Введение к работе
5^Ь %0
Актуальность работы
Загрязнение окружающей среды ксенобиотиками является глобальной экологической проблемой, которая стоит в центре внимания исследователей во всех странах мира. Среди техногенных поллютантов наиболее серьезную опасность представляют полихлорированные дибензодиоксины и дибензофураны, объединяемые под названием диоксиноподобные суперэкотоксиканты [Федоров, 1993]. Основным и наиболее токсичным представителем этого класса веществ является 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин (ТХДД), причем опасность этого соединения зависит не только от его острой токсичности, но и от крайне высокой способности к биоконцентрированию в живых системах, чрезвычайно длительному выведению из организма [Birnbaum et al., 2003]. Источниками ТХДД являются предприятия по переработке отходов, производство хлорорганических гербицидов и другая индустрия, где происходит хлорирование химических соединений, а поступление его в организм осуществляется по так называемым "пищевым путям" [Амирова, Круглое, 1998; Roeder et al., 1998]. Токсическое действие ТХДД на организм млекопитающих включает гепатотоксичность, геиотоксичность и канцерогенность, иммунотоксичность, нарушения метаболизма стероидных гормонов, репродуктивной функции и пр. [DeVito, Birnbaum, 1995; Nilsson, Hakansson, 2002; Cole et al., 2003; Dioxines and Health, 2003; Birnbaum, 2000; Birnbaum et al., 2003; Matsumura, 2003]. Иммунная система традиционно считается основной мишенью токсического действия ТХДД. Результаты многочисленных экспериментальных исследований и ряда клинических наблюдений убедительно аргументируют способность ТХДД вмешиваться в процессы созревания и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, реализацию их эффекторных функций, и, как следствие, нарушать антиинфекционную, противоопухолевую резистентность, индуцировать развитие аутоиммунных заболеваний [Pokrovsky et al., 1991; Vinies, 1996; Holladay, 1999; Amirova et al., 1999; Warren et al., 2000; Kerkvliet, 2002; Mimura, Fujii-Kuriyama, 2003].
ggSPjr
Считается, что практически все проявления токсического эффекта ТХДД обусловлены его способностью высокоселективно связываться с "химическим сенсором" - арилуглеводородным рецептором (Ah-рецептором), лиганд-активируемым транскрипционным фактором, который относится к суперсемейству ядерных рецепторов и вызывать мощную индукцию изоформ цитохрома Р450 CYP1A1 и CYP1B1 [Okey et al., 1994; Nebert et al., 2004]. В свою очередь, Ah-рецептор-зависимые сигнальные системы тесно сопряжены с регуляцией клеточного цикла, синтезом цитокинов и факторов роста, а индуцируемые ТХДД изоформы цитохрома P450CYP1А1 hCYPIBI участвуют в биотрансформации множества бисшогнчс они аипшиим. молекул, включая стероидные гормоны, ретиноиды, зйірзансИдКІІД|[йй6Йдяк и соавт., 2003;
Hines et al., 2001; Nebert et al., 2001, 2004].
Несмотря на то, что внутриклеточная "мишень" воздействия ТХДД твердо установлена, механизмы развития иммунотоксичности и последствия воздействия высоких доз этого экотоксикаита на иммунную систему человека окончательно не ясны, и в работах, посвященных этой проблеме, представлены весьма противоречивые результаты [Игнатьева, 1997; Курчатова, 1999; Lu, Wu, 1985; Roumak et a!., 1992,1995; Neubert et al., 1991 - 2000; Lang et al, 1996; Sibiryak et al., 1998; Belles-Isles et al, 2000]. Существенно, что при изучении влияния ТХДД на лимфоидные клетки в системах in vitro, как правило, используются лимфобластоидные линии клеток, которые отличаются по реактивности и чувствительности к ксенобиотику от лимфоцитов доноров.
Программированная клеточная смерть путем апоптоза рассматривается, в настоящее время, как основной механизм поддержания иммунного гомеостаза, играющих ключевую роль в регуляции численности иммунокомпетентных клеток, их созревания и дифференцировки Т и В клеток, обеспечения адекватной силы и продолжительности иммунного ответа, сохранения аутотолерантности [Ярилин, 1999; Барышников, Шишкин, 2002; Krammer, 2000]. Нарушения апоптоза приводят к развитию иммунопатологии (апоптотического иммунодефицита) [Чередеев, Ковальчук, 1997; Ковальчук, Чередеев, 1999; Cheredeev, Kovalchuk, 1997]. Нарушения механизмов программированной клеточной смерти иммунокомпетентных клеток нередко лежат в основе иммунотоксичности ксенобиотиков [Имельбаева и соавт, 2000; Сибиряк, 2003; Сибиряк и соавт.; 2003]. На сегодняшний день результаты исследований, посвященных влиянию ТХДД на апоптоз лимфоидных и нелимфоидных клеток неоднозначны и нередко диаметрально противоположны - есть сведения об "апоптогенном" действии ТХДД fKamath et al, 1997; Hossain et al, 1998], о его способности ингибировать программированную клеточную смерть, или отсутствии влияния на этот процесс [Silverstone et al., 2000]. Выяснение характера влияния этого соединения на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов представляется весьма важным не только для понимания механизмов иммунотоксичности экотоксикантов-индукторов цитохрома Р450, но и роли Ah-рецептор-зависимых сигнальных систем в регуляции реактивности иммунокомпетентных клеток.
Цель исследования:
Оценить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов периферической крови человека в системе in vitro во взаимосвязи с его специфическим эффектом, и на процессы позитивной и негативной активации клеток в лимфоидных органах экспериментальных животных
Задачи исследования:
- Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на
монооксигеназную активность цитохрома Р4501А1, пролиферативную активность, апоптоз лимфоцитов периферической крови человека при их стимуляции неспецифическими митогенами.
Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на монооксигеназную активность цитохрома Р4501А1, пролиферативную активность и апоптоз Т лимфоцитов периферической крови человека при их физиологической стимуляции через Т- клеточный рецептор
Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на активационно-индуцированную экспрессию Fas-рецептора и экспрессию белков-регуляторов апоптоза
Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибенэо-р-диоксина на чувствительность Т лимфоцитов периферической крови человека к рецепторно-индуцированному и нерецепторному апоптозу
Изучить влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксина на пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах у крыс
Научная новизна:
Установлено, что ТХДД вызывает индукцию CYP1A1 -зависимой монооксигеназной активности, ингибирует пролиферативную активность и активационный апоптоз лимфоцитов периферической крови человека, стимулированных смесью митогенов, увеличивает активационно-индуцированную экспрессию Fas-рецептора, причем характер влияния ТХДД на митогенез и апоптоз не зависит от уровня контаминации донора ксенотоксикантом.
Впервые установлено, что ТХДД вызывает индукцию CYP1A1 -зависимой монооксигеназной активности, усиливает экспрессию белка CYP1A1, ингибирует пролиферативную активность и активационный апоптоз Т лимфоцитов периферической крови человека стимулированных антиСОЗ МКА, не изменяет активационно-индуцированную экспрессию CD25 и CD95 на CD4+ и CD8+ лимфоцитах, вызывает гипоэкспресию bcl-2 в активированных лимфоцитах. Влияние ТХДД на митогенез лимфоцитов связано не только с индукцией CYP1А1, но и с прямым влиянием на ферментативную активность эффекторных каспаз.
Впервые обнаружено, что ТХДД повышает чувствительность активированных через Т-клеточный рецептор лимфоцитов периферической крови человека к рецепторному (Fas-индуцированному) апоптозу, но снижает их чувствительность к апоптозу, индуцированному нерецепторным сигналом (камптотецином).
Установлено, что ТХДД, при введении в дозе, обеспечивающей основной токсикологический эффект (индукцию CYP1A1), воздействует на органы иммунной системы, характеризующиеся высоким "митотическим" потенциалом (тимус, костный мозг), где проявляет отчетливое антипролиферативное, а в
тимусе и апоптогенное действие. В селезенке, лимфатических узлах и периферической крови антипролиферативный эффект отсутствует, однако он проявляется при индукции митогенеза клеток, что сопровождается и параллельным снижением интенсивности активационного апоптоза.
Научно-практическая значимость работы:
Полученные данные способствуют расширению знаний о механизмах иммунотоксического действия ксенобиотиков-индукторов цитохрома Р4501А1, а также механизмах участия Ah-рецептор-зависимых сигнальных систем в регуляции пролиферативной активности и апоптоза иммунокомпетентных клеток.
Внедрение результатов исследования:
Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре иммунологии ЧелГМА. Предлагаемые автором методические подходы к оценке пролиферативной активности и апоптоза используются в научной работе отдела иммунологии ГУЗ "Всероссийский центр глазной и пластической хирургии" МЗ и СР РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин нарушает нормальную реактивность лимфоцитов периферической крови человека при их стимуляции лектинами и через Т клеточный рецептор, что выражается в антипролиферативном эффекте, угнетении индуцированного активацией апоптоза и сопровождается относительной гиперэкспрессией Fas рецептора, гипоэкспресией bcl-2, гиперэкспрессией р53. Эти нарушения связаны как с внутриклеточной индукцией цитохрома Р450 CYP1A1, так и с непосредственным влиянием на ферментативную активность эффекторных каспаз.
-
2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин повышает чувствительность активированных Т лимфоцитов периферической крови человека к рецепторно-индуцированному (Fas-индуцированному) апоптозу, но снижает чувствительность к апоптозу, индуцированному нерецепторным сигналом (подавлением активности топоизомеразы I). Повышение чувствительности активированных клеток к рецепторному апоптозу может лежать в основе вызываемого ТХДД иммунодефицита.
-
2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин, при введении крысам в дозе, обеспечивающей индукцию CYP1A1 печени, проявляет антипролиферативное и апоптогенное действие на тимус, антипролиферативное воздействие на костный мозг, а во вторичных лимфоидных органах антипролиферативный эффект проявляется лишь при индукции митогенеза клеток.
Апробация работы:
Результаты диссертационной работы доложены на Международном Конгрессе "DIOXIN'2000" (Монтеррей, США, 2000), Х1-м Международном Конгрессе иммунологов (Стокгольм, Швеция, 2001), 1-м Съезде иммунологов
Урала (Екатеринбург, 1999 г.), V Всероссийском Форуме "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (С.-Пб. 2002 г.), 3-м съезде иммунологов Урала (Челябинск, 2003 г.), Объединенном иммунологическом Форуме (Екатеринбург, 2004), 19-м Европейском рабочем Совещании по метаболизму лекарств (DMW-2004, Анталья, Турция, 2004).
Публикации:
По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ.
Объем и структура диссертации:
Диссертация изложена на 138 страницах, иллюстрирована 10 таблицами и 27 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, раздела, отражающего результаты собственных исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 222 источника (17 отечественных и 205 зарубежных).
![Изучение влияния [Г]-D-глутаминил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку и функциональную активность лимфоцитов](/i/i/4503/301534.png "Изучение влияния [Г]-D-глутаминил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку и функциональную активность лимфоцитов Петров Александр Владимирович")
