Содержание к диссертации
ОГЛАВЛЕНИЕ. 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. 6
ВВЕДЕНИЕ. 10
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 21
1.1. Система интерферона. 21
1.1.1. Система интерферона в норме и при патологии. 21
1.1.2. Индукторы интерферона как антивирусные препараты этиотропного действия. 26
1.1.3. Регуляция продукции и действия интерферона. 43
1.1.4. Участие интерферонов и других цитокинов в регуляции иммунитета и ЦНС. 48
1.1.5. Чувствительность и резистентность к интерферону. 55
1.2. Цитокины. 58
1.2.1. Общая характеристика цитокинов. 58
1.2.2. Провоспалительные цитокины. 71
1.2.3. Противовоспалительные цитокины, 77
1.2.4. Рецепторы цитокинов. 79
1.2.5. Роль цитокинов в иммунном ответе. 80
1.2.6. Нарушения продукции цитокинов. 86
1.3. Им мун о модулирующие препараты, как регуляторы функций интерферонов и других цитокинов. 96
1.3.1, Клиническое применение интерферонов и других цитокинов. 96
1.3.2. Методы оценки состояния иммунитета. 105
Резюме. 111
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 113
2.1. Материалы. 113
2.1.1. Вирусы. 113
2.1.2. Клеточные культуры и ростовые среды. 113
2.1.3.Химиотераиевтические препараты и химические соединения. 117
2.2. Методы. 120
2.2.1. Определение иммунного статуса. 120
2.2.2. Определение ИФН статуса и чувствительности к препаратам. 122
2.2.3. Определение активности ИФН. 125
2.2.4. Определение ИФН-ингибирующей (ИИС) или ИФН- стимулирующей (ИСС) способности плазмы крови. 126
2.2.5. Определение мРНК цитокинов методом ОТ-ПЦР. 126
2.2.6. Определение количественного содержания цитокинов методом ИФА. 127
2.2.7. Статистическая обработка результатов исследования. 127
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. 128
3.1. Клеточная чувствительность и резистентность к интерферонам. 128
3.1.1. Клеточная чувствительность к интерферонам (расширение показателей ИФН статуса). 128
3.1.2. Прогнозирование эффективности интерферонотерапии при различных формах патологии. 134
3.1.3. Расширенный интерфероновый статус при рассеянном склерозе. 140
3.1.4. Праймирующее действие медицинских препаратов интерферона на клетки крови больных рассеянным склерозом in vitro. 146
Резюме. 153
3.2. Ранние цитокиновыс реакции in vitro. 154
Резюме. 162
3.3. Способы системного анализа и коррекции нарушений ИФН и цитокинового статусов. 162
3.3.1. Интерфероновый статус и цитокиновый профиль в норме. 162
3.3.2. Влияние препаратов на изменение интерферонового и цитокинового статуса относительно здоровых добровольцев. 166
Резюме. 171
3.4. Иммунный и ИФН статус у больных с серорезистентностью после лечения сифилиса. 171
3.4.1. Особенности иммунного статуса у больных с СР после лечения сифилиса. 171
3.4.2. Изменения показателей иммунного статуса у больных с СР при лечении цефтриаксоном и препаратом гепон. 174
3.4.3. Изменения показателей иммунного статуса у больных с СР при лечении препаратом гепон. 177
3.4.4. Сравнительная характеристика изменений показателей иммунного статуса у больных с СР после лечения сифилиса в зависимости от эффективности терапии. 179
3.4.5. Оценка интерферонового статуса у больных с СР после лечения сифилиса. 183
Резюме. 188
3.5. Интерфероны и цитокины при остром и хроническом вирусном гепатите С. 188
3.5.1, Интерфероновый статус и иммунокоррекция у наркоманов с острым вирусным гепатитом С. 188
3.5.2. Интерфероны и цитокины при остром вирусном гепатите С. 192
3.5.3. Цитокиновый профиль и интерфероновый статус при хроническом вирусном гепатите С. 200
3.5.4, Изменение цитокинового профиля и интерферонового статуса у больных хроническим вирусным гепатитом С с генотипами вируса 1Ъ и За при терапии. 204
Резюме. 210
3.6. Особенности продукции интерферонов и цитокинов при генитальном герпесе.
Резюме. 220
3.7. Исследование интерфероиового статуса и цитокинового профиля у онкологических больных. 220
3.7.1. Состояние системы иммунитета и интерферона при меланоме кожи. 220
3.7.2. Интерфероновый и цитокиновый статус при раке молочной железы. 224 Резюме. 232
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. 233
- Клеточная ИФН-чувствительность как новое направление оценки системы ИФН в различных группах людей в норме и при патологии. 233
- Системный анализ интерфероиового и цитокинового статусов, как инструмент для коррекции патологических состояний. 240
ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 251
ВЫВОДЫ. 256
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ. 258
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 259
Приложение 1.
Приложение 2.
Введение к работе
Актуальность темы.
Происходящие климатические изменения, возрастание числа катастрофических событий на планете (землетрясения, цунами, ураганы), ускоренное развитие информационных технологий (компьютеризация, мобильная связь, телевидение), агрессивность средств массовой информации приводят к резкому ухудшению экологии человека и развитию стресс-зависимых заболеваний. В результате отмечается снижение сопротивляемости организма, ослабление иммунной системы, приводящее к развитию различных патологических изменений в организме [61]. В последние 20 лет иммунологи отмечают неуклонное снижение показателей нормы иммунной системы здоровых людей [82]. Параллельно наблюдается интенсивный рост числа вирусных и бактериальных инфекций, не поддающихся общепринятой терапии, появление новых неконтролируемых инфекций (SARS, птичий грипп), грозящих пандемиями. Резко увеличилось число больных страдающих аллергическими и аутоиммунными заболеваниями, новообразованиями, формируется популяция людей с вторичными иммунодефицитами, вызванными как хроническими инфекциями, так и рядом других техногенных факторов. В целом в России регистрируется не только сокращение населения, но и резкое ухудшение здоровья россиян. Если еще 20 лет назад группа здоровых составляла 30% населения, то теперь она составляет не более 15%. Отмечено, что в первую очередь страдают тонкие регуляториые механизмы основных систем жизнедеятельности: системы иммунитета и системы интерферона (ИФН) и других цитокинов, включая механизмы естественной резистентности. Такие данные обусловливают актуальность углубленного исследования этих систем и поиска объективных методов их коррекции.
Современная практика защиты населения от инфекционных заболеваний включает 2 основных подхода: специфическая профилактика, связанная с использованием вакцин, и неспецифическая профилактика, направленная на включение механизмов врожденного иммунитета для повышения резистентности организма. Следует особо подчеркнуть, что в системе естественной защиты, особенно при вирусных инфекциях, ключевая роль принадлежит ИФН и цитокинам [16, 18, 23, 43, 81].
К сожалению, несмотря на достаточно большой набор препаратов для терапии различных заболеваний, проблема лечения многих из них, таких как вирусные гепатиты, генитальный герпес, новообразования, остается трудно разрешимой задачей. Поэтому крайнюю важность приобретает изучение механизмов действия новых лечебных препаратов. Необходимо также проводить исследование специфической активности лечебных средств и продукции цитокинов под действием исследуемых препаратов in vitro на различных клеточных моделях для предварительной оценки их эффективности с возможной экстраполяцией полученных результатов на организм человека, что позволит с высокой степенью достоверности прогнозировать лечебный эффект лекарств.
До настоящего времени практически не проводились комплексные исследования, охватывающие все многообразие взаимосвязей системы ИФН и цитокинов с иммунной системой в обычных условиях и при различных патологических процессах.
Представляется важным не только индивидуальный подход при обследовании больных, но и при выборе средств для профилактики и терапии заболеваний. Для решения этой задачи необходим комплекс мероприятий, направленных на обеспечение высокого уровня жизнедеятельности и работоспособности человека и на устранение причин заболевания и их предупреждение, в том числе с использованием лекарственных средств. Новая информация о роли цитокинов в регуляции иммунитета и клиническом применении рекомбинантных цитокинов в иммунокорригирующей, гемо стимулирующей, противоопухолевой и противовоспалительной терапии позволит подобрать адекватную тактику лечения при разных заболеваниях.
Вирусные гепатиты.
Инфекции, вызванные вирусами гепатитов, продолжают оставаться одной из основных проблем современного здравоохранения [14, 74]. Среди вирусных гепатитов доминирующее место занимают инфекции, вызванные вирусами гепатитов В и С (ВГВ и ВГС). С ними связаны практически все летальные исходы у больных острыми вирусными гепатитами (ОВГВ), а также - развитие хронических заболеваний печени, включая циррозы и первичный рак печени. Значительно выросли в последнее время показатели заболеваемостью ВГВ и ВГС в России, что связано с ростом наркомании. По сравнению с 1994г. (первым годом официальной регистрации ВГС) в 2002г. официальные показатели заболеваемости ВГВ и ВГС в России возросли в 7 раз. Однако, истинные значения значительно выше, т.к. в ряде случаев эти инфекции, особенно - ВГС, протекают бессимптомно в течение многих лет. И если ВГВ поддается лечению, то хронизация при ВГС достигает 80%, что связывают со способностью вируса к мутации под воздействием иммунного процесса.
Большинство экспертов считают целесообразной противовирусную терапию больных острыми ВГВ и ВГС (ОВГВ и ОВГС) с помощью препаратов ИФН-а. В то же время, длительная терапия препаратами ИФН-а может приводить к ряду побочных эффектов: гриппоподобному синдрому, нейротоксикозу, алопеции и т.д. Как правило, побочные эффекты наблюдаются при индивидуальной непереносимости, передозировке или длительном применении ИФН и имеют дозозависимый и обратимый эффект.
Препараты экзогенного ИФН хорошо сочетаются с использованием в клинической практике его индукторов, вызывающих в организме образование собственного (эндогенного) ИФН и обладающих антивирусной, иммуномодулирующей и антитуморогенной активностью, т.е. свойствами, характерными для ИФН. Ряд индукторов ИФН (амиксин, циклоферон, ридостин) в настоящее время широко применяется в терапии ОВГС. Исследования показали, что противовирусная активность названных препаратов в целом совпадает с ранее выявленной активностью экзогенных ИФН [15,16, 24, 25].
К сожалению, несмотря на достаточно большой набор препаратов для терапии гепатитов, проблема лечения вирусных гепатитов остается неразрешимой. Поэтому крайне важно изучение механизмов действия новых лечебных препаратов, эффективных при острых и хронических вирусных гепатитах В и С. Необходимо также проводить исследование специфической активности лечебных средств и продукции цитокинов под действием исследуемых препаратов in vitro на различных моделях для предварительной оценки их эффективности с экстраполяцией на целостный организм человека, позволяющее с высокой степенью достоверности прогнозировать эффективность препаратов при гепатитах С и В. Герпес.
Заболевания, вызываемые вирусами семейства герпеса, являются хроническими и отличаются чрезвычайно широкой распространенностью. Наиболее значимыми из них являются: герпетическая инфекция, вызываемая вирусами герпеса простого 1 и 2 типов (ВПГ-1, ВПГ-2), и цитомегаловирусная (ЦМВ) инфекция. Антитела к ВПГ-1 и ВПГ-2 выявляются у 80-90% населения. В России острыми хроническими формами ВПГ-инфекций страдают около 30 млн. человек, и число их ежегодно возрастает [38,40].
Герпетическая инфекция протекает в различных формах - поражение кожи и слизистых, герпетические поражения глаз (почти 50% всех госпитализированных в глазные клиники составляют больные с герпетической инфекцией) и, наконец, тяжелые герпетические энцефалиты. Внутриутробные ВПГ- и ЦМВ-инфекции могут быть причинами перинатальной летальности, самопроизвольных выкидышей, преждевременных родов или ранней инвалидизации детей (глухота, слепота, эпилепсия, микроцефалии, пороки сердца и др.) [40].
Для лечения герпетической инфекции разработано и применяется большое количество препаратов, главным образом, это ациклические аналоги природных нуклеотидов. Центральное место занимает ацикловир (завиракс). В настоящее время используется другой аналог - пенцикловир и его таблетированная форма - фамцикловир. Широкое клиническое применение нашли отечественные индукторы ИФН (ридостин, циклоферон, аллокин) [15].
Общим недостатком всех противогерпетических препаратов является их неспособность привести к элиминации возбудителя из организма. Более того, при отмене препаратов скажем, ацикловира, рецидивы заболевания повторяются с прежней частотой. Основная масса противогерпетических средств наиболее активна при острых стадиях рецидивирующего герпеса и мало влияет на продолжительность ремиссии. К ряду химиопрепаратов развивается устойчивость (ацикловир). Актуальной задачей остается поиск и изучение противовирусной и иммуномодулирующеи активности новых эффективных препаратов для лечения этого заболевания. Хламидийная инфекция.
В последние годы установлена связь между инфекционными агентами и соматическими заболеваниями. Например, Chlamydia pneumoniae выделяется более чем в 10% случаев пневмоний в детском возрасте, Chlamydia trachomatis является наиболее частым патогеном, передаваемым половым путем, и одной из причин потери зрения. Обнаружена связь между обнаружением Chlamydia pneumoniae и патогенезом атеросклероза, который занимает первое место в мире, как причина смертности. Подтверждена взаимосвязь хронической хламидийной инфекции с хронической сердечно-сосудистой недостаточностью. В среднем в атероматозных бляшках хламидии обнаруживаются в 70% случаев [40].
Сифилис.
В настоящее время сифилис остается по-прежнему одной из важнейших проблем здравоохранения в России. По официальным данным темпы роста заболеваемости сифилисом несколько снизились (2001г. - 124 человека на 100 тыс населения, 1996г. - 214 человека на 100 тыс населения), однако эти данные далеко не полные. Во врачебной практике все чаще стали наблюдаться случаи развития серорезистенции после лечения сифилиса (до 20%), несмотря на полноценную терапию. Поэтому поиску новых средств и схем лечения сифилиса уделяется большое внимание [47].
Онкология.
Несмотря на разработку новых методов лечения, не решена также и проблема профилактики и лечения онкологических заболеваний. Смертность от новообразований с каждым годом увеличивается. Имеющиеся в арсенале врачей методы и средства их терапии часто не обладают высокой эффективностью. В связи с этим поиск новых подходов к лечению опухолевых патологий является оправданным.
Актуальными являются работы по созданию препаратов для предотвращения возникновения опухолей у различных групп риска, профилактики осложнений при химиолучевой терапии, метастазов и рецидивов после радикального лечения онкологических больных. Данные, полученные на опухолевых клетках человека, могут свидетельствовать о противоопухолевой активности исследуемых препаратов в определенном диапазоне концентраций.
Цитокины имеют важное значение в патогенезе онкологических заболеваний, т.к. клетки-продуценты или клетки-мишени для цитокинов могут быть поражены опухолевым процессом. Активация онкогенов в клетках сопутствует активации генов цитокинов, что приводит к патологической выработке цитокинов и к нарушению ответа на них неотрансформированных клеток. Иммунотерапия рака, как отдельное направление, сформировалось около 20 лет назад. Терапевтическая активность цитокинов обусловлена их способностью влиять на внутриклеточный метаболизм и геном клеток, а также нормализовать нарушения функций иммунной системы и активировать противоопухолевый иммунитет [58].
Перечисленные заболевания, такие как гепатиты, генитальный герпес, онкологические и многие другие продолжают оставаться малоконтролируемыми, и пока не найдены препараты, полностью защищающие от них. Поэтому, приобретает важное значение изучение механизмов функционирования всех звеньев иммунитета и подбор средств и схем для профилактики и терапии заболеваний инфекционной и неинфекционной природы.
Цель исследования:
Выявить закономерности функционирования цнтокиновой регуляторной сети в норме и при патологии и на этой основе разработать способы коррекции нарушений иммунитета. Задачи исследования:
1. Изучить in vitro особенности цитокиновых реакций (продукции интерферонов и других цитокинов) на начальном этапе развития инфекционного процесса.
2. Выявить закономерности изменений показателей иммунного и интерферонового (ИФН) статусов при инфекционных и неинфекционных заболеваниях.
3. Исследовать феномен ИФН-чувствителыюсти и ИФН-резистентности как один из основных показателей функционирования системы ИФН у больных с разными формами патологии.
4. Исследовать состояние системы ИФН у больных с разными формами патологии (гепатиты, генитальный герпес, заболевания, передающиеся половым путем, рассеянный склероз, новообразования, серорезистентность после лечения сифилиса).
5. Провести сравнительную оценку системы ИФН и других цитокинов на уровне экспрессии их генов у больных с различными заболеваниями.
6. Выявить взаимосвязь между параметрами ИФН и иммунного статусов, а также цитокинового профиля, и эффективностью проводимой терапии с использованием новых иммуномодулирующих препаратов, таких как гепон, аллокин, искадор, арглабин.
7. Разработать стратегию и тактику коррекции иммунопатологических состояний: определить основные параметры иммунного, ИФН и цитокинового статусов, при достижении которых наблюдается положительный эффект лечения, которые следует учитывать при выборе тактики лечения больных с разными формами патологии.
Научная новизна исследования.
Впервые разработан метод определения ИФН-чувствительности и исследована индивидуальная чувствительность больных с различными заболеваниями к интерферонам и их индукторам, что позволило реально прогнозировать эффективность иммуномодулирующей терапии и научно обосновать возможность индивидуального подбора наиболее эффективных препаратов.
Установлены нормы цитокинового профиля человека - одного из ключевых параметров, определяющих эффективность иммунного ответа.
Впервые показаны особенности продукции ИФН и других цитокииов разными линиями клеток на начальном этапе развития вирусной инфекции (ранние цитокиновые реакции, которые определяют последующий запуск иммунологических реакций).
Впервые определены изменения продукции ИФН и других цитокинов у больных с разными формами патологии (вирусные инфекции: гепатиты, герпес; урогенитальные заболевания; серорезистентность после лечения сифилиса; рассеянный склероз; новообразования), отражающие особенности иммунного ответа при каждом заболевании, что существенно для понимания процессов межсистемных взаимодействий, механизмов и принципов иммунорегуляции.
Впервые показана корреляция между параметрами ИФН и иммунного статусов, а также цитокинового профиля, и эффективностью проводимой терапии при различных заболеваниях.
Разработаны эффективные способы диагностики, прогноза, профилактики и коррекции иммунопатологических состояний на основе комплексного исследования показателей, характеризующих ряд основных параметров иммунной системы.
Практическая значимость.
Предложена экспериментальная модель (клетки крови человека) для определения терапевтического эффекта лечебных средств при разных формах патологии.
Разработаны новые приоритетные методы определения ИФН-чувствительности и принципы определения чувствительности организма к лекарственным препаратам (ИФН, цитокинам, индукторам ИФН и другим иммуномодуляторам).
Разработан и внедрен в практику ведущих клиник г. Москвы комплексный метод - расширенный ИФН статус для определения подходов к индивидуальной иммунокоррекции у человека,
Предложен комплексный подход, позволяющий моделировать с высокой степенью достоверности иммунный ответ на инфекцию и корректировать его с помощью лекарственных средств (химиопрепараты, ИФН, индукторы ИФН, иммуномодуляторы) для предупреждения развития инфекционного процесса. В основу отбора препаратов для коррекции иммунного ответа положены исследования продукции и действия ИФН и других цитокинов. Внедрение результатов работы.
Материалы диссертации явились основой для создания следующих инструктивно-методических документов:
1) Методические рекомендации, утвержденные в НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (1998): «Определение клеточной чувствительности к интерферонам в цельной крови (расширение показателей ИФН-статуса)».
2) Методические указания Научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств (2002):
-Методические указания по определению индивидуальной чувствительности организма к интерферонам, другим цитокинам и индукторам интерферона,
-Методические указания по проведению доклинических исследований цитокин-индуцирующей активности антивирусных препаратов.
3) Методические указания Федеральной службы но надзору в сфере здравоохранения и социального развития и Федерального государственного учреждения научный центр экспертизы средств медицинского применения (2005):
-Методические указания по изучению специфической противовирусной активности фармакологических средств, -Методические указания по изучению специфической активности индукторов интерферона.
4) Патенты РФ:
-Способ определения чувствительности живого организма к цитокину. Патент РФ на изобретение №2181889 от 27.04.2002,
-Способ определения чувствительности живого организма и/или его клеток к воздействию вещества, поля или комбинации веществ и/или полей. Патент РФ на изобретение №2202363 от 20.04.2003.
Апробация диссертационной работы.
Основные материалы диссертации представлены на Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1995, 1996, 1997, 1998, 2000, 2001, 2002, 2004, 2006), II Российской практической конференции «Гепатиты В.С,П,0-проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 1997), VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997), 8-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 2000), IV Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище: XXI век» (Санкт-Петербург, 2000), IV съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001), международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2003), 4 и 5 научных конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2000, 2001), VII Всероссийском съезде неврологов (Москва, 2001), 16 Съезде отоларингологов России (Москва, 2001), научно-практической конференции «Медицина будущего» (Сочи, 2002), Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2002), VI Российском съезде врачей-инфекционистов (Санкт-Петербург, 2003), 3 Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), Четвертом конгрессе педиатров-инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей (диагностика и лечение)» (Москва, 2006), коиференции РАН «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2006), 15 конференции ESACT «Animal Cell Technology; New Developments - New Applications» (Tours, 1997), 1 международном конгрессе по вакцинам и иммунизации (Istanbul, 1998), на международной конференции по интерферонам «Biology and Clinical Applicatoiis» (Venice, 1998), 11 международном симпозиуме «New Drugs in Cancer Therapy» (Amsterdum, 2000), 10 международном симпозиуме «Development and Delivery Challenges of the Next Generations of Drugs» (Istanbul, 2000), 10 международной конференции по фармацевтической технологии (Florence, 2002), международных конгрессах ISICR, 1CS и ECS (1997, 1998, 1999,2000,2001,2003).
Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции отдела интерферонов и отдела иммунологии ГУ НИИЭМ имени Н.Ф.Гамалеи РАМН 20 февраля 2006г.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 86 печатных работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа изложена на 280 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав результатов исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 95 отечественнвіх и 158 зарубежнвіх источников. Диссертация включает 65 таблицы, 15 рисунков.
