Содержание к диссертации
Список сокращений 5
Введение 6
Глава 1. Обзор литературы 11
Формирование и структура плаценты при физиологической беременности 11
Морфология клеток трофобласта и пути их
дифференцировки 16
Специфические маркеры клеток трофобласта 19
Особенности взаимодействия матки и трофобласта при имплантации 22
Функции плаценты 27
Механизмы, обеспечивающие иммунную толерантность при беременности 29
Особенности иммунной системы матери и новорожденного 38
Лейкоциты децидуальной оболочки и их роль при
беременности 43
1.9 Особенности продукции цитокинов и факторов роста на материнско-
эмбриональном интерфейсе 47
1.10 Цитокиновый сдвиг Thl/Th2 при беременности 52
Глава 2. Материалы и методы 60
Объект исследования 60
Моноклональные антитела и интерлейкины 60
Питательные среды для культур клеток 61
Реагенты 62
Методы исследования 64
2.5.1 Выделение клеток цитотрофобласта 64
Оценка чистоты выделения клеток цитотрофобласта 66
Стерильный забор пуповинной и венозной крови 67
Выделение мононуклеарных клеток крови и приготовление клеточных суспензий 67
Определение количества Т-лимфоцитов продуцентов ИНФ-у и ИЛ-4 в культурах клеток новорожденных и взрослых 68
Оценка изменения количества Т-лимфоцитов продуцентов ИНФ-у, ИЛ-2 и ИЛ-4 при различных условиях активации в культурах клеток новорожденных и взрослых 70
Исследование динамики популяционного состава и функциональных свойств Т-лимфоцитов новорожденных и взрослых при различных условиях активации в культуре клеток 70
Оценка уровня апоптоза в культурах МНПК новорожденных и взрослых при различных условиях активации 72
Оценка изменения субпопуляционного состава и количества Т-лимфоцитов продуцентов ИНФ-у, ИЛ-2 и ИЛ-4 в культурах клеток новорожденных и взрослых при совместном культивировании с клетками цитотрофобласта 72
Оценка уровня продукции ИНФ-у Т-лимфоцитами новорожденных и взрослых при совместном культивировании с клетками цитотрофобласта 73
Статистическая обработка данных 74
Глав 3. Результаты исследования 15
Отработка метода выделения и культивирования клеток цитотрофобласта человека. Оценка чистоты выделения 75
Оценка количества Т-лимфоцитов, продуцирующих ИНФ-у, ИЛ-2 и ИЛ-4, в культурах клеток новорожденных и взрослых, влияние условий культивирования на этот параметр 82
Динамика субпопуляционного состава и функциональных свойств Т-лимфоцитов новорожденных и взрослых при различных условиях активации в культуре клеток 99
Действие клеток цитотрофобласта на количество Т-лимфоцитов продуцентов ИЛ-2, ИЛ-4 и ИНФ-у в культурах МНПК взрослых и новорожденных при различных условиях активации 114
Действие клеток цитотрофобласта на динамику субпопуляционного состава и функциональные свойства Т-лимфоцитов новорожденных и взрослых в культуре клеток 128
Действие клеток цитотрофобласта на уровень продукции ИНФ-у in vitro при совместном культивировании с Т-лимфоцитами новорожденных и
взрослых 138
Глава 4. Обсуждение результатов 146
Выводы 153
Список литературы 154
Список сокращений
ИЛ — интерлейкин
мкА - моноклональные антитела
HLA - главный комплекс ги сто совместимости
РЕ - фикоэритрин
FITC - флуоресцеинизотиоционат
МНПК - мононуклеарные клетки периферической крови
NK - натуральные киллеры
TCR - Т-клеточный рецептор
ТЫ -Т-хелперы 1 типа
Th2 - Т-хелперы 2 типа
ИНФ - интерферон
Ig - иммуноглобулин
Введение к работе
Условия, позволяющие человеческому плоду избегать отторжения иммунной системой матери, представляют предмет интенсивных исследований в течение последних десятилетий. Плод, имеющий половину чужих для матери, отцовских генов, ведет себя как полуаллотрансплантат по отношению к иммунной системе матери и должен неминуемо вызывать материнский иммунный ответ и, как следствие, реакцию отторжения. Однако в норме отторжения не происходит, и, вместо этого, имеет место процесс развития толерантности материнской иммунной системы к зародышу. Иммунная система плода также не реализует программу реакций «трансплантат против хозяина». Механизмы, обеспечивающие эту взаимную толерантность, локализуются в первую очередь на главном участке иммунного взаимодействия между плодом и матерью - материнско-эмбриональном интерфейсе. Плацента и плацентарные мембраны составляют барьер между иммунной системой матери и плода, поэтому большинство иммунных взаимодействий происходит не с плодом, а с клетками плаценты. Благодаря работам последних лет доказана центральная роль клеток трофобласта плаценты в предотвращении иммунологического конфликта при беременности, определены основные пути воздействия барьерных клеток плаценты на контактирующие с ними клетки иммунной системы, изучены изменения состава лимфоидных клеток матки. Однако, несмотря на большое количество работ, посвященных исследованию иммунологической толерантности при беременности, многие важные аспекты защитной функции плаценты остаются неисследованными. В первую очередь, до сих пор нет ясности относительно масштабов реализации отдельных защитных механизмов и их значимости в успехе развития беременности. Кроме того, характер действия защитных механизмов на Т-клетки плода не был
исследован, хотя известно, что лимфоциты плода на поздних стадиях беременности способны проникать через плацентарный барьер. Данная работа посвящена исследованию действия клеток цитотрофобласта плаценты и его растворимых продуктов на процесс функционального созревания Т-лимфоцитов периферии иммунной системы и на продукцию цитокинов Т-клетками. Мы попытались раздельно проанализировать действие цитотрофобласта на эти два параметра - на собственно созревание Т-клеток, способных продуцировать цитокины, и на их функцию, т.е. продукцию цитокинов. Поскольку продукция цитокинов Т-лимфоцитами новорожденных имеет ряд существенных, но мало исследованных особенностей, на первом этапе работы потребовалось не только разработать методы оценки процессов созревания цитокинопродуцентов в условиях культуры клеток, но и провести сравнительное исследование функциональных свойств лимфоцитов новорожденных и взрослых. Лишь после выполнения этой работы мы получили возможность исследовать действие клеток цитотрофобласта на созревание продуцирующих цитокины Т-клеток и на выполнение этими клетками специфических функций.
Актуальность проблемы
Исследование действия плаценты на клетки иммунной системы матери и плода представляется актуальной задачей в связи с широким распространением и тяжелыми клиническими последствиями таких патологий беременности, как преэклампсия, задержка роста плода, невынашивание беременности и привычные выкидыши. По современным представлениям, важную или основную роль в патогенезе этих патологических состояний играет иммунологический конфликт на границе раздела организмов матери и плода. Значимость нарушений отдельных иммунорегуляторных механизмов в формировании патологий беременности
до сих пор остается не вполне ясной. Однако накопленные данные свидетельствуют о бесспорной роли неадекватных изменений цитокинопродукции в патогенезе таких патологий как бесплодие и привычное невынашивание беременности. Поэтому в нынешней демографической ситуации исследование иммунологических механизмов, обеспечивающих нормальное развитие беременности, приобретает особое значение. Кроме того, изучение особенностей функционального состояния Т-клеточного звена иммунной системы новорожденных детей в современных условиях снижения резистентности детей к инфекциям, также является чрезвычайно актуальной и социально значимой проблемой.
Цель исследования
Исследовать особенности продукции наиболее значимых при беременности цитокинов Т-лимфоцитами новорожденных и изучить действие клеток плаценты человека на продукцию цитокинов Т-лимфоцитами беременных женщин и новорожденных детей.
Задачи исследования
Получить культуры клеток хориона плаценты человека, оценить клеточный состав и чистоту полученных культур.
Исследовать особенности продукции Т-лимфоцитами новорожденных интерферона-у, интерлейкина-2 и -4.
Изучить динамику субпопуляционного состава и функциональных свойств Т-лимфоцитов новорожденных и взрослых при культивировании в различных условиях активации, оценить влияние интерлейкина-7 на этот параметр.
Исследовать действие клеток плаценты и их растворимых продуктов на динамику субпопуляционного состава и количество Т-лимфоцитов, способных продуцировать интерферон-у, интерлейкин-2 и -4, в культурах клеток крови новорожденных и беременных женщин при различных условиях активации.
Оценить действие клеток трофобласта и их растворимых продуктов на уровень продукции интерферона-у Т-лимфоцитами беременных и новорожденных.
Научная новизна
В данной работе нами было проведено исследование особенностей продукции цитокинов Т-лимфоцитами новорожденных. Установлено, что пуповинная кровь новорожденных исходно содержит существенно меньшее количество Т-клеток продуцентов ИНФ-у, т.е. зрелых Т-клеток с профилем цитокинопродукции 1 типа (далее — Т-клетки 1 типа), по сравнению с кровью взрослых. При этом показано, что при длительном культивировании МНПК, активированных ИЛ-7 и антителами к CD3, происходит увеличение количества цитокинопродуцентов за счет созревания лимфоцитов до стадии терминально дифференцированных эффекторных Т-клеток памяти. С помощью высокоочищенных клеток цитотрофобласта проведено исследование действия клеток трофобласта на продукцию цитокинов Т-лимфоцитами новорожденных и беременных женщин. В ходе исследований был установлен сложный характер влияния клеток цитотрофобласта на количество зрелых Т-клеток с профилем цитокинопродукции 1 и 2 типа и на их функцию, т.е. продукцию цитокинов. Установлено, что клетки цитотрофобласта лишь частично ослабляют процесс созревания Т-клеток 1 типа, продуцирующих ИНФ-у и ИЛ-2. В то же время клетки цитотрофобласта и их растворимые продукты вызывают глубокое подавление функции Т-
клеток 1 типа, проявляющееся в существенном снижении секреции опасного
для беременности ИНФ-у. Установлено, что ингибирование продукции ИНФ-
^: у, вызванное клетками цитотрофобласта и его растворимыми продуктами,
носит обратимый характер. Таким образом, показано, что клетки трофобласта хорионального участка плаценты по отношению к Т-лимфоцитам проявляют сложную регуляторную активность направленную, в первую очередь, на ограничение реализации опасных для плаценты функций Т-клеток, относительно слабо влияя на процессы, определяющие численность функциональных групп Т-лимфоцитов.
^ Практическая значимость
Исследование носит фундаментальный характер и направлено на
получение новых знаний о механизмах, обусловливающих
иммунологическую толерантность матери и плода при нормально
протекающей беременности. Данная область еще недостаточно изучена и
требует дополнительных исследований. Получение новых данных о
защитных механизмах, реализуемых плацентой, необходимо для понимания
W процессов взаимодействия клеток иммунной системы и плацентарного
барьера при нормальной беременности, а также для разработки методов
^ диагностики и коррекции патологий беременности, в основе которых лежат
нарушения иммунных процессов.
![Изучение влияния [Г]-D-глутаминил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку и функциональную активность лимфоцитов](/i/i/4503/301534.png "Изучение влияния [Г]-D-глутаминил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку и функциональную активность лимфоцитов Петров Александр Владимирович")
