Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1 Общая характеристика иммуномодуляторов 15
1.2 Принципы функционирования врожденной иммунной системы 17
1.3 Бактериальные иммуномодуляторы как аналоги ПАМП 25
1.4 Иммунобиологические и терапевтические свойства мурамилпептидов 28
1.5 Иммунобиологические и терапевтические свойства микробной ДНК и ее аналогов 45
1.6 Дендритные клетки — связующее звено между врожденным и адаптивным иммунитетом 53
1.7 Роль хемокинов CCL19 и CCL21 в миграции дендритных клеток и клеток адаптивной иммунной системы 56
1.8 Дистанционное управление клеточным составом ЛУ как способ иммуномодулирующего воздействия 59
1.9 Резюме 60
ГЛАВА 2. Материалы и методы 62
2.1 К главе 3 62
2.2 К главе 4 74
2.3 К главе 5 79
2.4 К главе 6 85
2.5 Статистическая обработка данных 90
ГЛАВА 3. Иммунобиологические свойства мурамилпептидов грамотрицательных бактерий 91
3.1 Получение комплекса мурамилпептидов из S. typhi и подтверждение его биологической активности 91
3.2 Влияние мурамилпептидов грамотрицательных бактерий на МФ и ДК человека in vitro 93
3.3 Факторы, определяющие различия в ответе ДК и МФ на мурамилпептиды in vitro 102
3.4 Характеризация рецепторов, участвующих в активации МФ под действием ГМтри и диГМтетра 109
3.5 Характеризация поглощения, процессинга и сигнальных путей ГМтри и диГМтетра ВМФ 114
3.6 Иммуностимулирующая активность производных мурамилпептидов 119
3.7 Индукция толерантности и перекрестной толерантности МФ к мурамилпептидам и ЛПС 120
3.8 Влияние КМП грамотрицательных бактерий на врожденный иммунитет мышей 124
3.9 Обнаружение и характеризация антител к КМП 128
ГЛАВА 4. Клиническая и иммунологическая эффективность комплекса мурамилпептидов грамотрицательных бактерий (препарата «Полимурамил») 133
4.1 I фаза клинических испытаний 134
4.2 П/Ш фаза клинических испытаний 141
ГЛАВА 5. Противоопухолевая активность и механизмы действия CpG-ОДН 7909 у пациентов с метастатической меланомой (II фаза клинических испытаний) 145
5.1 Характеристики пациентов 145
5.2 Терапевтическая эффективность 148
5.3 Нежелательные явления 149
5.4 Изменения фенотипических и функциональных свойств клеток крови в ходе лечения CpG-ОДН 7909 151
5.5 Лабораторные предикторы эффективности CpG-ОДН 7909 161
5.6 Анализ ЛУ, дренирующих места введения CpG-ОДН 7909 161
5.7 Анализ метастазов, прогрессирующих после частичной ремиссии или стабилизации 167
ГЛАВА 6. Дистанционное управление миграцией клеток иммунной системы с помощью трансгенной экспрессии хемокинаССЬ21 в коже 169
6.1 Трансфекция плазмидами, кодирующими mCCL21, приводит к экспрессии и секреции mCCL21 клетками COS-7 in vitro 169
6.2 Трансгенный mCCL21 обладает функциональной активностью 171
6.3 Трансгенный и рекомбинантный CCL21 повышают поглощение декстрана и экспрессию CD40 на ДК 174
6.4 Введение mCCL21-кодирующих плазмид в кожу с помощью генного ружья вызывает экспрессию mCCL21 в эпидермисе с последующей диффузией в дерму и накоплением в дренирующих ЛУ 175
6.5 Внутрикожное введение плазмид, кодирующих mCCL21, вызывает миграцию ДК и различных субпопуляций Т-клеток в дренирующие ЛУ 177
6.6 Внутрикожное введение плазмиды, кодирующей mCCL21, усиливает эмиграцию ДК из трансфицированных участков кожи 180
ГЛАВА 7. Обсуждение 182
7.1 «Полимурамил» — иммуномодулятор на основе естественных мурамилпептидов грамотрицательньгх бактерий 182
7.2 CpG-ОДН 7909 — синтетический аналог бактериальной ДНК с противоопухолевой активностью 203
7.3 Дистанционное управление клеточным составом ЛУ путем трансгенной экспрессии хемокинов в коже 214
7.4 Заключение 217
Выводы 222
Благодарность 224
Список литературы
- Бактериальные иммуномодуляторы как аналоги ПАМП
- Влияние мурамилпептидов грамотрицательных бактерий на МФ и ДК человека in vitro
- П/Ш фаза клинических испытаний
- Внутрикожное введение плазмид, кодирующих mCCL21, вызывает миграцию ДК и различных субпопуляций Т-клеток в дренирующие ЛУ
Введение к работе
Актуальность
Разработка препаратов, направленных на повышение резистентности организма против инфекций и на отторжение злокачественных опухолей является важной, актуальной задачей. Это обусловлено ростом частоты инфекций, вызванных антибиотикоустойчивыми штаммами бактерий (Gould, 2008), ростом частоты хронических инфекционно-воспалительных заболеваний, сопровождающихся вторичными иммунодефицитами, ростом частоты злокачественных новообразований.
Повышение резистентности против инфекций может быть достигнуто путем стимуляции как адаптивного, так и врожденного компонентов иммунной системы. Вакцины активируют адаптивный иммунитет и обеспечивают длительную специфическую защиту, которая, как правило, развивается медленно и эффективна только против одного вида микроорганизмов. Иммуномодуляторы бактериального происхождения активируют врожденный иммунитет. Поэтому защитное действие этой группы препаратов, в отличие от действия вакцин, наступает быстро, а также является относительно неспецифичным, т.е. эффективным против больших групп патогенов. Все это делает иммуномодуляторы бактериального происхождения мощными средствами не только профилактики, но и лечения инфекций. Иммуномодуляторы, в отличие от антибиотиков, не действуют непосредственно на микробы, в связи с чем к ним не формируется лекарственной устойчивости у микробов. Кроме того, правильно подобранная иммунотерапия позволяет частично или полностью восстановить нарушенную функцию иммунитета у пациентов с вторичными иммунодефицитами, по крайней мере на время лечения антибиотиками.
Учитывая сказанное, иммуномодуляторы бактериального
происхождения целесообразной применять совместно с антибиотиками для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний, особенно при инфекциях лекарственно-устойчивыми штаммами и/или при наличии иммунодефицитных состояний (стратегия «двойного удара» [Пинегин, Андронова, 1998]). Кроме того, эта группа иммуномодуляторов может применяться и в ситуациях, требующих быстрого повышения резистентности организма при угрозе индивидуального или массового заражения. Учитывая разнообразие микроорганизмов, иммуномодулятора «против всех инфекций», вероятно, не существует. Однако поиск препаратов, дающих оптимальную защиту против определенных видов инфекций, оправдан и пока далек от завершения.
Известные на сегодня бактериальные иммуномодуляторы относятся в основном к двум группам: 1) мурамилпептиды и их синтетические аналоги; 2) нуклеиновые кислоты и их синтетические аналоги. Мурамилпептиды
представляют собой мономерные фрагменты пептидогликана (ПГ) бактерий. Все известные на сегодня мурамилпептидные иммуномодуляторы, в том числе отечественный препарат Ликопид, являются аналогами мурамилдипептида, который активирует врожденный иммунитет через рецептор NOD2 (Girardin et al, 2003; Meshcheryakova et al, 2007). В то же время мурамилпептиды грамотрицательных бактерий обладают структурной особенностью, а именно содержат в 3-м положении остаток мезо-диаминопимелиновой кислоты (мезо-ДАП). Такие мурамилпептиды распознаются рецептором NODI (Chamaillard et al, 2003). По данным литературы, агонисты NOD1 являются более эффективными активаторами системы фагоцитов, чем агонисты NOD2, и поэтому лучше защищают от бактериальных инфекций (Clarke et al, 2010). Однако возможности терапевтического применения мурамилпептидов грамотрицательных бактерий, активирующих рецептор NOD1, практически не исследованы. Недостаточно изучены механизмы действия этих мурамилпептидов на клетки врожденной и адаптивной иммунной системы и на организм человека в целом, не охарактеризована возможная терапевтическая эффективность при инфекционно-воспалительных заболеваниях.
Целью иммуномодулирующей терапией при онкологических заболеваниях является разрыв выгодных для опухоли взаимоотношений с иммунной системой, активация клеток-эффекторов противоопухолевого иммунитета. В этом отношении привлекательны синтетические олигодезоксинуклеотиды (ОДН), содержащие тандемы «неметилированный цитозин — гуанин» (CpG). Эти соединения представляют собой синтетические аналоги бактериальной ДНК (Krieg et al, 1995). CpG-ОДН обладают несколькими видами противоопухолевой активности: вызывают выработку интерферонов (ИФН) I типа, которые обладают антипролиферативным и иммунодулирующим действием; посредством ИФН вызывают активацию противоопухолевых эффекторов — NK-клеток, CD8+ Т-клеток; вызывают созревание плазмацитоидных дендритных клеток, что способствует индукции адаптивного иммунного ответа против опухоли (Krieg et al, 2002). В доклинических испытаниях на животных показана противоопухолевая активность CpG-ОДН in vivo, тогда как в I фазе клинических испытаний показана безопасность CpG-ОДН у человека (Krieg et al, 2004). Однако терапевтическая эффективность CpG-ОДН у пациентов со злокачественными опухолями не изучена. Не решен принципиальный вопрос: возможно ли путем активации врожденной иммунной системы с помощью CpG-ОДН добиться регресса злокачественной опухоли у человека. Не охарактеризованы механизмы действия CpG-ОДН при злокачественных новообразованиях, биомаркеры ответа иммунной системы на CpG-ОДН, предикторы возможной клинической эффективности CpG-ОДН.
Бактериальная ДНК, помимо активации врожденного иммунитета, может выступать и в ином качестве — как носитель (вектор) генотерапевтического воздействия. Традиционные бактериальные иммуномодуляторы, воздействуя на клетки иммунной системы, вызывают изменение экспрессии сотен генов. Генотерапия представляет собой принципиально иной подход к иммуномодуляции, поскольку позволяет более тонко влиять на отдельные процессы в иммунной системе путем изменения экспрессии отдельных генов. Одним из таких процессов является миграция клеток, которая контролируется хемокинами (цитокинами-хемоаттрактантами). Регулирование миграции путем трансгенной экспрессии хемокинов, которая обеспечивается бактериальными векторами, можно рассматривать как способ иммуномодулирующего воздействия. Однако возможности этого подхода практически не изучены. В частности, одним из ключевых хемокинов, регулирующих миграцию клеток врожденной и адаптивной иммунной системы, является CCL21 (von Andrian, Mempel, 2003). Неизвестно, можно ли с помощью плазмидных векторов добиться значимой экспрессии CCL21 in vivo. Неизвестны кинетика и распределение трансгенного белка в организме. Неизвестно, какое влияние может оказывать трансгенный CCL21 на миграцию клеток в месте экспрессии и во вторичных лимфоидных органах.
Цели и задачи Цель работы — изучение механизмов действия и терапевтической эффективности иммуномодуляторов бактериального происхождения на основе мурамилпептидов, бактериальной ДНК и ее синтетических аналогов.
Задачи:
-
Изучить иммунобиологические свойства мурамилпептидов грамотрицательных бактерий.
-
Изучить терапевтическую эффективность мурамилпептидов грамотрицательных бактерий в клинических испытаниях.
-
Изучить терапевтическую эффективность и механизмы действия синтетического олигодезоксинуклеотида, содержащего неметилированные тандемы цитозин-гуанин (CpG-олигодезоксинуклеотида), в клинических испытаниях при метастатической меланоме.
-
Изучить возможность применения бактериальной плазмидной ДНК как носителя геноспецифического иммуномодулирующего воздействия (на модели регулирования миграции клеток иммунной системы путем трансгенной экспрессии хемокина CCL21, достигаемой с помощью плазмидных векторов).
Научная новизна
В работе получены новые данные о возможностях клинического применения и механизмах действия мурамилпептидов и CpG-ОДН; предложен принципиально новый подход к иммуномодуляции, основанный на временной трансгенной экспрессии хемокинов.
В частности, впервые систематически изучены иммунобиологические свойства естественных мурамилпептидов грамотрицательных бактерий, содержащих остаток мезо-ДАП. Впервые показано, что иммуномодулирующей (иммуностимулирующей) активностью обладают мурамилпептиды, содержащие остаток мезо-ДАП не только в концевом положении, но и внутри олигопептидной цепи.
Впервые охарактеризован рецепторный аппарат и сигнальные пути, участвующие в активации клеток под действием димерного мурамилпептида диГМтетра. В отличие от мономерного ГМтри, который распознается преимущественно через NOD1, в распознавании диГМтетра участвуют рецепторы NODI, NOD2 и TLR2. С помощью ингибиторного анализа показано, что оба мурамилпептида активируют сигнальную цепочку RIP2 -IKK - NF-кВ, а также киназу р38.
На основе этих предпосылок впервые создан иммуномодулирующий препарат, представляющий собой комплекс мурамилпептидов (КМП) грамотрицательных бактерий (ГМтри + ГМтетра + диГМтетра). Впервые показано, что КМП активирует систему фагоцитов у экспериментальных мышей и обладает выраженным протективным действием против бактериальных инфекций. В доклинических и клинических испытаниях показана безопасность этого препарата. В рамках клинических испытаний указанного комплекса мурамилпептидов впервые изучено влияние агонистов NOD1 на иммунную систему человека. Показано, что при введении здоровым добровольцам препарат усиливает бактерицидность лейкоцитов, индуцирует выработку провоспалительных цито- и хемокинов, С-реактивного белка, IgM. Впервые показано, что лабораторными маркерами ответа на мурамилпептиды грамотрицательных бактерий у человека могут служить уровни хемокинов CCL4 (МІР-lp) и CCL2 (МСР-1), цитокина ИЛ-6, а также С-реактивного белка в сыворотке. Во П/Ш фазе клинических испытаний впервые показано, что КМП обладает терапевтическим действием у пациентов с гнойной инфекцией, ускоряет их выздоровление при добавлении к стандартному лечению (хирургическая операция + антибиотикотерапия).
Впервые обнаружено, что миелоидные ДК при стимуляции мурамилпептидами секретируют существенно более низкие количества провоспалительных цито- и хемокинов, чем макрофаги (МФ) при тех же условиях стимуляции, что обусловлено минимум двумя факторами: ранним прекращением экспрессии генов провоспалительных цитокинов и
неэффективностью трансляции мРНК провоспалительных цитокинов в ДК, стимулированных мурамилпептидами. Впервые показано усиливающее действие интерлейкина-ip на секрецию цитокинов ДК при стимуляции мурамилпептидами.
Показано, что мурамилпептиды грамотрицательных бактерий не индуцируют перекрестную толерантность к липополисахариду (ЛПС). В то же время мурамилпептиды индуцируют перекрестную толерантность друг к другу, а также не влияют на ЛПС-индуцированную толерантность к ЛПС, что обосновывает возможность сочетанного применения мурамилпептидов и ЛПС для профилактики септического шока.
Впервые обнаружены антигенные и иммуногенные свойства диГМтетра, изучены кинетика, изотипический состав и эпитопная специфичность антител (AT) к диГМтетра, показаны их защитные свойства на модели летальной инфекции грамотрицательными бактериями.
Впервые показана принципиальная возможность добиться регресса метастатической меланомы, вплоть до индукции длительной ремиссии, с помощью агонистов рецептора TLR9 — CpG-ОДН. Подтверждена безопасность применяемого агониста TLR9 — CpG-ОДН 7909. Впервые всесторонне изучены иммунологические эффекты, индуцируемые CpG-ОДН у пациентов с метастатической меланомой. Впервые показано, что CpG-ОДН при введении пациентам с меланомой вызывает продукцию ИФН I типа, активацию плазмацитоидных предендритных клеток (ппДК), повышение уровней циркулирующих ранних плазматических клеток, снижение уровней циркулирующих NK-клеток, а также — у части пациентов — повышение NK-активности. Впервые показано, что терапевтическая активность CpG-ОДН ассоциирована с повышением NK-активности, что позволяет рассматривать цепочку «CpG-ОДН — ппДК — цитокины (ИФН I типа) — NK-клетки» в качестве одного из основных механизмов противоопухолевого действия CpG-ОДН. Впервые охарактеризованы изменения в лимфатических узлах (ЛУ), дренирующих места подкожного введения CpG-ОДН, показана роль ЛУ в механизмах действия CpG-ОДН. Впервые выдвинуто предположение о том, что Treg-клетки блокируют некоторые иммуномодулирующие эффекты CpG-ОДН, что позволяет рассматривать деплецию Treg-клеток как способ повышения терапевтической активности CpG-ОДН.
Впервые показана принципиальная возможность дистанционно управлять клеточным составом регионарных лимфатических узлов (ЛУ) путем трансгенной экспрессии хемокинов в эпидермисе. Впервые получены плазмидные конструкции, позволяющие экспрессировать в эукариотических клетках хемокин CCL21 и маркерный белок EGFP (как раздельно, так и в виде гибридного белка), что позволяет отслеживать трансфицированные
клетки и оценивать внутриклеточное распределение трансгенного CCL21. Показано, что внутрикожное введение этих конструкций с помощью технологии генного ружья позволяет добиться высокой экспрессии хемокина CCL21 в эпидермисе, которая длится несколько суток. Впервые показано, что трансгенный CCL21, экспрессируемый в эпидермисе, доставляется с током лимфы в регионарные ЛУ и накапливается в них в высокой, физиологически значимой концентрации. Впервые показано, что трансгенный CCL21, транспортирующийся в ЛУ, влияет на клеточный состав ЛУ, в частности, усиливает накопление в этих ЛУ зрелых ДК и наивных Т-клеток. Кроме того, впервые обнаружена способность CCL21 усиливать макропиноцитоз и экспрессию CD40 на ДК.
Теоретическая и практическая значимость
Теоретическая значимость работы состоит в обнаружении новых свойств и механизмов действия иммуномодуляторов бактериального происхождения. Во-первых, обнаружены новые аспекты влияния мурамилпептидов на врожденный и адаптивный иммунитет: уточнены механизмы распознавания мурамилпептидов грамотрицательных бактерий клетками врожденной иммунной системы человека; описаны особенности экспрессии и секреции провоспалительных цитокинов клетками врожденной иммунной системы человека при воздействии мурамилпептидов; описана способность мурамилпептидов грамотрицательных бактерий усиливать резистентность к грамположительным бактериям; обнаружена иммуногенность более сложных по структуре мурамилпептидов грамотрицательных бактерий, таких как диГМтетра, которая проявляется при иммунизации высокими дозами этих соединений; продемонстрированы защитные свойства AT против таких мурамилпептидов. В целом, эти результаты расширяют понимание механизмов действия мурамилпептидных иммуномодуляторов. Во-вторых, показана принципиальная возможность добиться регресса меланомы с помощью активатора врожденного иммунитета — CpG-ОДН. В-третьих, показана эффективность генотерапевтического подхода к иммуномодуляции с использованием бактериальных векторов.
Основной практический результат — создание нового иммуномодулятора «Полимурамил», представляющего собой комплекс мурамилпептидов грамотрицательных бактерий. По результатам клинических испытаний, «Полимурамил» рекомендуется к применению в сочетании со стандартной терапией гнойных хирургических инфекций и гнойных инфекций кожи. Препарат улучшает общие результаты лечения, ускоряет разрешение воспаления, заживление раневых дефектов. Субстанция «Полимурамил» включена в Государственный реестр
лекарственных средств РФ под № ФС-000557, лекарственный препарат «Полимурамил» — под № ЛП-002069.
Результаты работы позволяют рассматривать вопрос о повышении разовой и курсовой дозы «Полимурамила», а также о расширении показаний к применению препарата. Кроме того, полученные в работе новые теоретические данные о свойствах мурамилпептидов могут быть использованы для создания семейства препаратов, являющихся как «чистыми» иммуномодуляторами (ГМтри, ГМтетра и их возможные аналоги), так и антибактериальными вакцинами широкого спектра действия (диГМтетра).
Уровни CCL4 (MIP-lp), CCL2 (МСР-1), ИЛ-6 и С-реактивного белка в сыворотке являются биологическими маркерами ответа врожденной иммунной системы на мурамилпептиды грамотрицательных бактерий. Эти показатели могут использоваться для лабораторного мониторинга иммунного ответа при клинических испытаниях мурамилпептидных препаратов.
Подтверждено, что мурамилпептиды не индуцируют секрецию ТЫ- и Тп17-инструктивных цитокинов антигенпредставляющими клетками, что следует учитывать при использовании мурамилпептидов в качестве иммунологических адъювантов в вакцинах.
Показано, что CpG-ОДН в качестве монопрепаратов обладают объективной противоопухолевой активностью у части пациентов с метастатической меланомой, что дает основание для клинического применения этого класса препаратов. Полученные данные могут быть использованы в качестве отправной точки при оптимизации режима введения CpG-ОДН, а также при разработке способов применения CpG-ОДН при других злокачественных опухолях. Результаты работы показывают, что применение CpG-ОДН, вероятно, необходимо сочетать с деплецией Treg-клеток, с тем чтобы повысить активирующее влияние CpG-ОДН на адаптивный иммунный ответ. В работе идентифицированы показатели иммунной системы, которые могут быть использованы для предварительного отбора пациентов, у которых терапия CpG-ОДН будет наиболее эффективна.
Идентифицированы биологические маркеры активации иммунной системы под действием CpG-ОДН: 1) активность 2'5'-олигоаденилатсинтазы в сыворотке; 2) уровень ранних плазматических клеток (CD19+CD38 lg) в крови. Эти показатели могут использоваться для иммуномониторинга при последующих клинических испытаниях CpG-ОДН. Динамика NK-активности мононуклеарных клеток крови, нормализованная на процентное содержание NK-клеток, может быть использована как лабораторный показатель при оценке клинической эффективности CpG-ОДН в ходе терапии.
Технология дистанционного управления клеточным составом ЛУ с помощью трансгенной экспрессии хемокинов в эпидермисе может
применяться в эксперименте для регулирования миграции различных клеток иммунной системы. Полученные данные позволяют разрабатывать эту технологию в практических целях в качестве средства, повышающего эффективность профилактической и лечебной вакцинации. Обработка дендритных клеток хемокином CCL21 может использоваться для усиления поглощения антигенов при приготовлении дендритно-клеточных вакцин.
Положения, выносимые на защиту
-
Мурамилпептиды грамотрицательных бактерий индуцируют комплекс защитных реакций врожденного иммунитета, приводящий к повышению резистентности против бактериальных инфекций.
-
Лекарственный препарат, представляющий собой комплекс мурамилпептидов грамотрицательных бактерий, обладает объективной иммунологической и клинической эффективностью у человека.
-
CpG-ОДН обладают объективной иммунологической и клинической эффективностью у пациентов с метастатической меланомой. Механизм противоопухолевого действия CpG-ОДН при меланоме связан с повышением NK-активности в процессе лечения.
-
Временная трансгенная экспрессия хемокина CCL21 в эпидермисе является инструментом, позволяющим регулировать численность дендритных клеток и Т-клеток в регионарных ЛУ.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на
ежегодной конференции Американского Общества клинической онкологии
(2004); 65-й, 66-й ежегодных конференциях по исследованиям в
дерматологии (2004, 2005); 31-й, 32-й, 34-й, 38-й ежегодных конференциях
Комитета по дерматологическим исследованиям (2004, 2005, 2007, 2011); 35-
й и 36-й ежегодных конференциях Европейского общества
дерматологических исследований (2005, 2006); Международной конференции по исследованиям в дерматологии (2008, Эдинбург); XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (2011, Казань); XIX и XX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (2012, 2013, Москва); объединенном иммунологическом форуме (2013, Нижний Новгород).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 34 печатных работы, из них 20 статей в 11 научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций («Иммунология», «Российский аллергологический журнал», «Российский
иммунологический журнал», «Медицинская иммунология», «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии», «Цитокины и воспаление», «Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова», Journal of Clinical Oncology, Journal of Investigative Dermatology, Brain Pathology, International Immunopharmacology), 1 патент, 2 статьи в научных журналах, 1 методическое пособие, 10 публикаций в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 52 рисунка. Диссертация включает следующие разделы: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты собственных исследований, Обсуждение, Выводы, Список литературы. Библиография включает 406 источников, в том числе 25 отечественных и 381 зарубежный.
Бактериальные иммуномодуляторы как аналоги ПАМП
В отличие от адаптивной иммунной системы, где чужеродные молекулы распознаются всего двумя типами рецепторов из суперсемейства иммуноглобулинов, ПРР представлены белками различных семейств. Как правило, в молекуле ПРР присутствует один или несколько консервативных доменов. Разнообразие ПРР создается как структурными вариациями в пределах одного домена, так и различными сочетаниями доменов [22, 284]. Наиболее значимым лиганд-распознающим доменом во врожденной иммунной системе млекопитающих является LRR-домен (англ. leucine-rich repeat domain), наиболее значимыми сигнальными доменами — TIR-домен (англ. Toll and interleukin-1 receptor domain) и CARD-домен (caspase activation and recruitment domain) [284]. Структурная классификация ПРР приведена в таблице 2.
Разнообразие доменной структуры ПРР влечет за собой разнообразие их локализации (таблицы 1, 2). ПРР располагаются на поверхностной мембране (некоторые TLR и CLR, интегрины, скавенджер-рецепторы); на мембранах эндосом (TLR3, -7, -8, -9); в цитозоле (большинство рецепторов семейства NLR и RLR, DAI, DHX9, DHX36); в митохондриях (NLRX1 из семейства NLR); во внеклеточных средах (пентраксины, коллектины, фиколины, ЛПС-связывающий белок) [22, 157, 159]. Благодаря этому врожденная иммунная система осуществляет прямой надзор за большинством компартментов клетки и организма.
По функциональному принципу ПРР условно делят на четыре группы: Группа 1: Рецепторы, индуцирующие экспрессию защитных генов К этой группе относятся рецепторы семейств TLR, NLR, RLR, а также DAI, AIM2, DHX9 и DHX36, некоторые CLR (дентин-1). Эти рецепторы являются триггерами основных защитных реакций врожденной иммунной системы. Активационный сигнал от ПРР передается внутрь клетки по цепочке, которую в упрощенном виде можно представить как «рецептор — адаптер — киназа — фактор транскрипции — целевые гены». Каждое семейство ПРР характеризуется «своим» набором адаптеров. Так, семейство TLR использует адаптеры MyD88 и TRIF, а также вспомогательные адаптеры TIRAP и TRAM [150, 158, 252, 401]; цитозольные рецепторы, распознающие нуклеиновые кислоты (RLR и DAI), используют адаптер IPS-1 [188, 350]. В основном именно адаптеры определяют набор биологических эффектов, получаемых при активации данного типа ПРР. Так, поверхностные TLR (TLR1, -2, -4, -5, -6 и -10) через адаптер MyD88 активируют факторы транскрипции NF-кВ и IRF5, что ведет к индукции экспрессии провоспалительных цитокинов и ряда других воспалительных и антимикробных факторов, в том числе NO-синтазы, дефензинов и т.д. [ПО, 351]. Эндосомальный рецептор TLR3, а также TLR4 после его интернализации в эндосомы, через адаптер TRIF активируют факторы транскрипции IRF3 и NF-кВ, что приводит к синтезу IFN-р и провоспалительных цитокинов [150, 179]. Эндосомальные рецепторы TLR7 и TLR9 через адаптер MyD88 активируют фактор транскрипции IRF7, который индуцирует массивную продукцию интерферона-а (IFN-а) и других IFN I типа; как будет показано ниже, этот сигнальный путь функционирует только в ппДК [155, 303]. RLR и DAI реализуют свое действие через адаптер IPS-1, что тоже приводит к активации фактора транскрипции IRF3 и продукции 1FN I типа [188, 350]. Цитозольные NLR (NODI, NOD2) взаимодействуют со «своей» киназой (RIP2) без участия адаптеров, что ведет к активации NF-кВ И экспрессии провоспалительных и антимикробных факторов [220, 287]. Различные семейства ПРР активируют каскад митоген-активируемых протеинкиназ (МАПК), которые, в свою очередь, активируют факторы транскрипции группы АР-1, а также оказывают регулирующее влияние на другие сигнальные пути [98].
Эти рецепторы необходимы для процессинга и секреции цитокинов семейства IL-1 [323]. В эту группу входят некоторые рецепторы семейства NLR (NLRP1, NLRP3, NLRC4), а также AIM2. Все они используют адаптер ASC [242]. Активация рецепторов этой группы приводит к сборке инфламмасом — мультимолекулярных комплексов, где происходит превращение неактивной прокаспазы-1 в активную каспазу-1 (IL-1-конвертазу). Последняя расщепляет про-IL-ip и npo-IL-18 до зрелых IL-lfS и IL-18, что является необходимым условием секреции этих цитокинов. Расщепление npo-IL-la может осуществляться как инфламмасомой, так и Са-зависимым ферментом кальпаином [128]. Еще одним эффектом инфламмасомы является индукция апоптоза клетки как крайнего средства, направленного на сдерживание инфекции [242]. Группа 3: Рецепторы, опосредующие фаго- и эндоцитоз
К этой группе относятся мембранные CLR, скавенджер-рецепторы, а также рецепторы комплемента (интегрины). Сходную функцию выполняют и Fc-рецепторы, участвующие в фагоцитозе мишеней, опсонизированных антителами. Рецепторы этой группы могут модулировать активацию клеток врожденной иммунной системы, вызванную рецепторами группы 1.
К этой группе относятся белки острой фазы (коллектины, пентраксины, фиколины, ЛПС-связывающий белок), а также естественные IgM-антитела [101]. Биологическая роль представителей этой группы состоит в опсонизации корпускулярных мишеней, несущих ПАМП, в доставке растворимых ПАМП к мембранным ПРР, либо в активации комплемента. Гуморальные ПРР расширяют спектр микробных лигандов, которые могут быть распознаны мембранными ПРР.
Основная эффекторная реакция врожденного иммунитета — воспаление. В его развитии ключевую роль играют цитокины, вырабатываемые клетками врожденной иммунной системы. В частности, цитокины семейства IL-1, IFN I типа и фактор некроза опухолей (TNF) могут действовать аутокринно/паракринно и амплифицировать активацию клеток врожденной иммунной системы, индуцированную через ПРР [53]. Среди других эффекторных реакций следует упомянуть пирогенную реакцию, фагоцитоз, киллинг микроорганизмов путем секреции антимикробных пептидов и белков, создание противовирусного состояния клеток путем локальной и системной продукции IFN I типа, аутофагию, киллинг инфицированных и перерожденных клеток NK-клетками, регуляцию восстановления тканей после воспаления/инфекции [250]. Еще одной функцией врожденной иммунной системы является индукция адаптивного иммунного ответа. Эту функцию выполняют ДК, которые, являясь частью врожденной иммунной системы, специализируются на представлении АГ Т-клеткам [47]. В связи с этим многие ПАМП являются эффективными иммунологическими аъювантами.
Каждый тип патогенов, обладая определенным набором ПАМП, способен активировать только некоторые ПРР и, соответственно, только некоторые сигнальные пути и эффекторные механизмы. Так, активаторы инфламмасомы индуцируют пирогенную реакцию; рецепторы, распознающие вирусные нуклеиновые кислоты, индуцируют выработку IFN I типа, и т.д. Активацией определенного сочетания рецепторов, сигнальных путей и эффекторных механизмов обусловлена относительная специфичность ответа врожденной иммунной системы на тот или иной тип микроорганизмов [364]. Ответ врожденной иммунной системы развивается быстрее, чем адаптивный иммунный ответ, так как связан меньшим количеством регуляторных ограничений и не требует клональной экспансии редких клеток-предшественников. Полагают, что врожденный иммунитет во многих случаях элиминирует патогены без участия более медленно реагирующей адаптивной иммунной системы [250].
Влияние мурамилпептидов грамотрицательных бактерий на МФ и ДК человека in vitro
МФ и незрелые миелоидные ДК получали по общепринятой методике из моноцитов крови [317]. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из крови или лейкомассы здоровых доноров на градиенте плотности фиколл-урографина (Панэко, Россия). Моноциты выделяли из суспензий МНК путем адгезии к пластику в среде RPMI-1640 с добавлением 1% пуловой человеческой сыворотки IV группы (все РАА, Австрия). Для получения ДК моноциты культивировали 6 суток в среде RPMl-1640 с добавлением 2 мМ L-глютамина (Sigma, США), 10% фетальной телячьей сыворотки (РАА), 80 нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и 50 нг/мл интерлейкина-4 (IL-4) (оба цитокина — Invitrogen, Великобритания). На 3-й сутки из культур отбирали половину среды и замещали равным объемом свежей культуральной среды, содержащей удвоенные концентрации GM-CSF и IL-4. На 6-й день собирали незрелые ДК — плавающие или слабо прилипающие клетки [290].
МФ получали так же, как ДК, но в среду не добавляли IL-4. На 3-й сутки культуральную среду удаляли полностью, заменяли ее равным объемом свежей среды с GM-CSF. На 6-й день культуры МФ отделяли от пластика путем трипсинизации [290]. При иммунофенотипировании поверхностный фенотип ДК был CD 1 etCD 11 c+CD 14 CD80dimCD83XD86dimCD206TiLA-DR+, поверхностный фенотип МФ — CDla CDllc+CD14+CD80dimCD83"CD86dimCD206+HLA-DR+. Контаминация лимфоцитами составила 5% для культур ДК, 1% для культур МФ.
При исследовании секреции цитокинов клетки отмывали, ресуспендировали в полной культуральной среде (RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глютамина и 10% фетальной телячьей сыворотки), помещали в 96-луночные плоскодонные планшеты (Nunc, Дания) в количестве 8x104 клеток на лунку и культивировали в течение необходимого времени либо без стимуляторов (отрицательный контроль), либо в присутствии мурамилпептидов и их производных [16]. В качестве положительного контроля использовали ЛПС Е. coli ОП1:В4 (Sigma). Супернатанты замораживали при -70С. В некоторых опытах стимуляцию проводили в присутствии IL-ip (Invitrogen) [7]. При ингибиторном анализе эффект каждого ингибитора оценивали на культурах МФ, полученных минимум от 6 различных здоровых доноров. Коктейль ингибиторов протеаз (КИП) широкого спектра действия с активностью против сериновых, цистеиновых, аспартат- и аминопептидаз, был куплен у Sigma (каталожный номер Р8340). Генистеин, дайнасор, BAY11-7082 и VX-745 были закуплены у Merck (Дармштадт, Германия), SB203580 — у Sigma. Антагонист паннексина-1 panxl, представляющий собой пептид с последовательностью WRQAAFVDSY [244], был синтезирован в Институте биоорганической химии им. Овчинникова и Шемякина (Москва).
Методика ингибиторного анализа описана в [8]. МФ приводили к концентрации 4x105 клеток/мл в полной культуральной среде. По 100 мкл этой суспензии (4х104 клеток) вносили в лунки 96-луночных плоскодонных планшетов. Давали клеткам прикрепиться к пластику (4—6 ч при 37С), после чего среду полностью удаляли и вносили 200 мкл свежей среды, содержащей ингибиторы в требуемых концентрациях. Планшеты инкубировали 15 мин. при 37С, после чего добавляли ГМтри или диГМтетра до конечной концентрации 10 мкг/мл, либо ЛПС до конечной концентрации 0,1 мкг/мл, либо равный объем культуральной среды (отрицательный контроль). Клетки культивировали 24 ч, после чего собирали супернатанты. Токсичность ингибиторов оценивали перед сбором супернатантов путем визуальной инспекции культур в инвертированном микроскопе. Данную концентрацию ингибитора считали токсичной при видимых изменениях адгезивных свойств, формы, гранулярности или численности клеток.
При исследовании кинетики экспрессии мРНК МФ и незрелые ДК получали, как описано выше. На 7-е сутки клетки стимулировали ГМтри (10 мкг/мл) или ЛПС (100 нг/мл). Спустя указанное время собирали супернатант, а клетки лизировали в TRI Reagent (Sigma) для выделения РНК. В экспериментах с актиномицином D (ActD) клетки стимулировали ГМтри или ЛПС в течение 1 ч, после чего добавляли ActD (Sigma) до конечной концентрации 10 мкг/мл для остановки синтеза мРНК. Клетки собирали для анализа уровней мРНК перед добавлением ActD, а также через 1 и 3 ч после добавления [7]. 2.1.бТрансфекция siRNA и стимуляция трансфицированных МФ
Все методики описаны в [15]. Требуемое количество МФ вносили в лунки 24-луночных планшетов на 500 мкл полной культуральной среды. Давали клеткам прикрепиться к пластику, после чего удаляли среду и вносили по 500 мкл свежей среды. siRNA вводили в МФ с помощью липосомного реагента Липофектамин 2000 (Л2000; Invitrogen). Липосомы готовили путем смешивания нужных количеств Л2000 и siRNA в бессывороточной среде с последующей 20-минутной инкубацией при комнатной температуре, после чего добавляли к МФ.
В опытах с трансфекцией флюорохром-меченной siRNA (FAM-si) клетки культивировали с липосомами 6 или 15 ч, после чего анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (BD Bioscience, США). Эффективность трансфекции оценивали по средней интенсивности флюоресценции (СИФ) в канале FL-1.
В остальных опытах период трансфекции составлял 15 ч. По его окончании среду с липосомами замещали на свежую среду, содержащую 20 нг/мл GM-CSF. Для определения экспрессии мРНК NODI, NOD2 и TLR2 клетки лизировали в TRI Reagent (Sigma) через 48 ч после начала трансфекции. Для определения поверхностной экспрессии TLR2 клетки трипсинизировали в различные сроки после начала трансфекции, окрашивали моноклональными антителами (МАТ) к TLR2, меченными фикоэритрином (РЕ) (eBioscience, США) и анализировали на проточном цитометре FACSCalibur.
Ответ МФ на стимуляцию ГМтри, диГМтетра и ГМДП оценивали через 60 ч после начала трансфекции. ГМтри и диГМтетра использовали в конечной концентрации 10 мкг/мл, ГМДП — 1 мкг/мл [290]. В контрольные лунки стимуляторы не добавляли. Через 12 ч после начала стимуляции собирали супернатант.
Методики описаны в [6]. МФ культивировали с индукторами толерантности в указанных концентрациях и сочетаниях в течение 24 ч. В контрольные лунки индукторы толерантности не добавляли («нетолеризованные» МФ). Через 24 ч удаляли супернатант, каждую лунку дважды промывали 300 мкл теплой среды RPMI-1640 и заполняли 200 мкл свежей полной культуральной среды. Затем в лунки добавляли ЛПС, ГМтри или ГМДП в разрешающих концентрациях. В одну из лунок не вносили ни индукторы толерантности, ни разрешающие стимулы, с тем чтобы оценить спонтанную продукцию TNF. Супернатант для анализа уровней TNF собирали еще через 24 ч.
П/Ш фаза клинических испытаний
Также оценили кинетику уровней CCL4 в супернатантах. Она в целом повторяла кинетику TNF, с той разницей, что выход на максимальные уровни в МФ происходил несколько позже (рис. 14, ср. с рис. 12). Хотя максимальные уровни мРНК CCL4 в ГМтри- и ЛПС-стимулированных ДК существенно не различались (рис. 13), максимальные уровни CCL4, достигнутые в супернатантах ГМтри-стимулированных ДК, были на порядок ниже, чем в супернатантах ЛПС-стимулированных ДК (рис. 14). В супернатантах ГМтри- и ЛПС-стимулированных МФ достигались приблизительно одинаковые уровни CCL4 (рис. 14). Максимальные концентрации CCL4 в супернатантах МФ были сопоставимы с таковыми в супернатантах ЛПС-стимулированных ДК [7]. Таким образом, закономерности экспрессии, выявленные для TNF, применимы и к другим провоспалительными генам.
Для оптимальной трансляции ряда цитокинов, в том числе TNF, необходима активация МАПК р38 и ее мишеней, в частности киназы МК-2 [118, 384]. Например, в результате активации рецептора TLR4 индуцируется как NF-KB-зависимая транскрипция TNF, так и р38-зависимая трансляция, что в итоге приводит к интенсивной секреции TNF. Как упомянуто в Обзоре литературы, активация NOD2 в МФ с помощью МДП не приводит непосредственно к активации р38 [140]. Однако МДП, помимо NOD2, распознается еще рецептором NTRP3, что приводит к сборке инфламмасомы и секреции 1Г-1[3 макрофагами в первые минуты после активации. IL-ip затем связывается с IL-1R на тех же или соседних клетках, что приводит к активации р38 и усилению трансляции других провоспалительных цитокинов, включая TNF [140].
Мы предположили, что низкая эффективность трансляции TNF в ДК, стимулированных ГМтри, обусловлена неспособностью ДК вырабатывать IL-ip и активировать МАПК р38 при данном виде стимуляции. Действительно, ни ЛПС, ни ГМтри не вызывают выработку ІГ-1 р дендритными клетками, тогда как МФ все же вырабатывают некоторое количество этого цитокина в первые часы после начала стимуляции (рис. 15А). Кроме того, рекомбинантный ІГ-ір дозозависимо усиливает ГМтри-индуцированную продукцию TNF дендритными клетками до уровней, сопоставимых с ЛПС-индуцированными (рис. 15Б). Сам по себе IL-ip вызывает очень слабую выработку TNF (рис. 15Б). Таким образом, экзогенный IL-ір устраняет дефект выработки TNF, наблюдаемый в ГМтри-стимулированных ДК.
Рецепторы, ответственные за распознавание мономерных мурамилпептидов, таких как МДП, ГМДП, ГМтри, хорошо известны [123, 124, 254]; см. 1.4.2.2. Однако информация о распознавании димерных мурамилпептидов, в частности диГМтетра, в литературе практически отсутствует.
Для идентификации рецепторов, распознающих вещество X, применяют два подхода. Первый основан на использовании клеточных линий, которые в исходном состоянии не содержат рецепторов к данному веществу. В этих клетках с помощью трансгенных технологий экспрессируют предполагаемый рецептор Y в сочетании с репортерным геном, промотер которого зависит от данного рецептора [124, 254]. Экспрессия репортера в присутствии вещества X свидетельствует о том, что вещество действует через рецептор Y. Основной недостаток подхода заложен в его базовом принципе: в клетках, исходно не содержащих какой-либо рецептор, могут отсутствовать и фунционально значимые кофакторы и компоненты сигнальных путей, что может вести к недооценке или переоценке роли рецептора в распознавании данного вещества.
В работе был использован другой подход, основанный на ингибировании рецепторов, естественным образом экспрессируемых клетками врожденной иммунной системы [15]. Наиболее специфичными способами ингибирования являются блокировка с помощью антител и РНК-интерференция (RNAi). В случае цитозольных молекул, таких как NOD1 и NOD2, единственным приемлемым способом является RNAi. К недостаткам RNAi относится необходимость тщательного подбора условий и сроков, при которых происходит наибольшее подавление экспрессии данного рецептора. Работу проводили на МФ, поскольку они хорошо отвечают секрецией TNF на стимуляцию мурамилпептидами и поскольку они удобнее с технической точки зрения (прилипающие клетки).
На первом этапе отрабатывали условия введения siRNA в МФ с помощью реагента Липофектамин 2000 (Л2000). Для упрощения процедуры использовали FAM-si — контрольную siRNA, меченную FAM (6-карбокисифлюоресцеином); эффективность трансфекции оценивали с помощью проточной цитометрии. Оптимизировали следующие параметры: 1) количество клеток на лунку (0,5x10 , 105 или 2x105); 2) дозу siRNA на лунку (10, 20 или 40 пмоль); 3) дозу Л2000 на лунку (1 или 2 мкл); 4) время трансфекции (6 или 15 ч). В качестве отрицательного контроля использовали пустые липосомы (без FAM-si) и свободную FAM-si.
Накопление FAM-si в МФ происходило только в присутствии Л2000 (рис. 16А). Эффективность трансфекции МФ зависела от всех 4 вышеперечисленных параметров. При стандартных условиях, рекомендуемых производителем (20 пмоль siRNA, 1 мкл Л2000), клетки поглощали умеренное количество FAM-si (СИФ от 100 до 450 усл. ед. в зависимости от плотности клеток; рис. 16Б). Снижение дозы FAM-si вдвое, до 10 пмоль, приводило к примерно двукратному снижению СИФ. Однако повышение дозы FAM-si до 40 пмоль при неизменном количестве Л2000 (1 мкл) не сопровождалось повышением СИФ, что указывает на лимитирующую роль дозы Л2000 в доставке FAM-si в клетку. Если количество Л2000 повышали до 2 мкл на лунку при сохранении дозы FAM-si в 20 пмоль, то СИФ возрастала примерно в 1,5 раза; если же одновременно удваивали и дозу Л2000, и дозу FAM-si (до 40 пмоль), то СИФ возрастала примерно в 4 раза по сравнению со стандартными условиями (рис. 16Б). Дозы Л2000 выше 2 мкл на лунку были токсичны (выраженная зернистость цитоплазмы после 15-часовой инкубации).
Как видно на рис. 16Б, удвоение количества клеток на лунку приводило к примерно двукратному снижению средней интенсивности флюоресценции FAM-si в МФ при тех же количествах FAM-si и Липофектамина 2000. Кроме того, эффективность трансфекции при 6-часовом режиме была приблизительно в 2—3 раза ниже, чем при 15-часовом (рис. 16В). При микроскопии флюоресцентная метка выявлялась в виде включений в цитоплазме (вероятно, в эндосомах), а также диффузно в цитозоле.
Внутрикожное введение плазмид, кодирующих mCCL21, вызывает миграцию ДК и различных субпопуляций Т-клеток в дренирующие ЛУ
Было исследовано также большое количество фенотипических и функциональных параметров Т-клеток: 1) процентное и абсолютное содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток в крови, соотношение CD4/CD8; 2) процентное содержание наивных клеток, центральных клеток памяти, эффекторных клеток памяти и эффекторов в CD4+ и CD8+ популяциях; 3) процентное содержание активированных (CD40L+) клеток в CD4+ и CD8+ популяциях; 4) процентное содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток, продуцирующих IFN-гамма, IL-4 и IL-10 при поликлональной стимуляции (форбол-12-миристат-13-ацетат + иономицин); 5) процентное содержание CD4+CD25h,gh Treg-клеток; 6) пролиферативный ответ Т-клеток при поликлональной стимуляции антителами к CD3 и CD28. Ни один из этих параметров достоверно не менялся в ходе лечения (таблица 21).
Измерение частоты АГ-специфичных CD8+ Т-клеток до и во время лечения с помощью IFN-y ELISPOT [62]. Подробности — см. Материалы и методы (2.3.5.4). Показаны результаты для трех репрезентативных больных из 8 исследованных (М триплетов ± о; р 0,05 при сравнении с контролем-2).
Чтобы оценить частоту CD8+ Т-клеток, специфичных к опухолевым и контрольным (вирусным) АГ, использовали IFN-y ELISPOT. МНК в достаточном для этих опытов количестве имелись от 8 пациентов (1 с ЧР, 3 с СЗ, 4 с ПЗ) Частота АГ-специфичных CD8+ Т-клеток у исследованных пациентов не претерпевала какой-либо динамики, независимо от характера клинического ответа (рис. 37).
У 3 пациентов (по одному с ЧР, СЗ и ПЗ) оценивали также содержание цитолитических CD8+ Т-клеток, направленных против аутологичных опухолевых линий (см. Материалы и Методы, 2.3.5.6). Содержание таких клеток в CD8+ Т-субпопуляции было низким ( 1%) и не менялось в процессе лечения (данные не показаны).
Динамика пролиферации CD4 Т-клеток in vitro. Влияние Treg-клеток Отсутствие изменений со стороны Т-клеточного звена могло быть, с одной стороны, обусловлено тем, что каких-либо специфических АГ пациентам не вводили. С другой стороны, известно, что CD4+CD25hlgh Treg-клетки могут подавлять пролиферацию «обычных» Т-клеток [173], а также ингибировать Т-клеточный ответ против опухоли [316]. Более того, в одном из исследований сообщалось, что ппДК, активированные CpG-ОДН В-типа, могут индуцировать дифференцировку наивных CD4+ Т-клеток в Treg-клетки in vitro [260]. Поэтому у пациентов исследовали процентное содержание Treg-клеток, определяемых как клетки с фенотипом CD3+CD4+CD25high [39]. Было установлено, что этот показатель в ходе лечения не меняется (таблица 21).
С другой стороны, цитокины, вырабатываемые активированными ДК, в частности IL-6, делают «обычные» Т-клетки временно рефрактерными к ингибирующему влиянию со стороны Treg-клеток [288]. Рефрактерность длится несколько часов и является одним из условий индукции нормального Т-клеточного ответа [288]. Чтобы изучить, могло ли данное явление иметь место у пациентов, получавших CpG-ОДН 7909, были поставлены следующие опыты (рис. 38А). Из образцов МНК, полученных до и после лечения (на 8-й неделе), с помощью негативной иммуномагнитной селекции выделяли популяцию CD4+ Т-клеток. Затем из нее удаляли CD25 lg Treg-клетки, используя суперпарамагнитные частицы, конъюгированные с МАТ к CD25. Эффективность этой процедуры продемонстрирована на рис. 38Б: видно, что в конечной популяции CD25 клетки практически отсутствуют, тогда как CD25 1Ш суб популяция (активированные «обычные» CD4 Т-клетки) сохранена. Затем анализировали пролиферативный ответ нефракционированных CD4+ Т-клеток и Treg-обедненных CD4+ Т-клеток при стимуляции МАТ к CD3. Костимулирующие МАТ к CD28 не использовали, поскольку они отменяют ингибирующее влияние Treg-клеток на «обычные» CD4+ Т-клетки [39]. Достаточное для этих опытов количество МНК было получено от 8 пациентов. Влияние CpG-ОДН 7909 на пролиферацию CD4+ Т-клеток в присутствии Treg-клеток и после их деплеции. А — схема опытов. Б — пример деплеции CD25h,g Treg-клеток из популяции CD4+ Т-клеток (проточная цитометрия). Указано процентное содержание CD25low (цифра слева) и CD25hlgh (цифра справа) клеток среди CD4+ Т-клеток до и после деплеции. В — aHTH-CD3 -индуцированная пролиферация всех (нефракционированных) CD4+ Т-клеток и Treg-обедненных CD4+ Т-клеток до лечения (н. 0) и на 8-й неделе (н. 8) у 8 пациентов.
Как видно на рис. 38В, пролиферативный ответ нефракционированных CD4+ Т-клеток при стимуляции МАТ к CD3 был невысок и в ходе лечения менялся мало. Напротив, ответ Treg-обедненных CD4+ Т-клеток возрастал, причем в некоторых случаях очень значительно (р = 0,008 при сравнении пролиферации Treg-обедненных клеток на 0-й и 8-й неделе; п = 8). Особенно значительный прирост наблюдался у пациентов 200-001, 201-004, 200-002. Очевидной связи между динамикой пролиферации Treg-обедненных CD4+ Т-клеток и клинической эффективностью CpG-ОДН 7909 выявлено не было. Функциональные свойства самих Treg-клеток не исследовали вследствие их недостаточного количества. Обсуждение этих результатов — см. 7.2.3.6.
Поскольку терапия CpG-ОДН была эффективна у меньшей части пациентов, то был проведен поиск лабораторных предикторов эффективности CpG-ОДН. Для этого сравнивали исходные значения всех исследованных показателей у респондеров (ПР, ЧР, СЗ) и у пациентов с ПЗ. При таком ретроспективном анализе обнаружились достоверные различия для четырех показателей (таблица 22).
У пациентов, ответивших на терапию CpG-ОДН 7909, до лечения отмечалось: 1) более высокое процентное содержание CD80+ В-клеток (активированных В-клеток); 2) более высокое процентное содержание CD8+ центральных Т-клеток памяти с фенотипом CCR7+CD45RA (и наоборот, тенденция к более низкому содержанию CD8+ эффекторных Т-клеток с фенотипом CCR7 CD45RA+); 3) более высокое процентное содержание активированных CD8+ Т-клеток, экспрессирующих CD40L; 4) более высокое процентное (но не абсолютное) содержание CD56+CD16+ NK-клеток среди МНК. Эти различия сохранялись на 8-й неделе терапии, хотя 3 из них утрачивали статистическую достоверность. Возможная значимость этих различий рассматривается в Обсуждении (7.2.4), однако следует интерпретировать их с осторожностью в связи с малым размером групп.
