Введение к работе
Актуальность.
В последнее время атерогенез рассматривается многими исследователями как аутоиммунный процесс, важнейшую патогенетическую роль в котором играют иммунные комплексы (ИК), содержащие липспротеины (ЛП). Вовлечение в процесс провоспалительных цитокинов способствует развитию в артериальной стенке событий, характерных для воспаления. Одним из таких провоспалительных цитокинов является туморнекротизирующий фактор(ТНФ)-а, который в виде диффузных и гранулярных депозитов постоянно обнаруживается в пораженных атеросклерозом участках стенки сосудов. Не вызывают сомнения причастность ТНФ-а к рекрутированию клеток в места атеросклеротических поражений и к индукции секреции других провоспалительных цитокинов, его вмешательство в гемостаз и в метаболизм липидов и углеводов. Однако, много неясного остается в вопросе о клетках-продуцентах ТНФ-а и факторах, контролирующих его продукцию в очагах атерогенеза.
На ранних стадиях атерогенеза в события, разворачивающиеся в просвете и стенке сосуда, вовлекаются моноциты/макрофаги и эндотелиальные клетки (ЭК). II те, и другие клетки имеют рецепторы к ТНФ-а. Моноциты/макрофаги считаются наиболее активными его продуцентами. Однако, закономерности продукции ТНФ-а в микроокружении в стенке сосудов не изучены. Весьма актуальной остается задача сравнительного изучения интенсивности продукции ТНФ-а разными по степени зрелости мононуклеарными фагоцитами. В связи с тем, что моноцит крови претерпевает существенные функциональные изменения в процессах адгезии к эндотелию, трансэндотелиальной миграции, дифференцировки в макрофаги и трансформации в пенистые клетки, первостепенное значение приобретает вопрос о том, как меняется способность к продукции ТНФ-а у клеток моноцитарного ряда в ходе дифференцировки.
Литературные сведения об участии отдельных атерогенных компонентов сыворотки крови в индукции синтеза цитокинов крайне противоречивы. В связи с этим не утратила актуальности задача сравнительного изучения способности нативных, окисленных (ок) ЛП низкой плотности (ЛПНП) и содержащих ЛП ИК индуцировать продукцию ТНФ-а разными клетками-участниками атерогенеза.
Очевидно, что продукция цитокинов в очагах атерогенеза происходит в условиях сложных межклеточных взаимодействий, в том числе, взаимодействия
моноцитов/макрофагов с ЭК. Кокультивирование этих клеток для моделирования такого взаимодействия представляется достаточно актуальной задачей. Изучение выработки ТНФ-а, индуцированной атерогенными компонентами сыворотки крови, с использованием кокультуры эндотелиальных и моноцитарных клеток позволяет с большей достоверностью судить о протекающих in vivo процессах.
Цель исследования.
Изучить способность клеток моноцитарных линий разной степени зрелости и эндотелиальных клеток продуцировать туморнекротизирующий фактор-а в ответ на действие атерогенных компонентов сыворотки крови.
Задачи исследования:
-
разработать оптимальные экспериментальные условия индукции секреции ТНФ-а клетками перевиваемых моноцитарных линий P388Di, ТНР-1, U937 и HL-60 и ЭК при использовании в качестве индуктора форболмиристатацетата (ФМА);
-
используя разработанные экспериментальные модели, изучить способность клеток перевиваемых моноцитарных линий разной степени зрелости и ЭК продуцировать ТНФ-а в ответ на действие атерогенных компонентов сыворотки крови;
-
провести сравнительное изучение способности клеток разных перевиваемых моноцитарных линий продуцировать ТНФ-а до и после индукции их дифференцировки форболмиристатацетатом;
-
провести сравнительное изучение способности различных атерогенных компонентов сыворотки крови вызывать продукцию ТНФ-а у клеток разных перевиваемых моноцитарных линий до и после индукции их дифференцировки форболмиристатацетатом;
-
разработать оптимальные экспериментальные условия кокультивирования ЭК с перевиваемыми клетками одной из моноцитарных линий;
-
используя разработанную экспериментальную модельную систему, изучить продукцию ТНФ-а в кокультуре ЭК и клеток перевиваемой моноцитарной линии в ответ на действие атерогенных компонентов сыворотки крови.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Способность продуцировать ТНФ-а в ответ на действие ФМА в разной степени выражена у клеток разных перевиваемых моноцитарных линий: в наибольшей степени - у клеток линий ТНР-1, P388Di и HL-60, в наименьшей - у клеток линии U937.
-
Искусственные растворимые ИК, содержащие ЛПНП, в отличие от свободных ЛПНП, индуцируют продукцию ТНФ-а клетками перевиваемых
моноцитарных линий: на ИК, содержащие нативные ЛПНП, отвечают продукцией ТНФ-а клетки линий P388D,, ТНР-1 и HL-60, а на ИК, содержащие окЛПНП, -клетки линии HL-60.
-
В коде дифференцировки повышается способность исходно низкодиффе-ренцированных клеток перевиваемых моноцитарных линий продуцировать ТНФ-а в ответ на действие свободных нативных и окисленных ЛПНП и содержащих их ИК.
-
В условиях кокультивирования ЭК и клеток линии HL-60 ТНФ-а обнаруживается в инкубационной среде после воздействия нативными ЛПНП, но не содержащими их ИК.
Научная новизна работы.
Впервые проведено сравнительное изучение искусственных ИК, содержащих нативные или окисленные ЛПНП, в качестве индукторов секреции ТНФ-а клетками перевиваемых моноцитарных линий.
Впервые проверена способность первичной культуры ЭК продуцировать ТНФ-а в ответ на действие широкого спектра агентов, в том числе атерогенных компонентов сыворотки крови.
Впервые выявлены изменения способности клеток моноцитарных линий разной степени зрелости после индукции их дифференцировки форболмиристатацетатом реагировать продукцией ТНФ-а на действие атерогенных компонентов сыворотки крови.
Разработана экспериментальная модельная система, позволяющая оценить продукцию ТНФ-а в кокультуре ЭК и клеток моноцитарной линии в ответ на действие атерогенных компонентов сыворотки крови и вклад отдельных типов клеток в этот ответ.
Впервые получены экспериментальные доказательства различного реагирования на действие атерогенных факторов клеток моноцитарного ряда, в зависимости от их степени дифференцировки и микроокружения.
Теоретическое и практическое значение результатов исследования.
Результаты предпринятых исследований позволяют уточнить роль мононуклеарных фагоцитов, ЭК и их взаимодействия в продукции ТНФ-а в ответ на действие различных атерогенных компонентов сыворотки крови. Экспериментальные данные о способности содержащих ЛП ИК индуцировать продукцию ТНФ-а мононуклеарными фагоцитами свидетельствуют в пользу ранее постулированной аутоиммунной теории атерогенеза.
Выявленные характеристики способности клеток разных моноцитарных линий продуцировать ТНФ-а в ответ на действие стандартного для них индуктора ФМА и атерогенных компонентов сыворотки крови могут быть использованы для пополнения банка данных, касающихся перевиваемых линий P388Di, ТНР-1, U937 и HL-60.
Оптимизация статистической обработки результатов биологического тестирования ТНФ-а может быть использована в аналогичных исследованиях для повышения надежности количественной оценки ТНФ-а.
Разработанные варианты кокультивирования ЭК и мононуклеарных фагоцитов могут быть использованы при изучении продукции разных цитокинов под действием атерогенных и антиатерогенных факторов, в том числе, лечебных препаратов. Замена перевиваемой клеточной линии на первичную культуру человеческих моноцитов позволит применить эту модельную систему при углубленном обследовании больных атеросклерозом.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены в НИИЭМ РАМН (1993, 1995 годы), на заседании Санкт-Петербургского общества иммунологов (1994 год), на симпозиуме "Липопротеиды и атеросклероз", посвященном 110-летию со дня рождения акад. Н.Н.Аничкова (Санкт-Петербург, 1995 год).
Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии НИИЭМ РАМН 11 ноября 1996 года.
Объем и структура диссертации.
Работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты исследований", "Обсуждение" и выводов. Объем работы составляет 137 страниц машинописного текста, включая 21 таблицу и 8 рисунков, 4 из которых представляют собой фотографии. Список литературы состоит из 240 наименований, из них 31 работа принадлежит отечественным авторам и 209 - зарубежным.
