Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. СИСТЕМА БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА 16
ГЛАВА 2. КЛЕТОЧНЫЙ СТРЕСС, БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО
ШОКА И АПОПТОЗ 30
ГЛАВА 3. БТШ И ИММУННЫЙ ОТВЕТ 50
ГЛАВА 4. ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ ПУЛ БТШ ВОЗМОЖНЫЕ
ПРОДУЦЕНТЫ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ БТШ И
ПРЕДПОЛАГАЕМЫЕ ФУНКЦИИ ЭТИХ ПРОТЕИНОВ 65
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 71
ГЛАВА 6. ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ЛИМФОИДНЫМИ КЛЕТКАМИ
6.1. Экспрессия БТШ в популяциях тимоцитов, спленоцитов,
клеток лимфатических узлов и костного мозга мыши 89
-
Экспрессия БТШ70 активированными Т-лимфоцитами 93
-
Экспрессия БТШ линиями лимфоидных клеток 95 ГЛАВА 7. ФЕНОМЕН ТРАНСЛОКАЦИИ БТШ НА
ПОВЕРХНОСТЬ АПОПТОЗНЫХ КЛЕТОК
7.1. Явление спонтанного апоптоза в культуре клеток
лимфомы EL4 103
7.2. Экспрессия БТШ на поверхности апоптозных клеток в
культуре лимфомы EL-4 111
7.3. Влияние плотности клеточной культуры на уровень
экспрессии поверхностных БТШ в пулах живых и
апоптозных клеток EL-4 113
7.4. Влияние стресса на процессы апоптоза и экспрессии
БТШ в культуре клеток EL-4 115
7.5. Транслокация БТШ на поверхность тимоцитов мыши
в процессе их программированной гибели 120
7.6. Влияние физиологических медиаторов стресса на апоптоз
и экспрессию БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток 127
7.7. Взаимосвязь основных внутриклеточных событий
процесса апоптоза с экспрессией БТШ 130
7.7.1. Модель спонтанного апоптоза в культуре клеток
лимфомы EL-4 in vitro 130
7.7.2. Модель спонтанного апоптоза тимоцитов мыши 143
ГЛАВА 8. ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ТРАНСЛОКАЦИИ
БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА НА ПОВЕРХНОСТЬ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК
8.1. Влияние ингибиторов транспорта и секреции
внутриклеточных протеинов на транслокацию БТШ70
на поверхность клеток лимфомы EL-4 150
8.2. Экспрессия поверхностных БТШ70 в моделях
гипертонического и гипотонического стресса клеток EL-4
и в условиях блокирования хлорных каналов
плазматических мембран 156
-
Экспрессия поверхностных БТШ70 клетками EL-4, стрессированными повреждающими значениями рН среды 163
-
Возможные причины и механизмы транслокации БТШ70 на клеточную поверхность в процессе апоптоза лимфоидных клеток 165
ГЛАВА 9. ФЕНОМЕН ЭКЗОЦИТОЗА БТШ70 В КУЛЬТУРАХ
АКТИВИРОВАННЫХ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК
9.1. Присутствие БТШ70 в супернатанте культуры EL-4 167
-
Внеклеточный пул БТШ70 в культуре КонА-активированных Т-лимфоцитов мыши
-
Влияние ингибиторов секреции протеинов на интенсивность экзоцитоза БТШ70 в культуре клеток лимфомы EL-4
-
Возможные механизмы экзоцитоза БТШ70 лимфоидными клетками
ГЛАВА 10. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭКЗОГЕННЫХ БТШ70 С ЛИМФОИДНЫМИ КЛЕТКАМИ
-
Взаимодействие БТШ70 с клеточной поверхностью и интернализация этих протеинов различными типами лимфоидных клеток
-
Протективный эффект экзогенных БТШ70 в культурах клеток
10.3. Возможные функции внеклеточного пула БТШ70
ГЛАВА 11. МОДЕЛЬ ИММУННОГО ОТВЕТА НА
ПОВЕРХНОСТНЫЕ И СЕКРЕТИРУЕМЫЕ БТШ70
-
Цитотоксическая реакция лимфоцитов на поверхностные БТШ70 опухолевых клеток
-
Возможные подходы к созданию противоопухолевых вакцин на основе секретируемых БТШ70
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Семейство белков теплового шока (БТШ) состоит из большой группы высококонсервативных протеинов, способствующих выживанию клеток в неблагоприятных условиях и интенсивно экспрессирующихся под действием разнообразных стрессирующих факторов. Защитное действие БТШ обусловлено их протективными свойствами, направленными на сохранение нормальной конформации и функциональной активности внутриклеточных протеинов, предотвращение их денатурации и агрегации. В нормальных условиях, в отсутствии стрессирующих воздействий, в клетках синтезируется значительно меньшее количество молекул БТШ. Эти, постоянно присутствующие в клетках, конститутивные БТШ выполняют в основном так называемые шаперонные, вспомогательные функции, обеспечивая процессы фолдинга, транспорта, репарации и утилизации внутриклеточных протеинов.
БТШ экспрессируются всеми типами клеток. У млекопитающих уровень экспрессии БТШ в разных тканях различается и не является стабильным, а зависит от широкого спектра факторов. Вариации уровня экспрессии БТШ могут быть связаны как с процессами нормальной жизнедеятельности клеток, так и с их защитными реакциями на те или иные, периодически возникающие изменения внешней среды. Очевидно, что лимфоидная ткань, характеризующаяся интенсивным клеточным обновлением и постоянным присутствием пулов мигрирующих и циркулирующих клеток, подвержена значительным метаболическим перестройкам и регулярным воздействиям изменяющихся условий микроокружения, в том числе и неблагоприятным для жизнедеятельности. С этих позиций очевидно, что для клеток лимфоидной ткани роль БТШ, обеспечивающих нормальное протекание большинства внутриклеточных процессов и обладающих протективными функциями, весьма значительна. Наряду с этим известно, что
БТШ обладают регулирующим действием на развитие программированной клеточной гибели, поэтому значимость функций БТШ в популяциях лимфоцитов связана также с важностью процессов апоптоза лимфоидных клеток для нормального функционирования иммунной системы.
Актуальность анализа вовлеченности БТШ в процессы, протекающие в лимфоидной ткани, связана не только с функциями внутриклеточного пула этих протеинов. В настоящее время существует много свидетельств о локализации БТШ на клеточной поверхности. Поверхностная локализация БТШ зарегистрирована, в частности, у инфицированных, трансформированных и апоптозных лимфоцитов. Было продемонстрировано, что БТШ, экспонирующиеся на клеточной поверхности, активируют цитотоксические эффекторы иммунной системы, т.е поверхностные БТШ могут являться для системы иммунологического надзора маркерами клеток, подлежащих элиминации. Причины и механизмы транслокации БТШ на клеточную поверхность пока не установлены, однако не вызывает сомнений, что появление в организме таких поверхностных протеинов вызывает реакцию иммунной системы, в частности лимфоидных клеток. Кроме этого, наряду с явлением необычной локализации БТШ на плазматической мембране, в настоящее время установлено, что во многих случаях БТШ могут находиться вне клеток в виде растворимого пула, попадающего в том числе и в кровоток. Вместе с тем известно, что экзогенные, внеклеточные БТШ способны взаимодействовать с клетками и проникать во внутриклеточное пространство. Причем, такие интернализованные БТШ сохраняют свои протективные функции и защищают клетки от гибели. В связи с этим очевидно, что наряду с внутриклеточными и поверхностными БТШ, внеклеточная форма этих протеинов также может оказывать влияние на функционирование популяций лимфоидных клеток.
В настоящее время интенсивно изучается иммуномодулирующее действие экзогенных БТШ в связи с обнаружением у этих протеинов уникальных адъювантных и иммуностимулирующих свойств. Установлено, что один из механизмов данного эффекта БТШ связан с активацией антигенпредставляющих клеток. В то же время, анализ описанных эффектов БТШ указывает на то, что зарегистрированные иммуномодулирующие свойства экзогенных БТШ могут быть связаны с действием этих протеинов не только на антигенпредставляющие клетки, но и на популяции лимфоцитов.
Таким образом, накопленные в последнее время данные свидетельствуют о том, что молекулы БТШ участвуют во многих иммунных процессах, в том числе связанных с функционированием популяций лимфоидных клеток, и обладают при этом полифункциональной активностью. Однако в настоящее время эта тематика остается малоизученной. С целью расширения существующих представлений о функциях, выполняемых БТШ в лимфоидной ткани, и механизмах реализации данных функций в настоящей работе были проведены исследования вовлеченности БТШ в процессы, протекающие в популяциях лимфоцитов. Основное внимание уделялось одному из главных представителей большого семейства БТШ, протеину с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70).
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Анализ вовлеченности БТШ в процессы активации и программированной гибели лимфоидных клеток, выявление поверхностного и внеклеточного пулов БТШ в культурах лимфоцитов и изучение взаимодействия этих протеинов с клетками иммунной системы.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. В экспериментальной модели с использованием мышей разных линий провести анализ содержания БТШ70 в клетках различных лимфоидных органов.
Проанализировать изменение уровня экспрессии БТШ70 в процессе активации лимфоцитов.
Провести сравнение содержания БТШ в живых и апоптозных лимфоидных клетках.
Провести исследование взаимосвязи содержания и локализации БТШ70 в лимфоцитах с ключевыми внутриклеточными событиями их программированной гибели на последовательных этапах ее развития.
Провести анализ поверхностной локализации БТШ в культурах лимфоидных клеток и исследование причин и механизмов транслокации этих протеинов на клеточную поверхность.
Изучить влияние физиологических медиаторов стресса - катехоламинов и глюкокортикоидов на уровень экспрессии БТШ70 лимфоидными клетками.
Протестировать присутствие внеклеточного пула БТШ70 в культурах лимфоидных клеток и проанализировать механизмы продукции этих протеинов в межклеточное пространство.
Охарактеризовать возможные функции внеклеточного пула БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые было продемонстрировано различие уровня экспрессии БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток различной органной локализации. Обнаружено изменение уровня экспрессии БТШ70 в лимфоцитах под действием физиологических медиаторов стресса катехоламинов и глюкокортикоидов, а также охарактеризовано изменение этого уровня при воздействии на клетки различными стрессирующими факторами микроокружения. Разработан оригинальный цитофлуориметрический подход к анализу последовательных этапов апоптоза лимфоидных клеток, и с помощью данного подхода изучена взаимосвязь экспрессии БТШ70 с основными внутриклеточными событиями на разных стадиях развития программированной гибели лимфоцитов. Проанализирован процесс транслокации цитоплазматических БТШ70 на поверхность лимфоцитов. Наряду с перечисленными данными, характеризующими внутриклеточный и поверхностный пулы БТШ, были получены свидетельства о продукции БТШ70 в межклеточное пространство в культурах активированных Т-лимфоцитов и опухолевых лимфоидных клеток. Обнаружено парадоксальное влияние ингибиторов аппарат Гольджи зависимой секреции протеинов на экзоцитоз БТШ70 и их транслокацию на поверхность лимфоидных клеток, свидетельствующее о неклассическом пути транспорта и секреции этих протеинов. Впервые продемонстрировано взаимодействие внеклеточных экзогенных БТШ70 с лимфоцитами различного органного происхождения, заключающееся в адсорбции этих протеинов на клеточной поверхности и их последующей интернализации живыми клетками. Получены свидетельства о протективных свойствах внеклеточных БТШ70 в популяциях лимфоцитов.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
Полученные результаты расширяют существующие представления о роли БТШ в функционировании иммунной системы. Высоким уровнем значимости для экспериментальной и клинической иммунологии обладают оригинальные данные о регулирующем действии адреналина и дексаметазона на интенсивность синтеза БТШ70 в популяции лимфоцитов. Зарегистрированные эффекты свидетельствуют о вовлеченности БТШ70 в механизмы нейроэндокринной регуляции иммунной системы. Весьма существенным для практической значимости данной работы является охарактеризованный процесс транслокации внутриклеточных БТШ на поверхность погибающих клеток и полученные свидетельства о выходе этих протеинов в межклеточное пространство. Эти результаты, вместе с существующими сведениями об участии БТШ в развитии целого ряда аутоиммунных патологий, могут лечь в основу создания новых подходов к диагностике и терапии различных иммунологических заболеваний. Значительный интерес для возможного практического применения имеют также полученные в работе данные о продукции БТШ70 активированными лимфоцитами в окружающую среду. Они указывают на один из возможных источников внеклеточного пула БТШ70, обладающих выраженным влиянием на развитие иммунных реакций. Можно предположить, что направленный контроль экзоцитоза БТШ70 лимфоидными клетками будет служить основой для разработки нового подхода к проблеме иммунорегуляции. Наряду с этим, охарактеризованное в работе взаимодействие экзогенных БТШ70 с лимфоидными клетками, может явиться основой для использования данных протеинов с целью направленной коррекции иммунного ответа.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Уровень экспрессии БТШ лимфоидными клетками зависит от их органной локализации и изменяется под действием активации лимфоцитов, физиологических медиаторов стресса и стрессирующих факторов микроокружения. По уровню содержания БТШ70 клетки разных лимфоидных органов различаются и характеризуются увеличением этого показателя в ряду тимус<селезенка<лимфатические узлы<костный мозг. Кон-А активация Т-лимфоцитов сопровождается усилением экспрессии БТШ70. Физиологические медиаторы стресса адреналин и глюкокортикоиды изменяют уровень экспрессии БТШ70 лимфоцитами, причем адреналин стимулирует синтез этих протеинов, а дексаметазон его ингибирует.
Процесс программированной гибели лимфоидных клеток сопровождается транслокацией цитоплазматических БТШ на клеточную поверхность. Клетки лимфомы EL-4 и КонА-активированные Т-лимфоциты, исходно экспрессирующие поверхностные БТШ, значительно усиливают уровень этой экспрессии в процессе апоптоза. Неактивированные лимфоциты, выделенные из разных лимфоидных органов, характеризуются присутствием БТШ только на поверхности клеток, погибших по программе апоптоза. Уровень экспрессии внутриклеточных и поверхностных БТШ70 различается для разных стадий клеточной гибели, достигая максимума на необратимом этапе апоптоза, характеризующемся деполяризацией митохондрий. Это свидетельствует об участии БТШ в реализации программы клеточной гибели на ее терминальных стадиях.
Клетки лимфомы EL-4 и КонА-активированные Т-лимфоциты продуцируют БТШ70 в межклеточное пространство. Об этом свидетельствует присутствие данных протеинов в супернатанте культур данных клеток. Продукция внеклеточного пула БТШ70 является активным процессом и не связана с возможной примесью в культуре разрушенных некротических клеток. Интенсивность экзоцитоза БТШ70 клетками EL-4, культивируемыми в стандартных условиях, равна примерно 5-Ю мкг на 106 клеток за 24 часа. Пул внеклеточных БТШ70 содержит как конститутивную, так и индуцируемую форму этих протеинов.
Ингибиторы аппарат Гольджи зависимого пути секреции протеинов моненсин и брефелдин А не блокируют, а существенно усиливают транслокацию БТШ70 на клеточную поверхность и интенсивность экзоцитоза данных протеинов. Это свидетельствует о неклассическом, аппарат Гольджи независимом пути транспорта цитоплазматических БТШ70 из клеток. Механизм формирования внеклеточного пула БТШ70 может быть связан со сбрасыванием («шеддингом») этих протеинов с клеточной поверхности в окружающую среду и с продукцией лимфоидными клетками в межклеточное пространство экзосом.
Поверхностные и внеклеточные БТШ70 взаимодействуют с клетками иммунной системы. Об этом свидетельствует направленная реакция цитотоксических лимфоцитов на опухолевые клетки, экспонирующие на своей поверхности БТШ70, а также связывание и последующая интернализация экзогенных БТШ70 различными типами лимфоидных клеток. Интернализация внеклеточных БТШ70 защищает лимфоциты от спонтанного и индуцированного апоптоза и от стрессирующего воздействия дефицита аутокринных факторов. Активное взаимодействие внеклеточного пула БТШ70 с популяциями лимфоидных клеток является одним из механизмов иммуномодулирующего действия данных протеинов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Материалы диссертации доложены на 10-м международном иммунологическом конгрессе (Дели, 1998), на шестом ежегодном конгрессе Британского иммунологического общества (Лондон, 1998), на 2, 4 и 5 конгрессах «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 1998, 2001, 2002), на чтениях, посвященных памяти Ю.А.Овчинникова (Москва, 1998, 2000, 2002), на международных иммунологических летних школах им. Дж. Хэмфри (Пущино, 1998, 2000, 2002), на научных конференциях "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003), на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), на 11-ом международном иммунологическом конгрессе (Стокгольм, 2001), на школах-конференциях «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2001, 2002).
ПУБЛИКАЦИИ
По теме диссертации опубликовано 44 научных работы.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзора литератур (главы 1-4), материалы и методы (глава 5), результаты исследований и их обсуждение (главы 6-11), выводы, список литературы. Работа изложена на 224 страницах машинописного текста, содержит 55 рисунков, 4 таблицы. Список литературы включает 257 источников, из которых 253 иностранных.
