Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. 5
ВВЕДЕНИЕ. 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 11
1.1. Плацентарные макрофаги. 12
1.2. Методы исследования иммунных процессов в фетоплацентарном комплексе.
1.2.1. Исследование биологических жидкостей, функционально связанных с фетоплацентарным комплексом.
1.2.1.1. Амниотическая жидкость. 21
1.2.1.2. Цервиковагинальный секрет. 24
1.2.1.3. Пуповинная кровь. 25
1.2.2. Экстракты плацентарной ткани. 26
1.2.3. Исследование плацентарной ткани in situ и клеточного состава плаценты.
1.2.4. Культивирование эксплантов плацентарной ткани 31
1.3.2. Культуры клеток плаценты 33
1.3. Методы получения культур плацентарных макрофагов 38
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 41
2.1. Получение культуры плацентарных макрофагов 41
2.1.1. Предварительная подготовка образцов ткани. 41
2.1.2. Получение клеточной суспензии из ткани плаценты при помощи ультразвуковой дезинтеграции.
2.1.3. Получение клеточной суспензии из ткани плаценты посредством трипсинолиза.
2.1.4. Получение клеточной суспензии из ткани плаценты посредством ферментативного гидролиза коллагеназой I типа.
2.1.5. Диссоциация плацентарной ткани с использованием диспазы в сочетании с коллагенолитическим комплексом «Коллагеназа».
2.1.6. Очистка плацентарных макрофагов при помощи центрифугирования в градиенте плотности.
2.1.7. Обогащение диссоциированной культуры плацентарных макрофагов за счет клеточной адгезии.
2.2. Оценка эффективности используемых экспериментальных методов получения диссоциированных культур плацентарных макрофагов
2.3. Методы оценки функциональной активности плацентарных макрофагов.
2.3.1 Гистохимическое определение ферментативной активности неспецифической эстеразы.
2.3.2. Определение фагоцитарной активности плацентарныхмакрофагов.
2.3.3. Иммуноцитохимические методы. 55
2.3.4. Определение цитокинов, продуцируемых плацентарнымимакрофагами.
2.3.5. Статистическая обработка полученных результатов. 58
3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ. 59
3.1. Получение культуры плацентарных макрофагов. 59
3.1.1. Опыт выделения плацентарных макрофагов без использования гидролитических ферментов.
3.1.2. Опыт выделения плацентарных макрофагов с спользованием протеолитических ферментов
3 Л .2.1. Использование трипсина для выделения плацентарных макрофагов.
3.1.2.2. Использование коллагеназы I типа для выделения плацентарных макрофагов.
3.1.2.3. Использование диспазы в сочетании оллагенолитическим комплексом «Коллагеназа» для выделения плацентарных макрофагов.
3.2. Использование культур плацентарных макрофагов для 71
изучения из особенностей при беременности и родах
3.2.1.. Исследование экспрессии поверхностных антигенов 71
культивируемыми плацентарными макрофагами.
3.2.2. Исследование фагоцитоза в культуре плацентарных 765
макрофагов.
3.2.3 Исследование секреции провоспалительных цитокинов 78
плацентарными макрофагами.
4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. 83
4.1. Получение культур плацентарных макрофагов. 83
4.2. Исследование свойств плацентарных макрофагов при беременности и родах.
4.2.1. Динамические изменения морфофункциональных свойств плацентарных макрофагов в ходе беременности.
4.2.2. Изменения морфофункциональных свойств плацентарных макрофагов, связанные с родовой деятельностью
5. ВЫВОДЫ. 94
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96
Введение к работе
Репродуктивная система, отвечающая за сохранение человека как биологического вида, является объектом интенсивных исследований, центральное место в которых занимает изучение ее функциональных взаимодействий с другими системами организма.
Несмотря на многочисленные исследования в области иммунологии репродукции, участие элементов иммунной системы в репродуктивных процессах недостаточно изучено. Иммунология репродукции и, в частности, иммунология гестационных процессов, требует совершенствования экспериментальных методов и их соответствия современному уровню развития биологической науки.
Несмотря на несомненную важность изучения системных механизмов регуляции репродуктивных процессов, течение беременности определяется, в первую очередь, состоянием компонентов иммунной системы фетоплацентарного комплекса. Физиологические процессы, протекающие в фетоплацентарном комплексе, охватывают различные типы клеток и обладают сложным многоуровневым характером регулирования межклеточных коммуникаций. Все это затрудняет понимание роли каждого из элементов исследуемого комплекса, механизмов воздействия факторов макро- и микроокружения.
Фетоплацентарный комплекс представляет собой динамично развивающуюся структуру и во многих процессах, сопровождающих ее возникновение, рост, развитие и функционирование принимают участие резидентные макрофаги.
Макрофаги являются высокодифференцированными представителями системы мононуклеарных фагоцитов и осуществляют многочисленные эффекторные и регуляторные функции во всех органах и тканях человеческого организма. Согласно современным представлениям, этот тип клеток играет центральную роль в инициации и развитии иммунных процессов. Способность резидентных макрофагов продуцировать широкий спектр биологически активных молекул позволяет рассматривать их как один из основных факторов формирования гуморального микроокружения в населяемых ими тканях и органах.
Выделение и культивирование плацентарных макрофагов позволяет подробно исследовать эту специализированную популяцию эффекторных и регуляторных клеток, с наибольшей полнотой выявляя их морфофункциональные особенности и потенциальные механизмы участия как в нормально протекающих гестационных процессах, так и в возникновении и развитии патологий.
Цель исследования.
Разработка стандартного метода получения культуры плацентарных макрофагов и изучение их морфофункциональных особенностей в зависимости от срока гестации при нормально и патологически протекающих беременности и родовой деятельности.
Задачи исследования.
1. Разработать стандартную процедуру выделения, очистки и культивирования плацентарных макрофагов человека, позволяющую использовать в качестве источника клеток ткани плаценты различной степени зрелости.
2. Изучить характер экспрессии культивируемыми макрофагами антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса, рецепторов к СЗЫ компоненту комплемента и Fc фрагменту иммуноглобулина, являющихся маркёрами активации, в зависимости от срока гестации при наличии и в отсутствии родовой деятельности.
3. Оценить особенности проявления фагоцитарной активности культивируемых макрофагов, полученных из плацент различного срока гестации, при срочных и преждевременных родах.
4. Определить характер продукции провоспалительных цитокинов интерлейкина (ИЛ)-1а, ИЛ-1(3 и фактора некроза опухолей (ФНО)-се макрофагами, полученными из плацент II и III триместров беременности при развитии родовой деятельности и в её отсутствии.
Научная новизна работы.
Разработан оригинальный метод выделения и очистки макрофагов из плацентарной ткани человека, который может быть использован для получения клеток из плацент различных сроков гестации и их долговременного культивирования.
Определён характер экспрессии мембранных маркёров активации культивируемыми плацентарными макрофагами в зависимости от сроков гестации и развития родовой деятельности
Проведена оценка изменений фагоцитарной активности мононуклеарных фагоцитов плаценты на различных сроках беременности, при наличии или отсутствии родовой деятельности.
Изучены особенности секреции плацентарными макрофагами провоспалительных цитокинов - ИЛ-1а, ИЛ-1(3 и ФНО-а - в культурах клеток, полученных из плацент II и III триместров беременности при родовой деятельности и в её отсутствии.
первые проведено сравнительное изучение продукции а- и р-форм ИЛ-1 плацентарными макрофагами человека в зависимости от сроков гестации.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Разработанный в ходе исследования метод выделения, очистки и культивирования плацентарных макрофагов может быть использован для моделирования in vitro участия клеток этого типа в нормальном и патологическом развитии беременности.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Использование сочетания диспазы и препарата «Коллагеназа» для протеолиза механически измельченной плацентарной ткани с последующим центрифугированием в градиенте плотности и очищением культуры клеток на основании её способности к адгезии позволяет получать жизнеспособные резидентные макрофаги плаценты.
2. Экспрессия маркёров активации, фагоцитарная активность и продукция ИЛ-1(3 и ФНО-ос культивируемыми макрофагами возрастают по мере созревания плаценты.
3. Макрофаги, полученные из плацент при преждевременных родах, характеризуются повышенной продукцией ИЛ-1а, ИЛ-1{3 и ФНО-а, по сравнению с клетками, полученными из плацент того же срока гестации при отсутствии родовой деятельности.
4. Макрофаги, полученные из плацент II триместра физиологически протекающей беременности, продуцируют преимущественно ос-форму ИЛ-1, в то время, как клетки из плацент поздних сроков гестации (конец III триместра) продуцируют одинаковое количество а- и (3-форм этого цитокина.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на V Балтийской конференции по акушерству и гинекологии (Мальмо, Швеция, 1995), Международном симпозиуме «Иммунология репродукции» (Киев, 1996) и конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2001).
Диссертационная работа была представлена на расширенном заседании лаборатории иммунологии НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН 17-го февраля 2003 г.
Диссертационная работа апробирована на совместном заседании научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН и лаборатории иммунологии НИИАГ им. Д.О.Отта РАМН 21-го марта 2003 г.
Объём и структура диссертации.
Диссертация изложена на 113 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Работа содержит 12 рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает 7 отечественных и 162 зарубежных источников.
![Характеристика цитокинового статуса и регуляторных Т-клеток при физиологической беременности и гестозе [Электронный ресурс]](/i/i/4382/205395.png "Характеристика цитокинового статуса и регуляторных Т-клеток при физиологической беременности и гестозе [Электронный ресурс] Дударева Алла Витальевна")
