Введение к работе
Актуальность темы. Белками теплового шока (БТШ) называют обширную группу клеточных протеинов, синтез которых значительно возрастает при клеточном стрессе. БТШ присутствуют во всех клетках и организмах, изученных на сегодняшний день, и обладают очень высоким уровнем гомологии в широком спектре охарактеризованных организмов, что свидетельствует о консервативности этих протеинов. Наряду с консервативностью структуры БТШ, разнообразие стрессирующих факторов, вызывающих индукцию экспрессии белков теплового шока, говорит об универсальности этого клеточного ответа на стресс. Важно отметить, что БТШ присутствуют в клетках, как в условиях стресса, так и в нормальных физиологических условиях, участвуя во многих внутриклеточных процессах. Длительное время считалось, что БТШ являются только внутриклеточными протеинами. Этому представлению соответствовало отсутствие в структуре молекул БТШ сигнальной последовательности необходимой для их секреции по классическому пути. Однако в дальнейшем присутствие БТШ было обнаружено в культуральной жидкости различных клеточных линий, а также в сыворотке крови ряда млекопитающих. Кроме того, появились данные об альтернативных путях высвобождения белков из клеток разных типов. Изучение возможных функций внеклеточных форм БТШ показало, что эти протеины обладают уникальными иммуномодулирующими свойствами. Использование препаратов БТШ в экспериментальных моделях позволяет направленно и эффективно усиливать иммунный ответ на опухолевые антигены и различные патогены, или наоборот, подавлять нежелательные аутоиммунные реакции. Известно также, что экзогенные БТШ способны взаимодействовать с клеточной поверхностью и проникать в клетки. Причем интернализованные БТШ сохраняют свои протективные функции и защищают клетки от гибели. В связи с этим очевидно, что наряду с внутриклеточными БТШ, внеклеточная форма этих протеинов также может оказывать влияние на функционирование организма. В настоящее время причины и механизмы продукции БТШ в межклеточное пространство практически не изучены. Очень мало известно и о механизмах иммуномодулирующих эффектов внеклеточной формы БТШ.
Цель исследования. Целью данной работы является анализ характеристик и механизмов формирования внеклеточного пула БТШ с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70) в популяциях лимфоидных клеток и исследование иммуномодулирующих эффектов внеклеточных БТШ70.
Задачи исследования. (1) Изучение феномена и характеристик продукции внеклеточных БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток различного типа. (2) Анализ механизмов экзоцитоза БТШ70 лимфоидными клетками. (3) Исследование влияния процесса апоптоза лимфоидных клеток на формирование внеклеточного пула БТШ70. (4) Изучение влияние стрессирующих факторов на экзоцитоз БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток. (5) Анализ иммуномодулирующих эффектов внеклеточного пула БТШ70.
Научная новизна. Проблема взаимодействия БТШ70 с иммунной системой привлекает интерес исследователей более двух десятилетий. Однако к настоящему времени достаточно полно охарактеризована лишь роль эндогенных и экзогенных БТШ70 в функционировании антигенпредставляющих клеток. В отличие от этого вовлеченность внеклеточных БТШ70 в процессы, протекающие в популяциях лимфоидных клеток, находится на самой начальной стадии изучения. К наименее охарактеризованным относятся вопросы, связанные с механизмами формирования внеклеточного пула БТШ70 в популяциях лимфоцитов. Поэтому все основные результаты данного исследования обладают высокой степенью научной новизны. В частности, был осуществлён комплексный анализ механизмов секреции БТШ70 для клеток лимфоидного происхождения: было охарактеризовано влияние ингибиторов аппарат Гольджи-зависимой секреции протеинов на экзоцитоз БТШ70, а также ингибиторов эндолизосомального и рафт-зависимого путей экзоцитоза. Была проверена возможность высвобождения данного протеина в составе экзосом. Впервые было продемонстрировано, что апоптоз лимфоидных клеток сопровождается увеличением пула внеклеточной формы БТШ70. Кроме того, был выявлен парадоксальный эффект снижения концентрации внутриклеточных БТШ70 на начальных этапах реакции лимфоцитов на стрессирующие воздействия, что указывает на ранее неохарактеризованный стресс-индуцированный выброс цитоплазматических БТШ70 в окружающую среду.
Практическая значимость. Белки теплового шока обладают уникальными иммуностимулирующими и адъювантными свойствами, которые позволяют создавать на основе БТШ эффективные противоопухолевые и противоинфекционные вакцины. В настоящее время проводятся клинические испытания некоторых разновидностей таких вакцин. В то же время, иммунизация экспериментальных животных препаратами БТШ70 позволяет предотвратить патологические аутоиммунные реакции. Известно также, что появление в сыворотке крови БТШ70 и антител к ним является характерным диагностическим признаком определенных этапов развития ряда патологий. Все это свидетельствует о значительных потенциальных возможностях применения БТШ70 в клинической практике. Очевидно, что для реализации таких возможностей необходимо изучение процессов формирования внеклеточной формы данных протеинов и механизмов их взаимодействия с иммунной системой. Исходя из этого, данная работа, посвященная исследованию явления экзоцитоза БТШ70 и роли их внеклеточной формы в функционировании лимфоидных клеток, обладает существенной практической значимостью. Значительный интерес для возможного практического применения имеют полученные в работе данные о секреции БТШ70 лимфоцитами. Они проливают свет на источник циркулирующего в организме сывороточного пула БТШ70, обладающего выраженным влиянием на развитие иммунных реакций. Можно предположить, что направленный контроль экзоцитоза БТШ70 лимфоидными клетками может служить основой для разработки нового подхода к проблеме иммунорегуляции. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют об информативности анализа уровня циркулирующей внеклеточной формы БТШ70 в качестве дополнительной физиологической характеристики организма и, в частности, иммунной системы.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 17-ой – 20-ой международных зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005-2008); на седьмой и восьмой международной иммунологической летней школе им. Дж. Хэмфри (Москва, 2005, 2007); на десятой и одиннадцатой научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006, 2007); на конференции – VIII чтения, посвященные памяти акад. Ю.А.Овчинникова (Москва, 2006); на 5-ом международном конгрессе по аутоиммунитету (Италия, 2006); на втором мировом конгрессе по стрессу (Венгрия, 2007); на 51-ой научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Москва, 2008); на 2-ой международной конференции «Современные информационные и телемедицинские технологии для здравоохранения» (Минск, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы (главы 1, 2, 3, 4, 5 и 6), экспериментальной части (главы 7 и 8), выводов и списка литературы. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков, 3 таблицы. Список литературы включает 132 источника, из которых 127 иностранных.
