Введение к работе
Актуальность проблемы. Интерферон (ИФН) — важное звено в адаптационно-приспособительных механизмах макроорганизма и поддержании его гомеостаза (Ариненко и др., 1997; Шабалина и др., 1995; Ершов, 1996; 1998). Показано, что биологическая активность ИФН направлена против всех известных РНК- и ДНК-содержащих вирусов (Соловьев и др., 1981; Goodboum et al, 2000). ИФН, являясь продуктом экстренной реакции организма на патоген, продуцируется макрофагами или другими антиген-представляющими клетками уже при первом контакте с патогеном. При этом формирование устойчивости организма к инфекциям происходит через активацию клеточных реакций намного раньше формирования специфического иммунитета, связанного с антителами (Кузнецов, 1987; Ершов, 1996).
В процессе интерфероногенеза индуцированные патогеном лейкоциты, наряду с интерфероном, продуцируют широкий спектр цитокинов — медиаторов иммунного ответа (ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-15,ФНО-а, МИФ и ЛИФ), активирующих Т-лимфоциты (Медуницын и др., 1987; Акользинаидр., 1996; Кузнецов, 1998).
Система интерферона представлена ИФН-а, -Р и -у. Однако, наиболее изучены иммунобиологические и клинические аспекты действия ИФН-а лейкоцитарного происхождения (Соловьев и др., 1981; Кузнецов, 1983, 1987). Именно этот вид ИФН — природный и рекомбинантный — до настоящего времени широко применяется в профилактических и терапевтических целях.
Природные препараты ИФН многокомпонентны и содержат все или, по крайней мере, большинство подтипов. Они не обладают антигенными свойствами и не вызывают сенсибилизации при длительном и многократном введении (Кузнецов, 2000).
В то время, как рекомбинантные интерфероны, являясь
продуктами одного реконструированного гена, всегда
однокомпонентны (Ершов, 1996, 1998), что обуславливает и соответствующий потенциал их терапевтической активности. Некоторые рекомбинантные ИФН при парэнтеральном введении могут вызывать образование специфических нейтрализующих антител, а также потенцировать различные осложнения (Lawrence, 1995; Fernander et al, 1996; Chung et al, 1997; HayaKawa et al, 1997; Zuber et al, 1997;Uberti-Foppa et al, 1998Ї:
Разнообразие лекарственных форм лейкоцитарного ИФН-а очень важно для практики, учитывая особенности состояния иммунной системы больного и специфики заболевания (Кузнецов, 1996; Трофимова и др., 1997; Лобачев и др., 1999; Гапонюк и др., 2001; Волкова и др., 2002; Попов, 2002; Malinovskaya et al, 1992; Pozzato et al, 1995). Причем местное применение ИФН, когда оно возможно, всегда эффективнее системного. Препараты ИФН для местного применения позволяют локально или внутриорганно воздействовать на патологический процесс, мало влияя на кроветворение (Жерлакова и др., 1985; Тарееваидр., 1997).
Основные продуценты природного интерферона-альфа — лейкоциты крови человека, количество которых для производственных целей лимитируется донорским сырьем (Соловьев и др., 1981; Кузнецов, 1983; 1996).
В этой связи решение вопросов оптимизации методов культивирования лейкоцитов для повышения выхода целевого продукта и разработки унифицированного эффективного метода получения природного ИФН для создания новых лекарственных форм представляется на сегодня весьма важным и актуальным для практического здравоохранения.
Эффективной лекарственной формой являются суппозитории с ИФН, способные оказывать как местный, так и системный лечебный эффект за счет выраженной всасывательной способности нижних отделов кишечника (Цагарейшвили и др., 1987; Покровский, 2001).
Известно, что при некоторых вирусных поражениях слизистых оболочек и кожи жидкие лекарственные формы ИФН не способны обеспечить поддержание необходимого уровня активации иммунных эффекторов в очаге инфекции. Наиболее приемлема для местного применения на открытых пораженных поверхностях кожи и слизистых мягкая лекарственная форма — интерфероновая мазь.
В последнее десятилетие отмечен интерес и к сублингвальному способу введения белковых препаратов, позволяющему специфической субстанции проникать в организм, минуя протеолитический барьер верхних отделов желудочно-кишечного тракта (Махлай и др., 1997; Reischmann et al, 1991). Отмечено, что сублингвальная или оральная формы ИФН при лечении вирусных инфекций слизистых оболочек ротовой полости усиливают местный противовирусный иммунитет (Uberti-Foppa et al, 1998).
В 80-х годах прошлого века был обнаружен феномен антибактериального действия препаратов природного лейкоцитарного
ИФН-а (Малеева и др., 1982; Печеркина и др., 1982; Коробов и др. 1985; 1988; Кузнецов, 1989; Korobov et al, 1988). По мнению указанных авторов эффект обусловлен присутствием в препаратах интерферона антибактериальных пептидов. Как известно, антибактериальные пептиды являются активными защитными компонентами иммунной системы (Green etal, 2000; Islam et al, 2001). В этой связи выделение антибактериального фактора, синтезируемого лейкоцитами, индуцированными вирусом — интерфероногеном, из продуктов интерфероногенеза, и изучение его физико-химических и биологических свойств представлялось нам перспективным в плане обоснования возможности применения в практике нового по своей природе антимикробного препарата.
Цель настоящего исследования — научно-методологическое обоснование и оптимизация способов получения природных а-интерферона и антибактериального пептидного комплекса, создание новых лекарственных форм и оценка их терапевтической эффективности.
Основные задачи исследования
Разработать унифицированную реакторную технологию получения природного лейкоцитарного а-интерферона с использованием в качестве ингерфероногена очищенного и концентрированного вируса Сендай.
Изучить цитокинетическую активность продуктов интерфероногенеза, синтезируемых донорскими лейкоцитами под действием вируса Сендай.
Разработать способы приготовления усовершенствованных и новых лекарственных форм интерферона для местного применения (суппозитории, мазь, таблетки).
Оценить терапевтическую эффективность разработанных лекарственных форм интерферона в экспериментальных и клинических условиях.
Изучить закономерности синтеза антибактериального фактора, ассоциированного с процессом интерфероногенеза, разработать способ его выделения, очистки, концентрации и определить физико-химическую природу.
Оценить антибактериальное действие низкомолекулярного пептидного комплекса на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы.
Положения, выносимые на защиту
Метод культивирования, очистки и концентрации вируса Сендай и его использование в качестве интерфероногена способствует повышению противовирусной активности ИФН и низкому содержанию ксеногенных белков в продуктах биосинтеза интерферона.
Интерферон, полученный по унифицированной реакторной технологии, является продуктивной основой для приготовления новых лекарственных форм природного а-интерферона.
Новые лекарственные формы интерферона для местного применения (суппозитории, мазь, таблетки) обеспечивают биодоступность и длительное сохранение противовирусной активности специфической составляющей.
Результаты экспериментально-клинической оценки новых лекарственных форм природного а-интерферона свидетельствуют о их высокой терапевтической эффективности.
Разработанный способ выделения, очистки и концентрации обеспечивает получение из продуктов биосинтеза интерферона препарата пептидной природы, обладающего антибактериальной активностью.
Низкомолекулярный пептидный комплекс, продуцируемый лейкоцитами человека в процессе интерфероногенеза, можно отнести к катионным пептидам, проявляющим антибактериальную активность в отношении не только тест-культур грамположительных микроорганизмов, но и представителей грамотрицательной флоры: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosae, а также уропатогенных культур микроорганизмов, изолированных от больных детей с инфекциями мочевой системы.
Научная новизна. Определены оптимальные условия
реакторного культивирования лейкоцитов человека с использованием в
качестве интерфероногена вируса Сендай. Разработана единая
оптимизированная технология получения полуфабриката природного
а-интерферона как основы для создания различных лекарственных
форм ИФН (суппозитории, мази, таблетки). Разработаны
усовершенствованная лекарственная форма интерферона
в суппозиториях (патент РФ №219330, приоритет от 25.09.1996)
с высокой удельной противовирусной активностью и
пролонгированным сроком годности, а также метод оценки противовирусной активности указанной лекарственной формы на основе экстрагирования ИФН из гидрофобных основ с помощью
гексана и 0,9%-ного раствора натрия хлорида при рН 7,0 (патент РФ №2123351, приоритет от 20.12.1998). Впервые разработан способ получения мази с интерфероном на дифильной основе, обеспечивающей сохранение специфической активности ИФН в течение одного года и его биодоступность при применении указанной лекарственной формы препарата (патент РФ № 2141819, приоритет от 15.07.1997), предложен метод оценки специфической активности ИФН, заключенного в дифильную мазевую основу (патент РФ №2148396, приоритет от 10.05.2000). Впервые разработан способ приготовления сублингвальной таблетки с ИФН, обеспечивающий высокую стабильность противовирусной активности и биодоступность специфической составляющей. Новизна полученных результатов подтверждена патентом РФ №2175554, приоритет от 30.03.1999. Результатами экспериментальных и клинических исследовании подтверждена терапевтическая эффективность новых лекарственных форм в виде суппозиториев, мази, таблеток, содержащих очищенный и концентрированный природный лейкоцитарный ИФН-а. Впервые разработан и предложен способ выделения низкомолекулярного пептидного комплекса из продуктов интерфероногенеза, обладающего антибактериальным действием, изучены его физико-химические свойства, определен аминокислотный состав (заявка на патент РФ №2003105421, приоритет от 25.02.2003). Оценено антибактериальное действие низкомолекулярного пептидного комплекса, синтез которого ассоциирован с процессом интерфероногенеза, на музейные культуры грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: Staphylococcus aureus (АТСС 653 8-Р), Streptococcus faecalis (эталон ГИСК 389), Escherichia coli (АТСС 25922), Pseudomonas aeruginosae (АТСС 9027), Bacillus cereus (АТСС 8035), Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis. Впервые выявлено антибактериальное действие пептидного комплекса в отношении уропатогенных культур микроорганизмов родов Escherichia spp., Staphylococcus spp., Klebsiella spp. и Proteus spp., выделенных от больных детей с заболеваниями мочевой системы (свидетельство на интеллектуальный продукт ВНТИЦ № 73200400139, от 08.07.2004).
Теоретическое и практическое значение работы состоит в определении закономерностей синтеза антибактериального фактора, ассоциированного с процессом интерфероногенеза, и подтверждении его пептидной природы. Методологически обоснованы биодоступность новых лекарственных форм природного лейкоцитарного а-ИФН, способы их применения и терапевтическая
эффективность. Практическая значимость работы состоит в разработке эффективного масштабированного реакторного способа получения природного а-интерферона с использованием предложенного метода очистки и концентрации вируса—интерфероногена Сендай. На основе усовершенствованного реакторного метода получения человеческого лейкоцитарного интерферона (ЧЛИ) разработаны способы приготовления новых лекарственных форм природного ИФН в виде суппозиториев, мази и таблеток. Экспериментально-клиническими исследованиями подтверждена их терапевтическая эффективность при различных инфекционных патологических состояниях (бактериальном вагинозе, герпесе).
На разработанные технологии получения препаратов ИФН оформлено 10 нормативно-технических документации, одобренных Ученым Советом ГИСК им. Л. А. Тарасевича МЗ РФ. Реакторный способ синтеза интерферона в суспензионной культуре донорских лейкоцитов, индуцированных вирусом Сендай, реализован при производстве препарата «Интерферон человеческий лейкоцитарный сухой» в филиале ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед». Предложенный способ получения препарата «Свеферон» — суппозитории интерферон человеческий лейкоцитарный» используется в производстве указанного препарата Пермским НПО «Биомед» с 2000 года. Препарат «Мазь с интерфероном» рекомендован Комитетом МИБП МЗ РФ к регистрации в Российской Федерации в качестве лекарственного средства для наружного применения (Протокол № 4 от 20.06.2002). Препарат «Интерферон таблетки» в настоящее время проходит завершающую стадию клинических испытаний (Разрешение на проведение клинических испытаний № 246 от 21.11.2003 г.).
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции, Пермь, 1993; П Международной конференции и I Съезде БААКИ, Витебск, 1998; П Международной конференции, посвященной 100-летию Пермского НПО «Биомед», Пермь, 1998; Международной научной конференции «Фармация в XXI веке: инновации и традиции», Санкт-Петербург, 1999; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических препаратов», посвященной 95-летию ФГУП «Иммунопрепарат», Уфа, 2000; V International Conference «Environmental Pollution — ICEP-2001», Волгоград — Пермь, 2001; научно- практической конференции «Интерферон. Вопросы теории и практики», Пермь, 2001; научной конференции
«Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», посвященной 95-летию ФГУП «Вирион», Томск, 2001; II Конференции иммунологов Урала, Пермь, 2002; на X Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2003; на 5-м Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 2003; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в 21 веке», Пермь, 2003; Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней — прогресс и проблемы», Санкт-Петербург, 2003; II Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2003; XI Российском научном Конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», посвященной 100-летию со дня основания Томского НПО «Вирион», Томск, 2004; Международной Российско- американской научно-практической конференции «Актуальные проблемы материнства и детства», Тула, 2004.
Диссертация апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО "Биомед"» и расширенном заседании научной проблемной комиссии по аллергологии и иммунологии и микробиологии Института экологии и генетики микрорганизмов УрО РАН и рекомендована к защите.
По материалам диссертации опубликовано 52 статьи, в том числе в центральной печати — 7, патентов на изобретение РФ — 5, свидетельств на интеллектуальный продукт — 1.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа вьшолнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ вакцин и сывороток филиала ФГУП «НПО "Микроген"» МЗ РФ «Пермское НПО "Биомед"» (№ госрегистрации тем 01.9.80.0.07827; 01.200.1.08831).
Объем и структура диссертации. Проведенные исследования выполнены под руководством и личном участии автора на базе лаборатории и отделения интерферона Пермского НПО «Биомед» МЗ РФ при содействии лаборатории биологически активных препаратов Пермского НПО «Биомед» МЗ РФ (зав. лаб.— к. б. н. Г. М. Сафонова), лаборатории биохимии микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (зав. лаб.— к. м. н., с. н. с. В. П. Коробов), кафедры инфекционных болезней ГОУ ВПО «111 МА МЗ
РФ» (зав. каф.— д. м. н, проф. Н. Н. Воробвёва), кафедрві акушерства и гинекологии ГОУВПО «ПГМА МЗ РФ» (зав. каф.— д. м. н., проф. М. М. Падрулв), кафедрві детских болезней ГОУ ВПО «ПГМА МЗ РФ» (зав. каф.—д. м. н., проф. Н. И. Авервянова).
Диссертация состоит из введения, обзора даннвгх литературві, описания материалов и методов, 6 глав собственнвгх исследований, заключения, ввіводов, списка литературві и приложения. Работа изложена на 305 страницах, включая 31 рисунок и 67 таблиц. Список цитируемой литературві содержит 432 источника, из них 241 отечественнвгх и 191 иностраннвгх авторов.
