Содержание к диссертации
Содержание 2
Список сокращений 5
Введение 6
Актуальность проблемы 6
Цели и задачи 10
Научная новизна 12
Практическая значимость 13
Основные положения, выносимые на защиту 15
Часть 1. Обзор литературы 17
Глава 1. Субпопуляции В лимфоцитов 17
Введение 17
В-2 лимфоциты 21
В-1 лимфоциты 27
MZ-B лимфоциты 34
Глава 2. Роль микроокружения в функциональной активности В
лимфоцитов 39
Введение 39
В Клетки слизистых оболочек 40
Сравнительная характеристика В-1 лимфоцитов селезенки и перитонеальной полости у мыши 43
Фенотипические различия В-1а клеток брюшной полости и селезенки 45
Функциональные различия В-1а клеток брюшной полости и селезенки 49
Различия в специфичности В-1а клеток селезенки и брюшной полости 51
2.4. Различия В-2 клеток селезенки и брюшной полости 52
Миграция В лимфоцитов селезенки и брюшной полости 54
Роль факторов перитонеального микроокружения в формировании различий В лимфоцитов селезенки и брюшной полости 57
2.7. Заключение 59
Часть 2. Экспериментальные исследования 63
Глава 3. Материалы и методы исследования 63
Животные 63
Антиген и иммунизация 63
Спленэктомия 63
Получение клеточных суспензий 64
Подсчет числа живых и мертвых клеток 65
Получение В-1 лимфоцитов 65
Получение В-2 лимфоцитов 67
Витальное окрашивание клеток CFDA-SE 68
окрашивание клеток флуоресцентными антителами 69
Культивирование клеток in vitro 70
Адоптивный перенос клеток 71
Клеточный иммуноферментный анализ (ELISPOT) 72
Глава 4. Результаты исследования 74
4.1. Сравнительная характеристика слеток селезенки и брюшной полости
мышей СВА и CBA/N 74
Определение общего числа клеток в селезенке и брюшной полости мышей СВА и CBA/N 74
Определение числа В и Т лимфоцитов в селезенке и брюшной полости мышей СВА и CBA/N 75
Функциональная активность В лимфоцитов селезенки и брюшной полости мышей СВА и CBA/N 76
4.2. Распределение клеток мышейСВА в селезенке и брюшной полости
мышей CBA/N после внутривенного или внутрибрюшинного переноса 77
Функциональная активность спленоцитов мышей СВА и CBA/N в селезенке мышей CBA/N 81
Функциональная активность перитонеальных клеток мышей СВА в селезенке и брюшной полости мышей CBA/N 83
Функциональная активность В-1 и В-2 лимфоцитов мышей СВА, перенесенных внутривенно мышам CBA/N 86
Способность спленоцитов и клеток брюшной полости мышей СВА восстанавливать у мышей CBA/N ответ на поливинилпирролидон 86
Функциональная активность спленоцитов мышей СВА в брюшной полости мышей CBA/N 90
Функциональная активность пре-инкубированных in vitro перитонеальных клеток и спленоцитов мышей СВА перенесенных внутрибрюшинно мышам CBA/N 94
Функциональная активность пре-инкубированных in vitro перитонеальных клеток мышей СВА, перенесенных мышам CBA/N внутрибрюшинно 95
Функциональная активность пре-инкубированных in vitro спленоцитов СВА, внутрибрюшинно перенесенных мышам CBA/N... 97
4.9. Остаются ли в перитонеальной полости мышей CBA/N перенесенные
клетки мышей СВА, способные продуцировать IgM in vitro? 101
Глава 5. Обсуждение результатов 105
Выводы 117
Список литературы 118
Список сокращений
BCR — В-клеточный рецептор
Btk — Бруттон тирозинкиназа
CFDA-SE, CFSE — карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидиловый эфир
GALT — лимфоидные ткани слизистой оболочки кишечника
Ig — иммуноглобулин
TLR — Toll-подобный рецептор (toll-like recepror)
АОК — антитело-образующие клетки
АПК — антигенпрезентирующие клетки
ИГОК — иммуноглобулин-образующие клетки
ИЛ — интерлейкин
ЛПС — липополисахарид
ТЗ — тимус зависимый (антиген, ответ)
ТН — тимус независимый (антиген, ответ)
ФСБ — фосфатно-солевой буферный раствор
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Основная функция иммунной системы — защита от патогенов и осуществление иммунологического надзора. Иммунная система формирует биологическую индивидуальность организма. Выделяют две составные части иммунитета — врожденный (innate) и адаптивный (adaptive) иммунитет. Во врожденном иммунитете выделяют гуморальную (система комплемента) и клеточную (нейтрофилы и макрофаги) составляющие. Врожденный иммунитет низкоспецифичен и направлен на распознавание характерных молекулярных структур, общих для широкого круга возбудителей («образов патогенносте» — патоген-ассоциированных молекулярных паттернов, РАМР) [57]. Реакции врожденного иммунитета запускаются сразу же после встречи с антигеном; они формируют первую линию защиты, сдерживая распространение патогена до «запуска» отсроченного высокоспецифичного адаптивного иммунитета. Наряду с этим компоненты врожденного иммунитета формируют основу для развития адаптивного иммунного ответа. В частности, дендритные клетки и макрофаги презентируют антиген Т лимфоцитам и секретируют цитокины, оказывающие большое влияние на функциональную активность других клеток иммунной системы. В основе адаптивного иммунитета лежит кооперация трех типов клеток:
В лимфоцитов, Т лимфоцитов и антигенпрезентирующих клеток (АПК) [8, 87], а его кульминацией является образование пула защитных антител и/или развитие реакции цитотоксичности. Если врожденный иммунитет направлен в основном на экзоантигены, то мишенью адаптивного иммунитета могут быть не только экзо-, но и собственные антигены, или аутоантигены. Реакции адаптивного иммунитета, направленные против собственных антигенов называют аутоиммунными реакциями.
На первом этапе адаптивного иммунного ответа происходит поглощение антигена АПК и его презентация Т и В лимфоцитам. К профессиональным АПК относят дендритные клетки и макрофаги; определенную роль в презентации антигена играют также В-1 лимфоциты и стромальные клетки. Основными АПК являются дендритные клетки. Их взаимодействие с Т и В лимфоцитами необходимо для развития адаптивного иммунного ответа. Т лимфоциты участвуют в ответе в основном на тимус зависимые (ТЗ) антигены (преимущественно белковые и пептидные). По функциональной активности среди Т лимфоцитов выделяют Т-хелперы, Т-киллеры и регуляторные Т клетки (ранее называемые Т-супрессорами). Т-киллеры вместе с другими клетками лимфоидного ряда — натуральными киллерными клетками (НК-клетки) участвуют в реакциях цитотоксичности. Регуляторные Т лимфоциты играют важную роль в регуляции иммунного ответа. При ответе на ТЗ антигены Т-хелперные лимфоциты поставляют «второй» сигнал примированным В клеткам, необходимый для
дифференцировки последних в плазмоциты или В клетки памяти. Существуют, однако, антигены для ответа на которые Т клетки не нужны — тимус независимые (ТН) антигены.
В лимфоциты в свою очередь подразделяют на четыре основные субпопуляции, различающиеся по своим свойствам: В-la (CD5+), B-lb (CD5~), В-2 и В клетки маргинальной зоны селезенки (MZ-B). В-1 лимфоциты возникают в онтогенезе раньше других субпопуляций. Считается, что В-1 клетки имеют фетальное происхождение, а во взрослом организме представляют самоподдерживающуюся субпопуляцию, однако существуют данные о наличии предшественников В-lb клеток во взрослом костном мозге. В-1 лимфоциты отвечают в основном на ТН антигены. В-2 клетки возникают в онтогенезе позже В-1 и являются преобладающей субпопуляцией во взрослом организме у мыши и человека. Образование новых В-2 клеток продолжается в течение всей жизни организма из предшественников во взрослом костном мозге. Они отвечают в основном на ТЗ антигены, т.е. нуждаются в кооперации с Т лимфоцитами. MZ-B клетки выявляют только во взрослом организме у мыши в маргинальной зоне селезенки, у человека еще и в лимфатических узлах. Вопрос о происхождении MZ-B лимфоцитов до конца не решен; вероятно, они могут происходить как из В-1, так и из В-2 лимфоцитов [48]. MZ-B клетки, наряду с В-1 лимфоцитами, участвуют в ТН-ответе.
В клетки распределены в организме неодинаково. Так, основным местом локализации В-1 лимфоцитов является брюшная полость; незначительные их количества выявляют в селезенке, плевральной полости и лимфоидных тканях слизистой оболочки кишечника. Единичные В-1 лимфоциты выявляют в костном мозге. В-2 клетки, напротив, представлены преимущественно в селезенке, лимфоузлах, кровотоке и костном мозге, а также пейеровых бляшках кишечника, и лишь незначительное их число обнаруживают в брюшной полости [127]. Наиболее изучены В клетки селезенки и брюшной полости. Известно, что В лимфоциты, разной локализации различаются по своим свойствам. Долгое время такие отличия связывали с преобладанием в разных органах различных субпопуляций В лимфоцитов. В последнее время, однако, получены данные, свидетельствующие о зависимости свойств В клеток от их локализации. Нас интересовало влияние микроокружения селезенки и брюшной полости на функциональную активность В лимфоцитов. Известно, что в норме между этими органами происходит постоянный обмен клетками. Однако В спленоциты отличаются от перитонеальных В клеток по экспрессии поверхностных маркеров, способности отвечать на различные стимулы и способности продуцировать иммуноглобулины (Ig) in vivo. Так, например, перитонеальные В-1 лимфоциты, по сравнению с В-1 клетками селезенки, экспрессируют больше поверхностного IgM, но меньше IgD и CD45 (В220); в отличие от В-1 спленоцитов они не отвечают на перекрестное связывание
IgM, но при этом отвечают на форболовый эфир без добавления иономицина [109]. Одна из основных характеристик перитонеальных В лимфоцитов — отсутствие среди них в норме Ig-продуцентов [124], в то же время В-1 клетки, составляющие большинство перитонеальных В лимфоцитов образуют более 50% IgM сыворотки крови у мыши [34], а при переносе облученным реципиентам, восстанавливают их иммунореактивность.
Следует сказать о том, что в вопросе о влиянии перитонеального микроокружения на продукцию Ig В лимфоцитами мыши остается много неясного. До сих пор не установлены механизмы подавления функциональной активности В клеток. Неизвестно происходит ли угнетение синтеза Ig или их секреции; отличается ли функциональная активность В-2 клеток, локализованных в разных органах; не известно, как изменяется перитонеальное микроокружение после вымывания клеток из брюшной полости; какова роль различных факторов и стромальных элементов в функциональной активности В лимфоцитов. Эти вопросы должны являться объектом дальнейших исследований.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ
Целью настоящей работы является определение влияния микроокружения брюшной полости и селезенки на функциональную активность В лимфоцитов мыши.
В задачи исследования входит:
S Отработка условий внутривенного и внутрибрюшинного переноса
клеток селезенки и перитонеальной полости мышей СВА конгенным xid-
мышам CBA/N.
S Выявление распределения перенесенных клеток мышей СВА в
селезенке и брюшной полости мышей CBA/N.
S Определение влияния перитонеального микроокружения селезенки
мышей CBA/N на функциональную активность В лимфоцитов селезенки и
перитонеальной полости мышей СВА.
S Определение влияния микроокружения брюшной полости мышей
CBA/N на функциональную активность В лимфоцитов селезенки.
S Определение содержания иммуноглобулин-образующих клеток
(ИГОК) в брюшной полости спленэктомированных мышей CBA/N после
внутрибрюшинного введения им спленоцитов СВА.
S Активация перитонеальных В лимфоцитов путем инкубации их in vitro.
S Разработка модели, позволяющей исследовать активность
перитонеальных клеток СВА.
S Определение влияния микроокружения брюшной полости мышей
CBA/N на синтез/секрецию IgM преинкубированными in vitro
перитонеальными клетками мышей СВА.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
S Впервые исследовано распределение в селезенке и брюшной полости
мышей CBA/N окрашенных CFDA-SE спленоцитов и перитонеальных
клеток мышей СВА при)их внутривенном и внутрибрюшинном переносе.
S Впервые показано, что спленэктомия не влияет на содержание В и Т
лимфоцитов в брюшной полости мышей CBA/N.
S Впервые показано, что вводимые в брюшную полость ИГОК селезенки
прекращают синтезировать/секретировать ИГ.
S Впервые разработана экспериментальная модель, позволяющая
исследовать функциональную активность перитонеальных В клеток в
микроокружении брюшной полости.
S Впервые показано, что при внутрибрюшинном переносе мышам
CBA/N активированных in vitro перитонеальных В клеток мышей СВА
образование ими ИГ угнетается.
S Впервые показано, что после того, как перенесенные внутрибрюшинно
перитонеальные ИГОК перестают синтезировать/секретировать ИГ, в
брюшной полости реципиентов В клетки, способные продуцировать ИГ
in vitro сохраняются.
S Таким образом установлено, что микроокружение брюшной полости
подавляет образование ИГ В лимфоцитами у мыши.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Настоящая работа относится к исследованиям фундаментального характера. Будут получены данные о влиянии микроокружения брюшной полости и селезенки на функциональную активность В лимфоцитов.
Изучение влияния перитонеального микроокружения на функциональную активность В лимфоцитов имеет большое значение. Как уже отмечалось, в брюшной полости преобладают В-1 лимфоциты. Многие В-клеточные лимфомы берут начало от В-1 линии: >95% случаев хронических лимфоидных лейкемий обусловлено В-1 лимфоцитами. Среди перитонеальных В-1 лимфоцитов высоко содержание клеток, специфичных к аутоантигенам, поэтому В-1 клетки часто играют ключевую роль в развитии аутоиммунной патологии [126]. In vivo, микроокружение перитонеальной полости угнетает активность В клеток, предотвращая развитие аутоиммунных заболеваний. Существенно, что наряду с угнетением функциональной активности, микроокружение брюшной полости поддерживает жизнеспособность перитонеальных В лимфоцитов. Следует отметить, что при aHTH-CD20 обработке, направленной на элиминацию В лимфоцитов с периферии при аутоиммунной патологии, В клетки (в том числе аутореактивные) сохраняются в брюшной полости значительно дольше, чем в кровотоке [45]. Поддержание популяции перитонеальных В клеток также необходимо для нормального функционирования иммунной
системы. Преобладающие в брюшной полости В-1 клетки играют важную роль в защите организма от бактериальных инфекций. Нарушение постоянства клеточного состава в брюшной полости приводит к снижению защиты организма от бактериальных инфекций, несмотря на то, что in vivo перитонеальные В клетки находятся в «неактивном» состоянии. Например, у пациентов с почечной недостаточностью для компенсации функции почек широко применяют перитонеальный диализ, при котором пациенту при помощи катетера в брюшную полость вводят большое количество диализного раствора; после проведения диализа раствор удаляется из перитонеальной полости через тот же катетер, т.е. происходит постоянное вымывание клеток из брюшной полости. У таких пациентов значительно возрастает частота перитонитов, что может быть связано с нарушением клеточного состава перитонеальной полости [129]. Изменения микроокружения брюшной полости после подобных манипуляций можно изучать и в модельных опытах. Нами начата разработка экспериментальной модели — однократного или многократного вымывания клеток из брюшной полости у мышей. Предварительные опыты по определению клеточного состава и функциональной активности клеток брюшной полости таких мышей показали, что через 4 недели после вымывания число клеток в брюшной полости восстанавливается до нормальных значений; однако происходит изменение ее клеточного состава. Число ИГОК в перитонеальных клетках таких мышей после культивирования их in vitro,
отличается от такового при культивировании перитонеальных клеток интактных мышей. Полученные результаты не являются окончательными и требуют проверки. Материалы этих исследований в диссертацию не включены.
Все это говорит о том, что изучение роли микроокружения (в частности селезенки и брюшной полости) в функциональной активности В лимфоцитов имеет большое значение для расширения наших знаний о патогенезе аутоиммунных заболеваний и противоинфекционной защите организма.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
S В отличие от селезенки, в перитонеальной полости мышей СВА и
CBA/N in vivo IgM-образующие клетки отсутствуют.
S В лимфоциты мышей СВА при адоптивном переносе конгенным xid-
мышам CBA/N в организме реципиентов выживают и функционируют
(синтезируют/секретируют ИГ).
S При внутривенном введении мышам CBA/N окрашенных CFDA-SE
клеток мышей СВА, в селезенке реципиентов удается выявить больше
перенесенных клеток, чем в брюшной полости, а при внутрибрюшинном
введении, наоборот — в перитонеальной полости выявляется больше
перенесенных клеток, чем в селезенке.
S Неактивные в брюшной полости В лимфоциты мышей СВА образуют
ИГ в селезенке мышей CBA/N. В то же время, спленоциты СВА в брюшной
полости мышей CBA/N ИГ не образуют.
S При внутрибрюшинном введении активированных перитонеальных
клеток в брюшной полости реципиентов на 1-е сутки после переноса
сохраняется -30% перенесенных IgM-ИГОК; на 4-е сутки их число
уменьшается до фоновых значений.
S После «умолкания» перенесенных внутрибрюшинно ИГОК в
перитонеальной полости реципиентов клетки, способные продуцировать ИГ
сохраняются.
S Микроокружение брюшной полости угнетает образование ИГ В
лимфоцитами.
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
![Изучение влияния [Г]-D-глутаминил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку и функциональную активность лимфоцитов](/i/i/4503/301534.png "Изучение влияния [Г]-D-глутаминил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку и функциональную активность лимфоцитов Петров Александр Владимирович")
