группе больных ХГС с умеренной степенью активности процесса значение ИЛ-1Р, ИЛ-6 и ФНО-а в подгруппе с наличием аутоантител достоверно превышал норму (р 0,05) и уровень этих цитокинов во второй подгруппе без наличия аутоиммунных нарушений. Следовательно, нами выявлены достоверные повышения показателей ИЛ-6, ИЛ-ір и ФНО-а у пациентов с наличием аутоиммунных нарушений по сравнению с пациентами без аутоиммунных нарушений (таб.28, рис.16).

В третьей группе пациентов ХГС с высокой степенью активности уровень ИЛ-lp в подгруппе с наличием аутоантител был достоверно выше, чем у пациентов без аутоантител. Значение ИЛ-6 в подгруппе с аутоантителами было достоверно выше нормы, но не превышал уровня ИЛ-6 в подгруппе с отсутствием аутоантител. Уровень ФНО-а в подгруппе с наличием аутоантител достоверно превышал норму и уровень ФНО-а в подгруппе без наличия аутоантител.

Следовательно, в III группе больных ХГС обнаружены достоверные различия уровней ИЛ-ір и ФНО-а у пациентов с наличием аутоиммунных нарушений. Уровень ИЛ-6 достоверно отличался от контрольных показателей, но достоверно не отличался от значения в подгруппе без наличия аутоантител (таб.29, рис.17)

Уровни ИЛ-1(3 в группе больных минимальной степени активности достоверно превышали норму (р 0,001), и были достоверно выше в подгруппе с наличием аутоантител.

Показатели уровней ИЛ-6 достоверно превышали норму и были достоверно повышены (р 0,05), в подгруппе с наличием аутоантител.

Уровни ФНО-а в данной группе достоверно повышены (р 0,05), от нормы и значения ФНО-а в подгруппе с наличием аутоантител были достоверно ниже значений ФНО-а в подгруппе без наличия аутоантител (таб.27, рис.18, рис.19).

В группе больных умеренной степени активности значения ИЛ-1(3, ИЛ-6 и ФНО-а достоверно превышали контрольные значения.

Уровни ИЛ-1(3 достоверно были повышены в подгруппе с наличием аутоантител, и превышали значения ИЛ-1(3 в подгруппе минимальной степени активности с наличием аутоантител.

Уровни ИЛ-6 так же были повышены в подгруппе с наличием аутоантител и их значения были значительно выше, чем в такой же подгруппе минимальной степени активности.

Значения ФНО-а в подгруппе с наличием аутоантител превышали значения ФНО-а в подгруппе без аутоантител, и достоверно превышали аналогичные показатели в подгруппе минимальной степени активности с аутоантителами.

В группе больных высокой степени активности уровни ИЛ-1(3, ИЛ-6 и ФНО-а значительно превышали контрольные значения.

Уровни ИЛ-6 в подгруппе с наличием аутоантител значительно превышали уровни ИЛ-6 в подгруппе без аутоантител, достоверно превышая аналогичные показатели в подгруппе умеренной степени активности с наличием аутоантител.

Концентрация ФНО-а в подгруппе с наличием аутоантител была достоверно повышена, в сопоставлении с аналогичными показателями в подгруппе у больных умеренной степени активности (таб.27, рис.18).

Мы сопоставили показатели уровней ИЛ-1(3, ИЛ-6 и ФНО-а у больных ХГС в зависимости от степени активности заболевания и провели расчет соответствия X" для подтверждения наличия связи между уровнем ИЛ-1(3 и степенью активности заболевания (X" = 4,9, р = 0,03), а также уровнем ФНО-а и тяжестью течения заболевания (Х = 4,13, р = 0,04).

Дополнительно, в целях уточнения связи между уровнями изучаемых цитокинов и активностью процесса при ХГС, мы провели корреляционный анализ Пирсона. Выявлена прямая средняя корреляционная связь уровня ФНО-а со степенью активности заболевания г = 0,3 (р = 0,014).

При анализе приведенных данных установлено, что у больных ХГС с минимальной степенью активности (группа І) в сопоставлении с больными с умеренной степенью активности (группа II) и больными ХГС с высокой степенью активности процесса (группа III), выявлены крайне высокие значения ИЛ-1(3 в группе пациентов с высокой степенью активности, достоверно превышающие аналогичные показатели в группе больных ХГС с минимальной степенью активности и в группе больных с умеренной степенью активности заболевания.

Выявленные сочетания умеренного повышения ИЛ-6, значительного повышения уровней ФНО-а и ИЛ-1/3 в группах больных ХГС с выраженной активностью процесса, свидетельствуют о несбалансированности клеточного и гуморального иммунного ответа, особенно выраженного на фоне присутствия аутоиммунных нарушений.

Таким образом, установленный характер общности цитокинового профиля у больных ХГС находится в соответствии с активностью заболевания, а также степенью выраженности цитолитического синдрома и косвенно подтверждается данными инструментальных исследований.

Похожие диссертации на Характер аутоиммунных нарушений и уровень цитокинов воспаления при хроническом вирусном гепатите С [Электронный ресурс]

Диагностическая роль коллагена IV типа и гиалуроновой кислоты в оценке степени воспаления и стадии фиброза печени у больных хроническим гепатитом ССафиуллина Наиля Ханифовна

Роль факторов роста в оценке активности воспаления и фиброгенеза печени у больных хроническим гепатитом СИвкова Анастасия Николаевна

Влияние характера операции на функциональное состояние печени у больных хроническим гепатитомСтарцев Андрей Борисович

Липидно-метаболические нарушения, характер питания и социальный градиент у пришлого населения ЯкутииКылбанова Елена Семеновна

Причины и характер нарушений тромбоцитарного звена гемостаза у больных, оперированных на сердце в условиях искусственного кровообращенияИсаева Анастасия Михайловна

Характер нарушений гемодинамики в раннем послеоперационном периоде у детейИсмаил-Заде Играр Андреевич

Психические нарушения непсихотического характера у больных сахарным диабетом (особенности преморбида, реакции на болезнь, психоэндокринный и психоорганический синдромы, лечение) [Электронный ресурс]Лобанова Елена Валентиновна

Характер и механизмы нарушений неспецифической резистентности организма и специфической иммунной защиты при остром отравлении веществом BZСидельникова Наталия Михайловна

Частота и характер латентных форм нарушений ритма сердца у больных сахарным диабетом выявленных под воздействием проб с физической нагрузкой и при суточном мониторировании ЭКГФаталиева, Гюляр Рза-Кули кызы

Характер и течение нарушений ритма сердца в зависимости от степени недостаточности мозгового кровообращенияЛоктев Герман Евгеньевич