Содержание к диссертации
Оглавление 1
Основные использованные обозначения и сокращения 6
Введение , 8
Актуальность проблемы 8
Цель работы 9
Основные задачи 9
Научная новизна и практическое значение работы 9
Материалы и методы исследования 10
Основные положения, выносимые на защиту 11
Содержание работы по главам 11
Благодарности 11
Глава 1. Обзор литературы . 13
1 Клеточные основы кроветворной системы 13
Схема кроветворения 13
Методы изучения состава кроветворных предшественников 21
Регуляция самоподдержания и дифференцировки пСКК 22
Мезенхимальная стволовая клетка 27
Цитокины, влияющие на кроветворные клетки-предшественники ,32
Общая характеристика влияния различных цитокинов на гемопоэз 32
Роль ФНО в гемодоэзе 37
Роль ФНО в регуляции клеток стромы 39
Рецепторы ФНО 40
Методика получения нокаутов 42
Общие характеристики мышей ФНО-/- 43
Характеристика кроветворения в ДККМ ФН07- 45
Глава 2. Материалы и методы 47
Животные и их содержание 47
Условия облучения животных и культур клеток 47
Длительные культуры костного мозга Декстеровского типа (46) 48
Определение количества КООБ 49
Получение и анализ КОЕ-С 49
Определение количества КОЕ-ГМ (агаровая культура клеток из суспензионной фракции ДККМ) 50
Определение интенсивности пролиферации предшественников разной степени зрелости из СФ ДККМ 51
Определение доли клеток, находящихся в апоптозе 51
Получение прикрепленных клеточных линий из неприкрепленных клеток СФ ДККМ ФНО-/- 52
Получение фидера из перитонеальных макрофагов 52
Получение прикрепленных клеточных линий 52
Клонирование полученных клеточных линий 54
Пассирование клеток полученных линий, а также линий, использовавшихся для сравнения 54
Получение кондиционированных сред от полученных стромальных линий 55
Проверка способности клеток полученных стромальных линий поддерживать кроветворение 55
Проверка способности клеток полученных стромальных линий поддерживать рост КОЕ-ГМ в полужидкой среде 56
Проверка способности клеток полученных стромальных линий поддерживать рост эмбриональных стволовых клеток 56
Получение эмбриональных фибробластов 56
Культивирование ЭСК 58
Проверка способности клеток полученных стромальных линий поддерживать рост ЭСК 58
Подсчет клеток 59
Покрытие стекол поли-лизином 59
Гистохимия 59
Окрашивание кроветворных клеток по Паштенгейму 59
Окрашивание срезов селезеночных колоний, образованных КОЕ-С 60
Окрашивание клеток СФ на щелочную фосфатазу (5) 60
Окрашивание клеток СФ на неспецифическую эстеразу (5) 60
18 Иммунофлуоресцентное окрашивание 61
Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток для последующего их анализа и счета с использованием флуоресцентного микроскопа 61
Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток для последующего их анализа и счета с использованием проточного цитофлуориметра 62
Антитела, использованные для иммунофлуоресцентного окрашивания 62
Флуоресцентное окрашивание клеток прикрепленных клеточных линий на актиновые микрофиламенты 63
19 Проверка клеток СФ на опухолеродность 63
Проверка факторной зависимости клеток СФ 63
Проверка способности клеток СФ образовывать опухоль при попадании в организм 63
Кариотипирование клеток СФ и полученных стромальных линий 64
Задержка митоза в анализируемых клетках 64
Фиксация хромосом 64
Приготовление препаратов хромосом 65
Метод G-дифференциальной окраски хромосом по методике (224), с модификациями 65
Анализ хромосомных перестроек 65
19.4 Определение теломеразной активности в клетках СФ ДККМ ФИО-/- (8) 65
Приготовление клеточных экстрактов 66
Определение активности теломеразы 66
20 Выделение геномной ДНК 67
Выделение геномной ДНК из клеток крови 67
Выделение геномной ДНК из клеток подслоя ДККМ ФНО-/-, изначально установленной на подслое ДТ. , 68
21 Выделение РНК из анализируемых клеток 68
Выделение РНК 68
Определение количества и чистоты полученной РНК 70
Анализ принадлежности геномной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).71
Анализ экспрессии различных генов методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). 72
Построение первых цепей ДНК на РНК 72
Анализ полученной кДНК методом ПЦР 72
24 Методы статистической обработки данных 75
Глава 3. Результаты „ 78
1 Характеристики длительной культуры костного мозга мьппей дикого типа и ФНО-/-. 78
Клеточная продукция в ДККМ ДТ и ФИО-/- и продолжительность кроветворения 78
Анализ морфологии клеток СФ . 79
Морфологический анализ клеток СФ в длительной культуре костного мозга мышей дикого типа и ФНО-/- 79
Функциональный анализ способности клеток из СФ ФНО-/- к нормальной дифференцировке после длительного культивирования 81
Анализ изменения доли CD45+ клеток в длительной культуре костного мозга мышей дикого типа и ФНО-/- 81
Анализ количества КОЕ-ГМ в длительной культуре костного мозга мышей дикого типа и ФНО-/- 82
Анализ количества КОЕ-С в длительной культуре костного мозга мышей дикого типа и ФНО-/- 83
Анализ спектра кроветворных предшественников разного уровня зрелости методом КООБ , 84
Сравнение профилей кроветворных предшественников на разных сроках культивирования ДККМ 84
Изменение количества КООБ-7 и КООБ-28 в ДККМ ДТ и ФНО-/- с течением времени культивирования 86
Анализ экспрессии генов в ДККМ ФНО-/- 87
Анализ экспрессии генов в слоях прилипающих клеток из ДККМ ДТ и ФНО-/-. 87
Анализ экспрессии генов в клетках СФ из ДККМ ФНО-/- 89
1.6 Изменение характеристик кроветворных клеток-предшественников в ДККМ
ФНО-/-, полученных от старых мышей 91
Продолжительность кроветворения в ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей 91
Анализ доли CD45+ клеток в ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей. 92
Анализ состава кроветворных клеток-предшественников в ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей 93
Анализ изменения частоты КОЕ-ГМ в ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей, с течением времени культивирования 93
Анализ изменения частоты КОЕ-С в ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей, с течением времени культивирования 94
Анализ изменения частоты КООБ в ДККМ ФНО-/-, полученных от старых мышей, стечением времени культивирования 95
1.6.3.3.1 Изменение профилей КООБ с течением времени культивирования.
95
1.6.3.3.2 Изменение частот КООБ-7 и КООБ-28 с течением времени
культивирования 98
1.6.4 Анализ экспрессии генов в клетках СФ из ДККМ ФНО-/-, полученных от
старых мышей 100
1.7 Появление среди ДККМ, инициированных от старых мышей, культур с
аномальными характеристиками 101
1.7.1 ДККМ ДТс аномальными характеристиками 102
1.7.2 ДККМ ФНО-/- с аномальными характеристиками 105
1.8 Сравнение данных по ДККМ ФНО-/-, полученных от молодых и старых
мышей , 106
L8.1 Продолжительность кроветворения 106
1.8.2 Изменение частоты кроветворных клеток-предшественников в течение
времени культивирования 107
Изменение частоты КОЕ-ГМ 107
Изменение частоты КОЕ-С 108
Изменение частот КООБ-7 и КООБ-28 109
Изменение уровня экспрессии генов с течением времени культивирования ПО
Возможность объединения данных по ДККМ ФНО-/-, полученных от молодых и старых мышей , . ПО
2 Определение возможности возникновения неопластической трансформации в
клетках СФ ДККМ ФНО-/- 111
2.1 Определение чувствительности к пролиферативньш сигналам у клеток ДККМ
на поздних сроках культивирования 112
Определение факторной зависимости клеток из ДККМ ФНО-/-, предварительно культивировавшихся длительное время 112
Определение чувствительности к пролиферативным сигналам клеток подслоя ДККМ ФНО-/- 113
Определение кариотипа клеток из суспензионной фракции и слоя прикрепленных стромальных клеток из ДККМ ФНО-/-, культивировавшихся длительное время 113
Определение теломеразной активности в клетках СФ ДККМ ФНО-/- 114
Проверка способности клеток из ДККМ ФНО-/-, предварительно культивировавшихся длительное время, образовьгеать опухоль в организме мьппи. 115
3 Характеристики некроветворных клеток, появляющихся в СФ ДККМ ФНО-/- после
70 недель культивирования 117
Динамика экспрессии поверхностного маркера Sea-1 в процессе продолжительного культивирования ДККМ ФНО-/- 117
Появление в СФ ДККМ ФНО-/- неприкрепленных клеток, способных образовывать прикрепленные клеточные линии 118
Анализ экспрессии различных генов клетками прикрепленных клеточных линий, 120
Определение структуры актинового цитоскелета 120
Анализ экспрессии поверхностных маркеров и белков внеклеточного матрикса 120
Анализ экспрессии некоторых генов клетками прикрепленных стромальных клеточных линий 121
3.4 Функциональные характеристики полученных линий 123
3.4.1 Определение продукции цитокинов и факторов роста клетками
стромальных линий 123
3.4.2 Поддержание кроветворения клетками полученных стромальных линий.
124
Поддержание роста эмбриональных стволовых клеток на полученных стромальных линиях 125
Сравнение экспрессии различных генов в клетках СФ на момент получения прикрепленных клеточных линий и в клетках полученных линий 126
4 Определение возможных механизмов изменений, приводящих к длительному
поддержанию кроветворения и появлению неприкрепленных недифференцированных
стромальных клеток в ДККМ ФНО-/- с течением времени культивирования 128
4.1 Пролиферация кроветворных предшественников в длительной культуре
костного мозга мышей дикого типа и ФНО-/- 128
Действие различных цитостатнков на популяцию КОЕ-ГМ ДТ и ФНО-/-. 128
Уровень пролиферации КОЕ-ГМ 129
Интенсивность пролиферации КООБ-7 и КООБ-28 131
Уровень апоптоза в длительной культуре костного мозга мышей дикого типа и ФНО-/- 132
Определение роли стромальных клеток в возникновении описанных изменений в ДККМ ФНО-/- 134
Продолжительность кроветворения в ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ 134
Изменение экспрессии CD45 и Sca-І на поверхности клеток СФ из ДККМ ФНО-/-на подслое ДТ 135
Анализ изменения частот кроветворных клеток-предшественников различной степени дифференцировки в ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ 135
Анализ изменения частоты КОЕ-ГМ в ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ. 135
Анализ изменения частоты КОЕ-С в ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ.,.136
4.3.3.3 Анализ изменения частоты КООБ-7 и КООБ-28 в ДККМ ФНО-/- на
подслое ДТ 137
Анализ генотипа подслоя ДККМ ФНО-/-, изначально образованной на подслое ДТ, после продолжительного культивирования 139
Экспрессия некоторых генов клетками СФ ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ после продолжительного культивирования 139
Характеристики неприкрепленных стромальных клеток, появляющихся в СФ ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ после продолжительного культивирования 141
Способность неприкрепленных стромальных клеток из СФ ДККМ ФНО-/- на подслое ДТ к самоподдержанию 141
Получение прикрепленных стромальных клеточных линий 142
Экспрессия некоторых генов клетками полученных стромальных линий. 142
Сравнение экспрессии генов в стромальных линиях и в СФ культур в момент получения линий 144
5 Обсуждение результатов 145
Заключение...,, 153
Выводы 153
Печатные работы 155
Список использованной литературы 157
6 Основные использованные обозначения и сокращения
БОЕэ - бурст образующая единица, эритроидная;
Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор;
ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор;
ДККМ - длительная культура костного мозга;
ДР - денатурирующий раствор;
ДР-СКК - стволовая кроветворная клетка, способная длительно репопулировать облученное животное;
ДТ - дикий тип;
Ил - интерлейкин;
КИДК - клетки, инициирующие длительную культуру;
КМ - костный мозг;
КР-СКК - стволовая кроветворная клетка, способная коротко репопулировать облученное животное;
КОЕбаз - колониеобразующая единица, базофильная;
КОЕбл - колониеобразующая единица, бластная;
КОЕ-ВПП - колониеобразующая единица с высоким пролиферативным
потенциалом;
КОЕ-Г - колониеобразующая единица, гранулоцитарная;
КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица, гранулоцитарно-макрофагальная;
КОЕ-ГЭММ - колониеобразующая единица, гранулоцитарная, эритроидная, макрофагальная, мекакариоцитарная;
КОЕ-М - колониеобразующая единица, макрофагальная;
КОЕмгкц - колониеобразующая единица, мегакариоцитарная;
КОЕ-К - колониеобразующая единица в культуре;
КОЕ-С - колониеобразующая единица в селезёнке;
КОЕэ - колониеобразующая единица, эритроидная;
7 КОЕэоз - колониеобразующая единица, эозинофильная;
КООБ - клетки, образующие область булыжника;
КРКМ - клетки, репопулирующие костный мозг;
ЛИФ - лейкемия-ингибирующий фактор;
ЛПС - липополисахарид;
ЛС - лошадиная сыворотка;
ЛТ - лимфотоксин;
МВБ 1а - макрофагальный воспалительный белок 1а;
М-КСФ - макрофагальный колониестимулирующий фактор;
МСК - мезенхимальная стволовая клетка;
ОЛП - общий лимфоидный предшественник;
ОМП - общий миелоидный предшественник;
пСКК - примитивные стволовые кроветворные клетки;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
СКК - стволовые кроветворные клетки;
СФ - суспензионная фракция;
ТРФ- р - трансформирующий ростовой фактор-Р;
ФБ - фосфатный буфер;
ФНО - фактор некроза опухоли;
ФНО-/- мыши-мыши, дефицитные по ФНО;
ФНО-Р - рецептор к фактору некроза опухоли;
ФСК - фактор роста стволовых клеток;
ЭСК - эмбриональные стволовые клетки;
ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка;
ЭФ - эмбриональные фибробласты.
Введение к работе
1 Актуальность проблемы.
Регуляции в кроветворной системе осуществляются системой ростовых факторов и цитокинов, каждый из которых, как правило, способен стимулировать к пролиферации или апоптозу несколько различных типов предшественников. Некоторые цитокины способны действовать и на зрелые клетки, ингибируя или стимулируя в них апоптоз.
Одним из таких многофункциональных факторов, влияющих на кроветворные клетки различной степени зрелости, является фактор некроза опухоли (ФНО). В зависимости от степени зрелости клеточной популяции и состава других участвующих цитокинов он способен как ингибировать, так и стимулировать пролиферацию. Напрямую ФНО воздействует на зрелые клетки-предшественники в костном мозге только как ингибитор, а его стимуляторные эффекты, как правило, непрямые, и реализуются через индукцию продукции других цитокинов. ФНО является мощным регулятором их образования, а также может модулировать экспрессию поверхностных рецепторов к многочисленным цитокинам. Наиболее известна роль ФНО как индуктора программируемой клеточной гибели, однако, как и в случае регуляции пролиферации, участие ФНО в индукции апоптоза зависит от присутствующих цитокинов. Имеются данные о влиянии ФНО на дифференцировку стромальных клеток костного мозга.
Для того чтобы исследовать множественные функции ФНО, несколькими группами исследователей были получены мыши, дефицитные либо по генам его рецепторов, либо собственно по гену фактора некроза опухоли. Мыши, нокаутные по гену ФНО (ФНО-/-), развиваются нормально. Основные показатели периферической крови таких мышей также не изменены, что, видимо, свидетельствует об отсутствии нарушений в развитии кроветворной системы. Однако были отмечены существенные нарушения в развитии нормальной стромы селезенки, образования и созревания В-клеток, и, в целом, разнообразные нарушения иммунного ответа. Также были получены свидетельства того, что у мышей, нокаутных по ФНО, нарушены взаимодействия кроветворных клеток со своим микроокружением. Кроме того, известно, что в длительной культуре костного мозга мышей ФНО-/- наблюдается повышение суммарной клеточной продукции, а также количества КОЕ-ГМ. Исследование кроветворной системы дефицитных по ФНО мышей может прояснить роль этого многофункционального цитокина в гемопоэзе. Однако
9 большинство имеющихся в настоящее время данных было получено in vivo, где, как известно, существует значительная избыточность и взаимозаменяемость цитокинов. Т.о., нельзя исключить вероятность того, что функции отсутствующего изначально ФНО взяли на себя какие-то другие факторы.
В связи с этим необходимо изучение изменений в кроветворной системе мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли, методами, позволяющими снять воздействия других цитокинов. Удобной моделью для этого представляется длительная культура костного мозга.
2 Цель работы.
Целью настоящей работы было изучение роли фактора некроза опухоли в кроветворной системе на модели мышей, дефицитных по этому гену, методами in vitro. В этих условиях сильно снижено количество различных факторов роста и цитокинов, что дает возможность заметить изменения в кроветворении, вызванные отсутствием ФНО. Таким образом, эта модель открывает новые возможности для выявления роли ФНО в регуляции кроветворения. Данная работа является продолжением исследований, ведущихся в лаборатории физиологии кроветворения ГНЦ РАМН на протяжении последних лет.
3 Основные задачи.
Сравнить основные характеристики кроветворения в длительных культурах костного мозга мышей дикого типа и дефицитных по ФНО.
Изучить возрастные изменения кроветворения и роль ФНО в этом процессе.
Проанализировать влияние ФНО на стромальные клетки.
Попытаться получить стромальные клеточные линии от дефицитных по ФНО животных для модельных экспериментов по выявлению роли этого цитокина в формировании кроветворного микроокружения.
4 Научная новизна и практическое значение работы.
Было обнаружено, что продолжительное поддержание кроветворения в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли, сопровождается повышением количества кроветворных предшественников всех
исследованных уровней дифференцировки, уровня их пролиферации и апоптоза. Кроме того, ФИО участвует в регуляции пролиферативного потенциала стромальных клеток-предшественников. Показано, что наблюдаемые в длительной культуре изменения не являются следствием опухолевой трансформации. Полученные в работе данные выявили важную роль ФИО в регуляции кроветворения. Этот цитокин модулирует количество стволовых кроветворных клеток, участвует во взаимодействии кроветворных клеток со стромальным микроокружением и важен для развития и поддержания стромы кроветворных органов. Более детальное выяснение функции ФНО позволит более полно охарактеризовать систему регуляции процессов кроветворения.
5 Материалы и методы исследования.
Получение длительных культур костного мозга, прикрепленных клеточных линий, их клонирование и функциональные тесты проводились стандартными методами культивирования.
Состав клеток-предшественников и дифференцированных кроветворных клеток анализировали методом непрямой флуоресценции с использованием моно- и поликлональных антител к специфическим для каждой стадии дифференцировки маркерам. Функциональное состояние клеток-предшественников оценивали в различных клональных тестах, таких, как подсчет КОЕ-С(12) в сублеталыю облученных мышах-реципиентах, подсчет КОЕ-ГМ в полужидкой среде, подсчет клеток, образующих области булыжника, с использованием метода Пломахера.
Интенсивность пролиферации клеток-предшественников оценивали по доле клеток, чувствительных к воздействию цитостатиков. Уровень апоптоза в длительных культурах определяли с использованием низких концентраций флуоресцентного красителя (DAPI), способного связываться с конденсированным хроматином апоптотических клеток.
Принадлежность к той или иной линии дифференцировки кроветворных клеток В длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по ФНО, определяли по данным иммунофлуоресцентного анализа и по мазкам, приготовленным и обработанным стандартным образом.
В ходе экспериментов по проверке возможности возникновения в культуре неопластической трансформации теломеразную активность и кариотип определяли согласно стандартным методикам.
Экспрессию интересующих генов определяли методом обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).
6 Основные положения, выносимые на защиту.
Экспрессия фактора некроза опухоли кроветворными клетками приводит к ограничению их пролиферативного потенциала.
Экспрессия фактора некроза опухоли стромальными клетками способствует выживанию кроветворных клеток-предшественников с высоким пролиферативным потенциалом.
ФНО играет существенную роль в предотвращении возникновения возрастных изменений кроветворной системы.
Фактор некроза опухоли оказывает ингибирующее действие на способность стволовых стромальных клеток к пролиферации.
7 Содержание работы по главам.
Оглавление;
Основные обозначения и сокращения;
Введение;
