Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД Чеканова, Татьяна Александровна

Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД
<
Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД
>

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Чеканова, Татьяна Александровна Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД : диссертация ... кандидата биологических наук : 14.00.36 Москва, 2006

Содержание к диссертации

Введение 8

1. Обзор литературы 13

1.1. Этиология ВИЧ-инфекции 13

1.2. Иммунная система при ВИЧ-инфекции. Иммунопатогенез 19

1.3. Современное состояние проблемы разработки вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД 26

1.4. Подходы к разработке вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД. Состав анти-ВИЧ-иммуногенов .' 30

1.5. Методологические подходы для лабораторной оценки кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД 36

2. Материалы и методы 40

2.1. Кандидатные вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД 40

2.1.1. Кандидатная вакцина «ВИЧРЕПОЛ» 40

2.1.2. Кандидатная вакцина «ТВІ-ВПЧ для инъекций» 41

2.1.3.Кандидатная вакцина «КомбиВИЧвак» 41

2.1.4. Кандидатная вакцина «САЛ-ВИЧ-«Д» суппозитории» 42

2.2. Коммерческие тест-системы 42

2.3 .Сыворотки крови человека и стандартные образцы для оценки подлинности кандидатных-вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД 44

2.4. Рекомбинантные антигены ВИЧ 45

2.5. Лабораторные животные 45

2.6. Методы 45

2.6.1 Методика проведения непрямого ИФА для подтверждения ВИЧ-специфической антигенной активности (подлинности) кандидатных вакцин по реактивности вакцинных антигенов с сыворотками крови человека 46

2.6.2.Методика проведения «сэндвич»-ИФА для подтверждения ВИЧ-специфической антигенной активности (подлинности) кандидатных вакцин «ТВІ-ВПЧ для инъекций» и «КомбиВИЧвак» 46

2.6.3. Изучение гуморального ответа у мышей после однократной иммунизации на иммуносорбентах с гомологичным вакцинным антигеном t 48

2.6.4. Изучение динамики индукции антител класса G у мышей после двукратной иммунизации кандидат-вакцинами на иммуносорбентах с гомологичным вакцинным антигеном 49

2.6.5. Изучение уровня антител класса G у иммунизированных мышей кандидатными вакцинами «ВИЧРЕПОЛ», «КомбиВИЧвак», «ТВІ-ВПЧ для инъекций» к индивидуально иммобилизованным рекомбинантным белкам Env, Gag и на иммуносорбенте (Env+Gag) 51

2.6.6. Методика изучения иммунореактивности антител в сыворотках крови иммунизированных мышей с рекомбинантными белками (пептидами) иммуносорбентов коммерческих ИФА-тест-систем 52

2.6.7. Методика изучения спектра антител в сыворотках крови иммунизированных и интактных мышей в иммунном блоттинге 52

2.6.8. Методика изучения антиген-связывающей активности сывороток мышей, иммунизированных «ВИЧРЕПОЛ», в конкурентном ИФА в коммерческих тест-системах, выявляющих антиген р24 ВИЧ-1 53

2.6.9. Реакция вирусной нейтрализации 54

2.6.10. Изучение ВИЧ-специфической индукции цитотокин- продуцирующих клеток у ммунизированных мышей методом ELSPOT 55

2.6.11. Определение ВИЧ-специфических йзотипов IgGl и IgG2a в сыворотках крови иммунизированных мышей 57

2.6.12. Статисическая обработка результотов 57

3. Результаты и обсуждение 58

3.1. Доклиническое изучение кандидат-вакцины «ВИЧРЕПОЛ» 58

3.1.1. Определение ВИЧ-специфической антигенной активности вакцины «ВИЧРЕПОЛ» методом непрямого ИФА 58

3.1.2. Оценка гуморального ответа у иммунизированных однократно «ВИЧРЕПОЛ» мышей на гомологичный антиген 63

3.1.3. Определение антител класса G в сыворотках крови мышей, ммунизированных двукратно «ВИЧРЕПОЛ», на гомологичный вакцинный антиген 65

3.1.4. Изучение иммунореактивности антител в сыворотках крови иммунизированных «ВИЧРЕПОЛ» мышей с рекомбинантными белками/пептидами на иммуносорбентах коммерческих тест-систем, выявляющих антитела к ВИЧ 67

3.1.5. Изучение спектра антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных двукратно «ВИЧРЕПОЛ», методом иммунного блоттинга 71

3.1.6. Исследование специфической антиген-связывающей активности сывороток крови мышей, иммунизированных «ВИЧРЕПОЛ», в конкурентном ИФА в тест-системах, выявляющих антиген р24 ВИЧ-1 76

Заключение по главе 3.1 , 78

3.2. Адаптация методов ИФА и иммунного блоттинга для лабораторного контроля кандидатных вакцин «ТВІ-ВПЧ для инъекций» и «КомбиВИЧвак» 80

3.2.1. Исследование иммунореактивности антител в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных лице эпитопами белка-иммуногена TBI 80

3.2.2. Оценка гуморального ответа у мышей линии Balb/c, иммунизированных «ТВІ-ВПЧ для инъекций» и «КомбиВИЧвак» 89

3.2.3. Изучение сывороток крови мышей, иммунизированных двукратно «ТВІ-ВПЧ для инъекций» и «КомбиВИЧвак», в тест-системах, выявляющих антитела к ВИЧ типов 1 и 2, методом ИФА и иммунного блоттинга

3.2.4. Изучение уровня антител класса G у иммунизированных мышей кандидатными вакцинами «ВИЧРЕПОЛ», «КомбиВИЧвак», «ТВІ-ВПЧ для инъекций» к индивидуально иммобилизованным рекомбинантным белкам Env, Gag и на иммуносорбенте (Env+Gag) 99

Заключение по главе 3.2 101

3.3. Методологические подходы для лабораторного контроля кандидатной вакцины «САЛ-ВИЧ-«Д» суппозитории 103

Заключение по главе 3.3 108

3.4. Изучение показателей индукции гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа у мышей, иммунизированных экспериментальными вакцинами против ВИЧ-инфекции/СПИД 109

Заключение по главе 3.4 116

Заключение 117

Выводы 125

Список литературы 127 

Введение к работе

По оценке ВОЗ и ООН по СПИДу (UNAIDS) ежедневно в мире регистрируется около 16000 новых случаев инфицирования ВИЧ. Общее количество ВИЧ-инфицированных насчитывает более 70 млн человек, из них умерло более 22 млн человек [160]. СПИД - терминальная фаза ВИЧ-инфекции - явился основной причиной смертности населения ряда стран Центральной и Южной Африки [30, 31, 61]. В начале 90-х годов прошлого века эксперты ВОЗ пришли к официальному заключению, что ВИЧ-инфекция, захватив практически все страны мира, приняла характер пандемии. В России в последние годы отмечается высокий уровень .распространения ВИЧ-инфекции [14]. По данным Роспотребнадзора, на 15 ноября 2005 года в России зарегистрировано 335 тысяч 795 случаев ВИЧ-инфекции, из них 1 тысяча 727 детей в возрасте до 14 лет. 80% ВИЧ-инфицированных - молодые люди в возрасте от 15 до 30 лет (www. rian.ru).

Постоянный рост инфицированности ВИЧ делает проблему разработки и испытания анти-ВИЧ/СПИД-вакцин одной из важнейших в здравоохранении. Безопасные и эффективные вакцины (профилактические и терапевтические) считаются наиболее перспективным средством контроля пандемии ВИЧ-инфекции/СПИД [167]. К разработке и испытаниям кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД привлечены ведущие научные центры, общественные организации, международные и национальные фонды. Общая координация деятельности осуществляется ВОЗ и ООН. Важность интеграции усилий мирового научного сообщества по созданию анти-ВИЧ/СПИД-вакцин подчеркнута на самом высоком международном уровне. На совещании лидеров государств-участников Большой восьмерки 8-Ю июня 2004 года в США одобрена глобальная инициатива («AIDS Vaccine Enterprise»), направленная на ускорение разработки вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД [71].

Для успешной работы в области разработки вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД необходима единая комплексная система создания, контроля и испытаний иммуногенов и вакцин, которая обеспечивала бы безопасность проведения всех этапов тестирования в соответствии со стандартами GLP и GCP [4, 5, 6]. ВОЗ и UNAIDS - ведущие координаторы исследований в области разработки кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции - считают одним из важнейших направлений создание комплекса единых и стандартизованных методов для адекватного анализа результатов, полученных различными научными центрами в ходе доклинических и клинических испытаний. В рамках глобальной инициативы «AIDS Vaccine Enterprise» предусмотрена поддержка работ по стандартизации лабораторных тест-систем для сравнения результатов испытаний, проводимых в различных странах, и создание единой системы клинических испытаний.

Создание единой системы доклинических испытаний кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД является важным звеном в подготовке к клиническим исследованиям. Формирование системы контроля на лабораторном уровне вакцин против ВИЧ/СПИД в России начато в рамках Межведомственной научно-технической программы «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего» одновременно с доклиническими исследованиями препаратов.

Программа доклинического изучения - комплекс исследований, включающий идентификацию антигенов, адъювантов и векторов, определение безвредности и иммуногенности вакцины на модели лабораторных животных, создание пилотного производства и выпуск образцов кандидатной вакцины в соответствии с правилами GMP, стандартизацию методов контроля подлинности и специфической активности. О стандартизации исследования свидетельствует воспроизводимость методов и полученных результатов при аттестации разных экспериментальных серий вакцины (как минимум трех). Наиболее информативные методы контроля должны быть подробно описаны и внесены в соответствующую нормативную документацию - ФСП, которая окончательно должна утверждаться после успешного проведения всех этапов клинических испытаний [11]. Кроме того, они позволят не только адекватно сравнивать различные варианты вакцующих препаратов, оценивать влияние иммуногенов на активацию гуморального и/или клеточного звена иммунного ответа, отработать схемы иммунизации, но уже на этапе доклинического изучения судить о перспективности тестируемых препаратов.

В России разработаны несколько вариантов вакцин-кандидатов против ВИЧ/СПИД, которые были представлены на аттестацию в ГИСК им.Л.А.Тарасевича. Особенности конструкций состава иммуногенов, средств доставки и адъювантов позволяют классифицировать изучаемые вакцины следующим образом: конъюгированная полимер-белковая кандидатная вакцина «ВИЧРЕПОЛ» (ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России»),

- кандидатная вакцина на основе рекомбинантного вектора (векторная вакцина) - «САЛ-ВИЧ-«Д» суппозитории» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора),

- синтетическая полипептидная кандидатная вакцина с использованием технологии ВПЧ - «ТВІ-ВПЧ для инъекций» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора),

- комбинированная кандидат-вакцина «КомбиВИЧвак», представляющая собой синергизм ДНК-вакцины и синтетической полипептидной вакцины с использованием технологии ВПЧ (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора).

Вакцины-кандидаты находятся на различных стадиях исследований. В 2004 году начались клинические испытания I фазы кандидат-вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД «ВИЧРЕПОЛ» в соответствии с Протоколом, прошедшим экспертизу в ГИСК им.Л.А.Тарасевича, Комитета по МИБП и Комитета по этике при Федеральном органе контроля качества лекарственных средств. Получено разрешение Федеральной службы в сфере здравоохранения и социального развития Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации на проведение I фазы клинических испытаний [4, 5, 19, 20]. Это первый опыт подобных испытаний в нашей стране. Кандидатные вакцины против ВИЧ-инфекции/СПИД, разработанные в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» находятся на стадии подготовки к проведению клинических испытаний.

Цель исследования - разработка комплекса информативных методов лабораторной оценки и стандартизации экспериментальных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. модифицировать и стандартизовать условия проведения ИФА и иммунного блоттинга применительно к лабораторной оценке подлинности и специфической активности кандидатных вакцин,

2. изучить специфичность взаимодействия эпитопов вакцинного антигена гес(24-41) «ВИЧРЕПОЛ» и белка-иммуногена TBI в составе кандидатных вакцин «КомбиВИЧвак» и «ТВІ-ВПЧ для инъекций» с антителами в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных лиц с помощью различных вариантов ИФА,

3. изучить динамику индукции ВИЧ-специфических антител класса G у мышей различных линий, иммунизированных кандидатными вакцинами «ВИЧРЕПОЛ», «ТВІ-ВПЧ для инъекций», «САЛ-ВИЧ-«Д» суппозитории», «КомбиВИЧвак» однократно и двукратно,

4. изучить особенности формирования вирус-нейтрализующих антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных экспериментальными вакцинами, на модели острой инфекции с штаммом ВИЧ-1 на культуре линии чувствительных перевиваемых клеток МТ4 in vitro,

5. исследовать методом ELISPOT ВИЧ-специфическую индукцию цитокинов у иммунизированных анти-ВИЧ/СПИД-вакцинами мышей,

6. провести анализ синтеза ВИЧ-специфических изотипов IgGl и IgG2a в сыворотках крови иммунизированных кандидат-вакцинами мышей.

Научная новизна работы

Впервые проведено сравнительное изучение на доклиническом уровне экспериментальных вариантов отечественных вакцин против ВИЧ инфекции/СПИД, полученных по различным технологиям.

Впервые разработаны и стандартизованы методы оценки специфической кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД с помощью различных модификаций ИФА и иммунного блоттинга.

Впервые изучено влияние различных схем и способов иммунизации мышей анти-ВИЧ/СПИД-вакцинами на активацию ВИЧ-специфического гуморального и клеточного иммунного ответа.

Научно-практическое значение работы

На основании полученных результатов разработаны и стандартизованы методы оценки подлинности и специфической активности кандидатной вакцины «ВИЧРЕПОЛ», что явилось основой алгоритма оценки активности экспериментальной вакцины против ВРТЧ-инфекции/СПИД «ВИЧРЕПОЛ» и обоснованием решения вопроса о проведении клинических испытаний I фазы.

Разработанные методы лабораторной оценки специфической активности экспериментальных вакцин («ВИЧРЕПОЛ», «КомбиВИЧвак», «ТВІ-ВПЧ для инъекций» и «САЛ-ВИЧ-«Д» суппозитории»), введены в проекты нормативной документации на эти препараты.

В исследованиях вирус-нейтрализующей активности сывороток крови иммунизированных мышей, индукции цитокин-продуцирующих клеток методом ELISPOT и определения ВИЧ-специфических IgGl и IgG2a в сыворотках крови иммунизированных мышей в ИФА показана различная степень активации гуморального и клеточного иммунного ответа при иммунизации мышей в зависимости от типа экспериментальной вакцины и способа введения.

Похожие диссертации на Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции/СПИД