Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Считается, что в среднем у одного ;з трех жителей Земли развиваются онкологические процессы, но только у ескольких человек из тысячи развиваются онкологические заболевания, ключающие около двухсот нозологических форм [Sikora К. et al., 1997]. На :астоящий момент наиболее признанной концепцией, объясняющей озникновение и развитие таких заболеваний, является теория [ногостадийного канцерогенеза. Согласно этой теории нормальная оматическая клетка, прежде чем стать полностью злокачественной и проявить ебя клинически, должна пройти как минимум две стадии развития - стадию ммортализации (инициации) и стадию трансформации (промоции) <\нисимов В. Н., 1990; TraverD. et а!., 1998].
На первой стадии развития рака канцероген, взаимодействуя с ДНК /или ДНК-тропными белками, вызывает такие мутационные изменения в гноме нормальной клетки, которые определяют ее переход в редрасположенное к трансформации предраковое состояние (состояние атентной или иммортализованной клетки) [Baker S. J. et al., 1997; Bowen I. D. t al., 1998; Klangby U. et al., 1998]. По мнению большинства исследователей, альнейшая опухолевая прогрессия (переход на стадию трансформации и далее к стадии метастазирования) возможна благодаря клональной микроэволюции пухолевой ткани [Frank L. М. et al., 1997]. Ключевыми событиями этого роцесса являются формирование гетерогенной популяции опухолевых клеток отбор со стороны различных факторов микроокружения таких мутантных понов раковых клеток, которые имеют селективные преимущества в условиях анного организма. Предполагается, что среди множества факторов отбора ггухолевых клеток in vivo одну из главных ролей играют цитотоксические ймфоциты и противоопухолевые антитела [Jager Е. et al., 1996; Engel А. М. et :., 1997]. Однако прямых и неопровержимых доказательств участия иммунной 4стемы в клональной микроэволюции опухолевой ткани нет. Остаются слабо зученными и возможные механизмы иммунной селекции опухолевых клеток, также вклад этого фактора отбора в конечный результат злокачественной эансформации.
Один из возможных механизмов иммунной селекции - отбор йтотоксическими лимфоцитами или опухоль-специфическими антителами тонов клеток, лишенных экспрессии иммунногенных опухоль-хоциированных антигенов (ОАА) [Trivedi P. et al., 1994]. Другой механизм -глекция таких клонов, которые лишены экспрессии молекул межклеточной ггезии или молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС), ействительно, клинические исследования последних лет указывают на то, что
2.
в большинстве '. случаев прогрессия , онкологического заболевание сопровождается нарушением экспрессии клеточных адгезионных молекул т опухолевых клетках [Csanaky G. et al, 1997; Domingo A, et al., 1997]. Причем і некоторых случаях изменение экспрессии этих молекул служит прогностическим маркёром течения заболевания [Domingo A. et al., 1997: Mielcarek М. et al, 1997]. Параллельно с изменением экспрессии молекуі адгезии на опухолевых клетках прогрессия заболевания может сопровождать^ изменением уровня растворимых форм адгезионных молекул в сыворож периферической крови больных, что также служит прогностическим маркеров* [Molica S. et al., 1997; Grothey A. et al., 1998]. Вызваны ли эти измененш экспрессии мембранных и растворимых форм молекул межклеточной адгезш иммунной селекцией или же другими причинами, не известно. Аналогична; ситуация сложилась и вокруг молекул главного комплекс; гистосовместимости, нарушение экспрессии которых отмечено при различны; нозологических формах рака [Klein В. et al., 1995; Vora A. R. et al., 1997].
Задача усложняется еще и тем, что устойчивость опухолевых клеток ] цитотоксическим лимфоцитам может развиваться не только в результаті иммунной селекции, но и под влиянием других факторов микроокружения например, лекарственных препаратов [Hirose М et al., 1999]. Влияние цитостатиков на ' чувствительность трансформированных клеток і эффекторным механизмам иммунной системы слабо изучено, а имеющиес: данные противоречивы и не позволяют разработать единой концепции. Знани же механизмов и закономерностей такого влияния позволило бі оптимизировать протоколы химио- и иммунотерапии онкологически: заболеваний и повысить их эффективность.
Связь работы с крупными научными программами, темам» Научно-исследовательская работа по теме диссертации проведена в рамка НИР "Изменение экспрессии молекул межклеточного взаимодействия ка механизм устойчивости опухолевых клеток к цитотоксическому действш лимфоцитов человека", выполняемой по заданию Белорусског республиканского фонда фундаментальных исследований (договор Ш Б99-09 от 1 апреля 2000 г., номер госрегистрации №20003045) в период с 01.04.2000 j по 15.03.2002 г.
Цель исследования. Установить механизм формирования устойчивост опухолевых клеток' В-лймфобластной линии 1М-9 к цитотоксическом действию аллогенных лимфокин-активированных киллерных (ЛАК) клетс человека в процессе их иммунной и лекарственной селекции in vitro.
Задачи исследования.
1. Разработать- метод иммунной (опосредованной ЛАК клеткамі селекции in vitro клеток линии IM-9 и получить сублинию опухолевых клето
стойчивых к цитотоксическому действию лимфокин-активированных иллерных клеток.
2. Изучить механизм устойчивости ЛАК-селектированной ЛАК-
езистентной сублинии.опухолевых клеток IM-9 к цитотоксическому действию
имфокин-активированных киллерных клеток. .::
-
Изучить модулирующий эффект цитостатика: этопозида (VP-16) на увствительность опухолевых клеток линии ІМ-9 к цитотоксическому ействшо ЛАК клеток при его кратковременном и длительном воздействии на летки-мишени.
-
Изучить механизм устойчивости этопозид-селектированной ЛАК-езистентной сублинии опухолевых клеток ІМ-9 к цитотоксическому действию имфокин-активированных киллерных клеток.
-
Оценить роль ключевых молекул межклеточной адгезии в механизме АК-опосредованного киллинга опухолевых клеток линии ІМ-9.
Объект исследования. Опухолевые клетки В-лимфобластной линии v4-9, опухолевые клетки линии Raji лимфомы Беркнита, лейкозные клетки инии К562 бластного криза хронического миеловдного лейкоза и клетки оноцитарной линии U937 человека.
Предмет исследования. Механизм формирования устойчивости пухолевых клеток линии IM-9 к цитотоксическому действию аялогенных имфокин-активированных киллерных . клеток человека в процессе их ммунной и лекарственной селекции in vitro. .
Гипотеза. Иммунная и лекарственная селекция опухолевых клеток ожет приводить к развитию, их устойчивости к действию цитотоксических ямфоцитов. Вероятно, ключевую роль в этом процессе могут играть молекулы энтактного взаимодействия. .
Методология н методы проведенного исследования. В работе были
:пользованы методы иммунной и лекарственной селекции опухолевых клеток
vitro, цитотоксические и пролиферативные тесты, цитогенетический,
жьюгационный и иммунофенотипический анализ, а также методы
:атистической и математической обработки данных.
Научная новизна и значимость полученных результатов.
-
Впервые проведена иммунная селекция опухолевых клеток МНС-;рестрицированньши цитотоксическими лимфоцитами. Установлено, что «імунная селекция приводит к снижению клональной гетерогенности эпуляции трансформированных клеток и их чувствительности к ттотоксическому действию клеток-эффекторов.
-
Впервые, показано, что формирование устойчивости опухолевых іеток к ЛАК клеткам в процессе их иммунной селекции ассоциировано с эвышением экспрессии на трансформированных клетках молекул
4 CD1 la/CD 18 (LFA-1) и CD1 lc/CD18 (gp 150/95). Конъюгационная способность опухолевых клеток, а также экспрессия на них поверхностных молекул CD21 и CD58 (LFA-3) при этом снижается.
3. Впервые установлено, что селекция опухолевых клеток на
устойчивость к этопозиду может индуцировать перекрестную резистентность
этих клеток к лимфокин-активированным киллерньш клеткам. Наблюдаемая
устойчивость опухолевых клеток к клеткам-эффекторам ассоциирована со
снижением экспрессии на трансформированных клетках молекул
межклеточной адгезии LFA-1 и молекул костимуляции CD86 (В7.2).
4. Получены данные, согласно которым молекулы адгезии
суперсемейства иммуноглобулинов LFA-3 и подсемейства р2-интегринов LFA-
1 в ЛАК-опосредованном киллинге опухолевых клеток выполняют разную
функцию: первые обеспечивают межклеточную адгезию, вторые -
костимуляцию клеток-эффекторов.
Практическая (экономическая, социальная) значимость полученных результатов. Полученные данные о возникновении перекрестной устойчивости опухолевых клеток к цитотоксическим лимфоцитам в процессе лекарственной селекции требуют внимания и отражения при использование протоколов лечения, включающих химко- и иммунотерапию онкологически} заболеваний. Использованная методическая база может быть полезна дл> характеристики устойчивости опухолевых клеток (первичной опухоли рецидива) к иммунным цитотоксическим клеткам больного на основі независимого анализа параметров клеточной цитотоксичности конъюгационной способности или экспрессии молекул межклеточной взаимодействия (включая молекулы адгезии). Кроме того, материаль диссертации могут быть использованы в учебно-педагогическом процессе і научной работе в ВУЗах медицинского и биологического профиля.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Иммунная (опосредованная лимфокин-активированными киллерньші
клетками) селекция in vitro опухолевых клеток линии IM-9 сопровождаете:
снижением их клональной гетерогенности и развитием устойчивости і
цитотоксическому действию ЛАК клеток. Устойчивость иммуно
селектированных опухолевых клеток линии IM-9 к лимфокин-активированньи
киллерньш клеткам обусловлена снижением их конъюгационной способности.
2. Кратковременная инкубация опухолевых клеток линии 1М-9
зпиподофилотоксином этопозидом повышает их чувствительность,
длительное воздействии этого цитостатика на популяцию клеток-мишене
индуцирует их устойчивость к цитотоксическому действию ЛАК клетої
Устойчивость этопозид-селектированных опухолевых клеток линии ІМ-9
лимфокин-активированным киллерньш клеткам ассоциирована со снижение:
5 экспрессии на клетках-мишенях молекул LFA-1 и В7.2. При этом конъюгационная способность этих клеток, а также экспрессия других поверхностных молекул контактного взаимодействия остаются без изменений.
3. В клеточной системе [ЛАК]/[1М-9] молекулы суперсемейства иммуноглобулинов: LFA-3, экспрессированные на опухолевых клетках, обеспечивают межклеточную адгезию, а молекулы подсемейства р2-интегринов LFA-1 выполняют функцию костимуляции клеток-эффекторов.
Личный вклад соискателя. Все исследования выполнены автором самостоятельно. В диссертации не были использованы результаты исследований соавторов совместных публикаций (за исключением специально отмеченных случаев).
Апробация результатов диссертации. Результаты исследований, включенные в диссертацию, докладывались на VIII международном симпозиуме "Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии" (г. Минск, 27-29 апреля 2000 т.), Четвертой научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000" (г. Санкт-Петербург, 23-25 мая 2000 г.), IV съезде Белорусского научного общества иммунологов и аллергологов (г. Гомель, 15-16 июня 2000 г.), 14-ом Европейском иммунологическом симпозиуме EFIS 2000 (г. Познань, 23-27 сентября 2000 г.) и Международной научно-практической конференции ''Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии" (г. Минск, 25-27 октября 2000 г.).
Опубликованность результатов. По теме диссертации имеется 10 публикаций. Из них статей в научных журналах - 3, статей в сборниках яаучных материалов - 2, тезисов докладов и выступлений на конференциях - 5. Эбщий объем опубликованного материала - 35 страниц.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 114 страницах машинописного текста и содержит 15 иллюстраций, 12 таблиц и 5 приложений. Список использованных литературных источников включает 286 ссылок (в том числе 15 - на русском, и 271 - на английском языках). Диссертация включает : общую характеристику работы, обзор литературы, описание материалов и методов, три главы собственных данных, главу, юсвященную обсуждению результатов, заключение, список использованных источников.и приложения.
