Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА I.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1.Биотехнологические аспекты культивирования и получения биологически активных компонентов патогенных бактерий
1.2.Питательные среды и условия культивирования возбудителя туляремии
ТЗ.Основные антигенные компоненты туляремийного микроба
Стр. 6
ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3.
КОНСТРУИРОВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И ОПРЕДЕЛЕНИЕ АДЕКВАТНЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ ДЛЯ МАКСИМАЛЬНОГО ВЫХОДА БИОМАССЫ И АНТИГЕННЫХ КОМПОНЕНТОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА
-
Подбор и конструирование питательных сред для максимального выхода биомассы туляремийного микроба
-
Оптимизация условий культивирования туляремийного микроба для максимального выхода «С»-комплекса.
ГЛАВА 4. БИОКИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КУЛЬТУР
ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА В ПРОЦЕССЕ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КЛЕТОК
4.1. Характеристика биомассы туляремийного микроба, полученной в условиях глубинного культивирования по
биологическим и иммунохимическим показателям.
4.2, Разработка способов выделения и очистки антигенных 74
компонентов туляремийного микроба.
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТИВНОСТИ, ИММУНО- И БИО-
ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ «С»-КОМПЛЕКСА ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА.
5.1. Изучение биохимических и иммунохимических 85
свойств «С»- комплекса туляремийного микроба.
5.2. Анализ иммуногенности «С»-комплекса туляремийно- 93
го микроба
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Актуальность проблемы профилактики туляремии определяется наличием природных очагов этой инфекции на всей территории Российской Федерации, эпизоотическая активность которых ежегодно подтверждается обнаружением значительного числа положительных на туляремию проб из объектов внешней среды. С 1996 по 1998 г было выделено более 200 штаммов возбудителя туляремии от носителей и переносчиков инфекции и из внешней среды [Приказ Минздрава России № 125 от 14. 04.99].
Природные очаги туляремия существуют в большинстве Европейских стран. В некоторых регионах, например в Скандинавии, вспышки, включающие сотни случаев отмечаются, по крайней мере, один раз в десятилетие, В других странах, эпидемии такой величины случаются довольно редко, за исключением периода военных конфликтов [Berdai В. P., Grunov R., et al, 2000; Reintjes R., Dedushaj I., Grunow R., et al, 2002]. В межэпизоотический период, естественный резервуар возбудителя -Francisella tularensis, неизвестен. Возможно, микроорганизм переживает неблагоприятные условия внутриклеточно в простейших или в виде персистирующей формы внутри макроорганизма. Установлена приуроченность туляремии к ландшафтам с естественными водоёмами [Tarnvik A., et al., 2004].
В Европе и Азии распространены штаммы голарктической расы, тогда как неарктическая раса характерна для Северной Америки, где некоторые штаммы туляремии могут вызвать скоротечное заболевание с летальным исходом, особенно при аэрозольном заражении. Это свойство возбудителя было использовано при разработке биологического оружия [Ales N.C, Katial R.K., 2004], ив настоящее время туляремия считается потенциальным средством биотерроризма [Gallagher-Smith М., et al, 2004; Conlan J.W., 2004]. Согласно классификации биологических агентов туляремия отнесена к категории А вместе с такими инфекциями как чума, сибирская язва и оспа [Алексеев В. В. и др., 2003].
В России ежегодно регистрируется от 100 до 400 случаев заболеваний туляремией, при этом около 70,5 % из них приходится па Северный, Центральный и Запад- ио-Сибирский районы. В 1993-1998 г вспышки туляремии трансмиссивного характера зарегистрированы среди населения в Ростовской области и в Башкирии, водного в Смоленской области, промыслового в Оренбургской области, пищевого (молочного) -в Москве. В 1999 г, заболевания туляремией встречались на 20 административных территориях [Карцев А. Д., 2002]. В 2003 г. число заболеваний туляремией возросло -27 случаев в 12 субъектах федерации против 23 заболеваний в 2002 г. [Резолюция межведомственного совещания по проблемам санитарно-эпидемиологической охраны территории Российской Федерации, 2003]. В Краснодарском крас с 1988 по 2004 г. зарегистрировано 20 заболеваний туляремией: 12 человек из села; 8 - из города; в осенне-зимний период во время эпизоотии среди мелких млекопитающих. В 55% случаев наблюдался сельскохозяйственный и охотничье-промысловый тин заражения. Из всех заболевших двое были привиты: первый за 2 года, второй - за 3 [Антонов А.В., 2004]. За последние 15 лет на территории Ульяновской области зарегистрировано 72% больных туляремией от общего числа случаев заболеваемости особо опасными инфекциями [Нафеев А. А. 2003]. В Саратовской области из 38 районов 25 являются неблагополучными по туляремии. Особенностью заболеваемости туляремией в настоящее время является то, что среди заболевших более 70% составляют не привитые против этой инфекции городские жители [Онищенко Г. Г., 2001]. По данным ЦГСЭН Саратовской области за 2003 г. положительные ответы в реакциях термопре-иипитации отмечены у 10 из 15 (66,6%) обследованных [Данилов А. Н. и др., 2004]. Спорадический характер заболевания свидетельствует об активности природных очагов и об уменьшении иммунной прослойки среди населения, проживающего в пределах природного очага, возможно за счёт неучтенной миграции населения [Антонов А.В., 2004]. В связи с этим немаловажное значение приобретают данные об активности природных очагов в приграничных регионах.
В течение 1992-2001 в Казахстане было отмечено 31 случай туляремии. Эпидемиологический анализ показал, что инфекция передавалась различными путями, включая укусы зараженных насекомых, поглощение зараженной пищи и воды и прямым контактом при снятии кожи животных [Meka-Mechenko Т., et at., 2003]. Болезнь была представлена главным образом ангинозио-бубонной (62,5%), бубонной (25,0%) или легочной (12,5%) формами. Fla сегодняшний день в России для профилактики туляремии используют живую вакцину на основе штамма F. tularensis 15 линии НИИЭГ, которая является одной из немногих бактериальных вакцин, создающих стойкий и длительный (более 5 лет) иммунитет. За рубежом для вакцинации используют штамм F. tularensis LVS, являющийся стабильной недиссоциирующей субкультурой в RS форме полученной из штамма F. tularensis 15 в начале 60-х годов [Eigelsbach Н.Т., Downs С. М., 1961]. В СССР иммунизацию населения живой туляремийной вакциной по показаниям и плановую проводят с 1946 года [Олсуфьев Н.Г., 1975]. Несмотря на отмечаемые побочные реакции на введение живой туляремийной вакцины (лихорадочные реакции, головная боль, лимфадениты и т. д.) и соответствующие противопоказания (аллергические и инфекционные заболевания, беременность, болезни кровообращения), более эффективного средства специфической профилактики на сегодняшний день не существует [Олсуфьев Н. Г., Руднева Г. П., 1960; Sjostedt А., 2003].
Вакцины, используемые до настоящего времени в большинстве стран мира содержат практически полный набор антигенов свойственных данному возбудителю при культивировании на питательных средах. Причем, наряду с веществами, определяющими протективный эффект, вакцины содержат также компоненты, обуславливающие реактогенность препарата или являющиеся балластом, и их вклад в развитие иммунной реакции может тормозить ответ макроорганизма на введение протектив-ных антигенов [Станиславский Е. С, 1976; Маянский А. Н., 1977]. Всех этих недостатков в какой-то степени лишены химические вакцины, при получении которых возможно создавать в готовых препаратах рациональные композиции протективных антигенов [Дальвадянц С. М, 1991; Дальвадянц С. М. и др., 1997]. Развитие живых вакцин нового поколения (генноинженерных) затруднено, поскольку существуют в настоящее время очень жесткие стандарты для таких препаратов. Кроме того, нет доступных лицензированных живых вакцин во многих странах. Таким образом, более перспективным является создание и развитие субъединичных вакцин [Магазов Р. Ш.
2000], хотя эта работа в отношении туляремийной инфекции более сложная, чем разработка таких препаратов против чумы и сибирской язвы, поскольку для последних установлены и охарактеризованы нротективные антигены. У F, tularensis к настоящему времени не определены иммуно доминантные антигены и специфические вирулентные детерминанты [Sjostedt А., 2003]. В качестве химической вакцины могут быть использованы поверхностные структуры F. tularensis, в частности белки внешней мембраны. Установлено, что препараты внешней мембраны обладают протектив-ной активностью для белых мышей и морских свинок [Хлебников В. С, Головлев И. Р., Чугунов А. М, 1994]. Было показано что антигенные компоненты внешней мембраны оказывают выраженный иммуно модулирующий эффект на разные формы функциональной активности макрофагов [Скатов Д. В., Хлебников В. С, 1993]. Наряду с попытками создания химической вакцины проводятся исследования по разработке более совершенной живой и субъединичной вакцин [Conlan J.W., 2004].
При детальном изучении механизмов повышенной устойчивости к инфекции после введения туляремийной вакцины был выявлен ее иммуномодулирующий эффект [Kartunen R,, et at., 1991]. Эти данные на фоне многочисленных поисков общих антигенов, которые были найдены в последнее время практически у всех взятых на исследование грам отрицательных микроорганизмов, дают дополнительные объяснения появлению в печати разрозненных сообщений об эффективности туляремийной вакцины для повышения устойчивости к гетерологичным инфекциям, у которых клеточное звено играет существенную роль в специфическом иммунитете [Koskela Р., Herva Е., 1982; Илюхин В. И. и др., 2000]. Так, сотрудниками института «Микроб» в опытах на белых мышах было установлено формирование под влиянием иммунизации живой туляремийной вакциной перекрестного иммунитета против чумы [Васенин А. С, Вейнблат В. И., Самойлова Л. В., 1980].
В связи с вышеизложенным, представляется важной задачей выявление и разработка методов получения протекти в пых компонентов туляремийного микроба, которые могут быть использованы при конструировании низкореактогенной химичс- ской туляремийной вакцины и, возможно, комплексной вакцины для сочстанной специфической профилактики нескольких особо опасных инфекций.
Накопленные данные о синтезе антигенных структур возбудителя туляремии свидетельствуют о существенной роли компонентного состава питательных сред и условий культивирования в формировании и количественном накоплении отдельных поверхностных структур клетки, обладающих протективнои активностью. Прежде всего, к таким структурам относится гликопротеидный «С»-комплекс («С» от «слизистый») [Жемчугов В.Е. и др., 2004], содержащий в своем составе известные белковые компоненты туляремийного микроба и липополисахаридную часть. В связи с этим, изучение уровня синтеза и условий культивирования, способствующих максимальному накоплению «С»-комгатекса, является актуальной научно-практической задачей. Не меньшее значение имеет разработка схемы и выбор современных методов биосепарации при получения «С»-комплекса в его наиболее очищенном и иммунологии е-ски активном состоянии.
Цель исследования. Создать оптимальную схему глубинного культивирования туляремийного микроба для получения протективного антигенного «С»-комплекса, разработать методы его выделения и очистки, изучить иммунологическую эффективность.
Задачи исследования:
Определить оптимальный состав питательных сред и физико-химических условий глубинного культивирования туляремийного микроба для получения максимального выхода биомассы и протективного «С»-комплекса.
Изучить биокинетические особенности культур туляремийного микроба в процессе глубинного культивирования на основе анализа биологических и физико-химических данных, а также расчета формализованных показателей.
Разработать эффективный способ глубинного культивирования и оптимальный алгоритм проведения процесса выращивания вакцинного штамма туляремийного микроба для получения биомассы и протективного «С»-комплекса.
Разработать оптимальную биотехнологическую схему получения и очистки протективного «С»-комплекса туляремийного микроба из клеточной массы и культу-ральной жидкости, а также и методы его количественного определения.
Изучить антигенные, биохимические, физико-химические и электронно микроскопические особенности препаратов «С»-комплекса. Провести сравнительный анализ препаратов, полученных из биомассы вакцинного и вирулентного штаммов туляремийного микроба. Оценить протективнуго активность «С»-комплекса в отношении высоковирулентных штаммов возбудителя туляремии голарктической и неарктической расы.
Провести сравнительный анализ влияния иммунизации «С»-комплексом и живой туляремийной вакциной на показатели клеточного звена иммунитета у лабораторных животных.
Научная новизна исследования.
Впервые изучены биокинетические свойства культур вакцинного штамма туляремийного микроба и особенности синтеза им протективного «С»-комготекса при глубинном выращивании в сложных многокомпонентных питательных средах, послужившие основой для разработки оптимального алгоритма проведения процессов культивирования. Впервые, на основании комбинации методов изоэлектрической преципитации и баромембранного разделения биологических молекул, разработан способ получения «С»-комплекса туляремийного микроба из клеточной массы и культуралыгой жидкости.
Впервые, с использованием иммунноэлектронной микроскопии с антителами к «С»-комплексу, мечеными коллоидным серебром показано, что данный антиген представляет собой надоболочечнуто структуру клеток возбудителя туляремии. Впервые показано, что «С»-комплекс интенсивно синтезируется культурами туляремийного микроба на сложных по составу питательных средах, обогащенных факторами роста и обеспечивающих высокую скорость размножения популяции возбудителя. Впервые проведен полный биохимический и иммунохимический анализ «С»-комплекса, показавший, что препарат содержит белковый, углеводный и липидный компоненты в со- отношении частей, соответственно - 2:1:1. Впервые показана идентичность компонентного состава и иммунобиологических свойств препаратов «С»-комплексов, полученных из вакцинного и вирулентного штаммов возбудителя туляремии, что позволяет использовать в техтгологии его получения только культуры вакцинного штамма. На экспериментальных биологических моделях (белых мышах) показано, что «С»-комплекс туляремийного микроба защищает животных от заражения высоко вирулентными штаммами возбудителя туляремии голарктической и неарктической расы в дозах соответственно по ЕД5о 630 и 280 мкг. Изучена динамика антителообразования у белых мышей в процессе развития гуморального иммунитета, выявлен положительный аллергический ответ у животных, иммунизированных «С»-комплексом. Показа-Его, что антигенный комплекс инициирует активацию макрофагов белых мышей in vitro в ГЮТ-тесте, не индуцирует явление апоптоза у тимоцитов и спленоцитов белых мышей, что свидетельствует о его низкой реактогенности.
Практическая ценность.
Разработана технологическая схема глубинного культивирования туляремийного микроба в ферментере, включающая использование питательной среды сбалансированного компонентного состава - бульон FT, оптимизированные по длительности и количеству микробных клеток этапы подготовки посевного материала, алгоритм проведения процесса глубинного культивирования возбудителя. Показано, что наиболее эффективным методом глубинного культивирования туляремийного микроба является отьемно-доливной или метод «фазовой культуры», обеспечивающий наибольший выход клеточной массы и возможность проведения многочисленных последовательных циклов выращивания в одном ферментере без снижения конечной концентрации микробных клеток. Отработаны количественные и временные параметры реализации отъемно-доливного метода культивирования туляремийного микроба. Разработана схема получения протективного «С»-комплекса из клеточной массы и культуральной жидкости возбудителя туляремии с использованием методов изоолек-трической преципитации и ультрафильтрационной очистки. Разработаны методы количественного определения «С»-комплекса в процессе глубинного культивирования, на этапах выделения и очистки препарата в реакциях ДОТ-ИФА, РДП, иммунолгами-несцентном анализе с использованием полученных гипериммунных кроличьих сывороток и моноклональных антител. Результаты иммунологических исследований по показателям протективной активности, реактогенности и безвредности позволяют рекомендовать «С«-комплекс в качестве компонента химической туляремийной вакцины.
По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Аппаратное культивирование туляремийного микроба». Методические рекомендации одобрены Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол №5 от 25.06.04 г.) и утверждены директором Кутыревым В.В. 28.06.04 г. Полученные в результате работы новые данные об особенностях культивирования туляремийного микроба и свойствах поверхностного «С»-комплекса используются на курсах специализации и усовершенствования врачей и биологов в институте «Микроб» при чтении лекций по общей микробиологии.
Апробация работы.
Материалы, изложенные в диссертации, были представлены и обсуждались на: ежегодных итоговых научно-практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" «Итоги фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб», 2002-2004 гг; 4 Международной конференции по туляремии, Великобритания, г. Бас (Bath), 2003 г; IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине», г. Казань, 2004 г; Российской научной конференции «Медицинская микробиология - XXI век», г. Саратов, 2004 г.; Юбилейной научной конференции «Новые технологии в профилактике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», г. Нижний Новгород, 2004 г.
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных работах.
На защиту выносятся следующие основные положения:
1) Изучены биокинетические характеристики роста культур туляремийного микроба и динамика синтеза протективного «С»-комплскса при выращивании в уело- виях глубинного культивирования, послужившие основой для выбора оптимальных условий моссообмена в реакторе и наиболее эффективной питательной среде FT.
Разработана оптимальная схема культивирования вакцинного штамма туля-ремийного микроба для максимального получения биомассы и «С»-комплекса, основанная на использовании принципа глубинной отъемно-доливной или «фазовой» культуры.
Предложен комплекс методов биосенарации для выделения «С»-комплекса из клеток и культуральнои жидкости в препаративных количествах и последующей очистки, основанный на комбинации способов изоэлектрической преципитации, мембранной и ультрафильтрации. Разработаны методы количественного определения «С»-комплекса на основе использования полученных специфических сывороток, в реакциях иммунофлюоресценции, диффузионной преципитации в геле, ДОТ-иммуноферментном анализе и электрофорезе в полиакриламидном геле с иммунобло-тингом,
Показано, что «С»-комплекс является надоболочечной структурой клетки туляремийного микроба, синтезируется в насыщенных факторами роста сложных средах, содержит белковый, углеводный и липидный компоненты, проявляет иммунохи-мическую активность. «С»-комплекс, выделенный из вакцинных и вирулентных штаммов, защищает лабораторных животных от заражения высоковирулентными штаммами возбудителя туляремии голарктической и неарктической расы, инициирует активацию макрофагов белых мышей in vitro в НСТ-тесте, не индуцирует явление апоптоза у тимо-цитов и спленоцитов белых мышей.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников. Объём диссертации 133 страницы машинописного текста. Список литературы содержат 108 отечественных и 49 иностранных источников. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 16 таблицами.
