Введение к работе
Актуальность темы. В органах гемо- и лкмфопозза кроветворные гооябоидкые клетки подвергаются локальным регулирующим воздейст-&\: со стороны отромальной ткани этих органов, создающей на их ррптории гелопоэтическое и иммунологическое микроокрукение, обе-вчиврящее регулируемую пролиферации я дифференцировку'г&\-хпоэ-теских и иммунсксшзтеитных клеток-предшественников /йридєшь-їя А.Я., Лурия Е.А., I960/. Актуальность изучения проблема мик-экрукачия определяется тем, что эта проблема рассматривает ме-шзмы, обеспечивающие споссбкссть стволовых гемоиеэтическнх кле-ї поддерживать з организме процессы кроветворения и иммунитета, действуя на клетки, ответственные за микроокрукение, нішо, в іущеи, дебиїься направленного влияния на ход и интенсивность zk-ишх процессов, а также па гемопоэз, в частности, при его реге->ации после облучения.
При индукции иммунного ответа и под действием цачого ряда фа-!ров, выводящих кроветворную и лимФоидную ткань из состояния ра-ійєсия /например, после значительной кровопотери или облучения/, юисходяг закономерные изменения содержания в ней кроветворных ток-предшественников. Возникает зопрос, как ведут себя в таких уациях стрсмалькые клетки-предшественники и насколько взакмо-занно протекает регенерация тех и других категорий клеток.
К настоящему времени получено много данных о действии строганых клеток на кроветворные и лимфоидные клетки. Вопрос не о , как регулкруегся сама стромальная ткань, в частности, вопрос озмскннх воздґ-"ствиях яроветьорньгс и лимфеидных клеток и проду-усмих ими активных факторов на клетки стрела гораздо менее изу-. Мсзду тем, уже сегодня существуют все есноьзіжя полагать, что акизация и подцеркание микроокру'ения - это процессы, требующие іеративі-шх взаимодействуй строгальных и кроветворных ;слеток. зстно, например, что физиологическая перестройка костной ткани, 5ходимая для ез нормального фушецкенирования и постоянно иду-в здоровом организме, незозногла без учпетпя потомков крезет-іьк клзток остеокластов /іі&ХЬчз-л с. et-ai..iS77/ При этем, ак-тсть остеокластов может, ло-видкмоілу, регулирогітЬсд фаїлора-щцелдемыми актиБнроЕаннкми лнуфоцита^і к макрофагами /факго-
_4 -
ра\м некроза опухолей»* up и интерлейкиноы I/ /?ertolini D*R. et.al, '1906/.
Делъ канной работы состояла в неучений поведения стромаль-ной ткани в условиях, выводящих кроветворную и лкмфоидную' систему кз равновесия, а тайке в изучении регуляторних влияний на стромалькые клоногенше клетки как кроветворных и лимфоидкых юієток, так ь факторов, вырабатываемых этими клеткатда при их ак-' тивации.
О количестве стромальных клеток-предшественников в кровет-воршх и лимфоидных органах судили по содержанию стромальных кло-ногечных клеток /KDK-S/, образующих колоник-клояп фибробластов при эксплантации в монослойные культуры суспензий клеток, приготовленных из этих органов. Основные задачи работы:
-
Выяснить динамику регенерации стромальных клеток-предаествен-нихов костного мозга мышей после тотального облучения нивотных 1,5 Gy,
-
Выяснить динамику регенерации стромальных клеток-предшественников костного мозга мшіей после зведення кизотным циклофосфеїш-да.
3., Выяснить динамику изменения численности стремальны;: клопогонных клеток в лимфатических узлах морских свинок после однократного и повторного введения антигенов ЙІ виео.
-
Определить, к&к влияю? клетки кроветворных и лимфоидньгс органов на эффективность клонирования стромальных клеток-предазствен-ников в мснослойнкх культурах кос-гного козга и рост six культу-ральных потомков у расіак зкдое я-ивотньк /морских свинок и г$о-лихоз/, .-.
-
Определить, как влияет присутствие тромбоцитов крови на эффективность стромальных клєтск-*шєдшєстеєншікое ;j рост их культу-ральких потомков в коьоелс&шх культурах.
-
Определить, как злиязт присутствие митогеноз на оффектигаооть клонирована с;іромальншс клетокчіредшествснникоа з конэслойньс: культурах костного шзга и селезенки.
-
Еиясни-?ь влияний некоторых ростовых факторов, продуцируемых акт?вироганнььы макрофаткл-. /и^терлейгачн I, феляср ьекреза слу-
..5-
тлейы / и люіфоциташ» /интерлєйкин 3/ на объективность хлони-ЗОВ5Н5ІЯ костномозговых стромальных клеток-предиестзенкиков и их лультуральккх потомков ин витро.
Научиаг новкзна. В работе впервые было изучено образование '.к витро колонки стромальных фибробластов клоногонкимн стромаль-іьіми клетками кроветворных и лимфсидных органов под влиянием рл-щ воздействий, говорящих из равновесия кровотворную и лимфоид-ty» систему /тотальное облегчение 1,5 Gy, введение циклофоссгамида, ммуннкй ответ после однократного и повторного введения актиге-ов, присутствие t/итогенов ик витре/, а такне стригальное колони-образов&ние под действием клеток кроветворных и лимфоидкых ор-аноз и ряда факторов, продуцируемых активированными лимфоцитами макрофагами. Вп&рвые выявлена кинетика изменения численности громалькых члеток-предщестзешикоз /КОК-5/ костного мозга после э'лучекия животных 1,5 Gy и покасано, что несмотря на гистогене-лческую обособленность этих клеток от строловюс кроветворных теток /ФридештеЯн А.Я., НуралесоЕа А.И., 1971/, численность н эх, и других меняется после облучения сходным образом. Изучена шамика регенерации костномозговых стрсмальных клоногенкых кле-)к после введения животным циклофесфамида; показано, что она гадка с динамикой регенерации КОК-5 после облучения 1,5 Gy, од-iKo, циклофосфамид в дозе 200 мг на кг обладает по отношению KDK-i более щадящим действием, чем низкие дозы облучения. :ервые показано, что численность КОК-Ф в лимфатических узлах мор-их свинок к в селезенках мьией в десятій раз увеличивается по-9 однократного введения антигаюв, после поьгорнего введеш: \. ткгенов число KQK-4 возрастает в еще большей степени. Впервые казано, что костномозгёшо клетки и клетки кроветворных и лим-адных органов могут оказывать двоякое воздействие на клоногек-2 строгальные клетки в зависимости от видовой принадлежности зледких. А именно f все испытанные популяции лимфоиднкх и эветаорных клеток морских свинок и кроликов, а также лейкоци-периферической крови кроликов с увеличением клеточной пло->сти подавляют образование колоний фябробластов клоногенными зомальнши клетками костного мозга кроли.чог. 3 ?о з<- _ре\<я, ш-іилось. что на кчонсгенныэ строгальные клетки костного мозга
- б -
морских свинок костномозговые клетки и клетки селезенки морских- свинок действуют стимулирующим образом, тогда как клетки селезенки кроликов, лимфатических узлов и тимуса морских свинок действуют подавляюще, а клетки костного мозга кроликов не меняют величину эффективности клонирования /ЭКЮ-Ф/ этих животных. Показано, что тромбоциты, выделенные из крови кроликов, стимулируют образование колоний как первично выделенными КОК-5, так и рост их культуральных потомков. Однако, добавление костномозговых клеток кролика совместно с тромбоцитами снимает ростстимулируюп;ее действие последних на стромальные клетки кролика. В сумме эти результаты свидетельствуют о том, что популяции костномозговых и лимфоидных клеток морских' свинок и кроликов содержат не только стимулирующие клетки /о чем было известно ранее /Щриденштейн А.Я., 1990/, но и клетки, ин-гибирущие пролиферацию стромальных клоногенных клеток и что чувствительность к ростстимулирующим и ростингибирующим воздействиям у клоногенных стромальных клеток разной видовой принадлежности неодинакова. Выяснилось, что действие облученных костномозговых клеток на размножение клеток пассажных штаммов костномозговых фибробластов морских свинок зависит от состоя-. ния штамма в момент пассирования - если большинство клеток находится в состоянии покоя, то есть выведено из пролифератинно-го цикла, то добавление облученных костномозговых клеток оказывает выраженное стимулирующее влияние на пролиферация пассированных костномозговых фибробластов, если же клетки штамма находятся в состоянии пролиферации, добавление облученных костномозговых клеток либо не оказывает влияния, либо ингабирует рост костномозговых фибробластов. Впервые показано, что для осуществления ингибиции роста КОК-Ф колоний в костномозговых культурах кроликов клетками кроветворных и лимфоидных органов в культуральной среде необходимо присутствие эмбриональной телячьей сыворотки /дІС/. Наличие в культурах наряду с ЗТС как аутологичеокой для рвагкруюі^их клеток сыворотки /сыворотка кроликов/ так и сывороток ряда взрослых животных других видов /сыворотки мышей, крыс/, резко снижает проявление эффекта ингибиции. Показано, что значительная часть /3/4/ ингибирущей активности обусловлена растворимым фактором /факторами/, про-
здящими через миллипорный фильтр. Установлено, ЧТО ИПГИ-фующке рост КОК-5 клетки адгезивны, радиорезистентны и <еют маркер макрофагов F4/80. Т-клетки, по-зидимому, не жнимают существенного участия в изучаемом эффекте, [ерзые показано, что присутствие штогєнов б культурах кле-ж селезенки или кондиционированной среды от таких куль-р в культурах селезенки и костного мозга резко подавляет июшеобразованио. При этом, выяснилось, что в основе этого давления лежит обратимый блок пролиферации стрс-уальных кло-генных :слеток, Клетки, ответственные за появление в кенди-онировгнной среде от стимулированных митогенэми лимфоцитов лезенки активности, инги&груящей рост КОК-Ф. редиочувстзи-лыш и имеют фенотип Thy-1+, Вперше изучено действие ряда кторов, продуцируемых активированными макрофагами и лимфо-гами /фактора некроза опухолей^ , иктерлеШа'ла I и интер-Зкина 3/ на колониеобраэовачяе как первично выделенными t-Ф, так и на рост их кулътуралышх потомков. Выяснилось, э указанные факторы в зависимости от их концентраций в куль-. зальной среде могут как стимулировать, так и ингибировать :т стрсмалышх клеток в культурах. Показано, что характер іствия ТН5-ос и ИД—I на пассатные стромальнко фибробласты не іичаєтся от действия этих факторов на рост КОК-5 колоний в [ьтурах первишо океллантирозанных костномозговых клеток, из о следует, что действие 1КЗ-с< к ИЛ-І, по-видимому, каправ-о прямо на стромальные клетки и ке опосредовано другими точными категориями. Напротив - для успешного действия ИЛ-3 рост КОК-Ф з культурах необходимо присутствие кроветворных ток.
Научная ценность полученных данных.» Полученные данные до-изают возможность регулировки стрсмальной ткани со стороны ветворпых и лдафоидкнх клеток и факторов, вырабатываемых-при активации, что открывает новое направление в изучении меха-.'.оп строгального микроокрукекпя. 3 ходе разработки этого на-влелия ногу? быть определена дояслкисельные пути воздействия ;трому, созданщ/в гемопозткческое и иымуколошчес:. -з микроок-гчііе, с целью достижения иапраглсаной регуляции процессов ге-зоза и иммунитета. Практическая ценность пплучр-нных данных связана с тем, что
уже целый ряд факторов, вырабатываемых активированными макрофагами и лимфоцитами, в настоящее время находит все более широкое применение в клинике при лечении различных патологий. В свети с этим, необходимо учитывать, как оти факторы действуют на такую функционально ваянуа клеточную категорию, как стрсмальная ткані С другой стороны, данные о ростсткмулируїощих и ростингибирую-щих эффектах кроветворных и лимфоидкых клеток могут, з дальнейшем, оказаться полезными при разработке препаратов, способных при соответствующих патологиях вызывать как усиленную пролиферг цию гтрсмальных клеток /например, при костях переломах/, так и ингибицию их пролиферации /например, при миелофиброзах/.
Полученные даїшьіе позволяют такке усовершенствовать метод клонирования стромальных клеток-предшественников, используемый настоящее время как в научных исследованиях, так и в клинике дл определения численности этих клеток по эффективности образовали стромальных колоний и создают предпосылки для правильной интерпретации его результатов.
Предложенные нами методические подходы используются в Центральном институте травматологии к ортопедии ЫЗ России /Иосква/ и Центральном научно-исследовательском институте детской гемато логии МЗ России /Москва/. Экспериментальные дачные и теоретичес кие положения диссертационной работы использованы в монографии "Клеточные основы ігаоветворного микроокрукения" /А.Я. Фриденште Е.А. Лурия, IS60/ и лекционных курсах по иммунсморфологии ка биологическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова.
Диссертационная работа выполнена согласно темам основного плана научно-исследовательской работы ШИ2М им. Н.Ф. Гзмалеи РАМН в рамках программы ГШТ 0.69.07 "Исследовать генетические к молекулярные механизмы нарушений иммунитета и наследственных болезней к разработать на этой основе методы и способы профилактика, диагностики и лечения".
Апробация работы. Диссертация апробирована ка объединенной научной конференции отдела иммунологии КИИЭМ км. К.Ф. Гамалеи РАЖ. Основные пояснения диссертационной работы доложены и обсуздены на международных к всесоюзных съездах, симпозиумах и конференциях, перече:;* которых приведен ь конце автореферата.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных табет.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа измена на 206 страницах машинописи и состоит из введения, об-іра литературы /6 глсг-/, раздела "материалы и ?ггтоды", собст-иных исследований /4 главы/, обсуждения результатов, выво-)В и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 33 Улицами и 17 графиками. Библиографический указатель включает & источников.
